CN104388378A - 一种细胞可逆分选载体及其在细胞可逆分选中的应用和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种细胞可逆分选载体，所述载体包括特异性抗体、海藻酸钠和磁珠，所述海藻酸钠包裹所述磁珠，所述抗体通过生物素-亲和素系统与所述海藻酸钠链接，且所述抗体还链接有待分选细胞，结构简单，易于制备，本发明还公开了所述细胞分选载体在细胞分选中的应用和方法，能够解决常规的筛选后，磁珠始终链接在细胞上，或者磁珠脱离极其耗时且会有其他干扰的问题。

Description

一种细胞可逆分选载体及其在细胞可逆分选中的应用和方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是指一种细胞可逆分选载体，本发明还涉及一种细胞可逆分选载体在细胞分选中的应用和方法。

背景技术

不同的细胞表面会有不同的抗原，传统的细胞筛选技术就是用磁珠和对应的抗体连在一起，当特定的抗体和其对应的细胞表面的抗原结合的时候，就形成了细胞+抗体+磁珠复合体，然后用磁场就可以把细胞+抗体+磁珠复合体从各种细胞中筛选出来。

但是传统的技术，筛选出来的是一个细胞+抗体+磁珠复合体，虽然磁珠的粒径等都较小，但仍然会对细胞的生长、分化等产生一定的影响，从而造成对实验结果的影响，如果涉及到药物的输送与释放，也会产生一定的影响。

因此，为充分利用到磁珠的磁性对于筛选的优势，同时能够在筛选以后将磁珠分离，成为一个需要重视的问题，有一些文献中提到，基于磁珠的成分属性（主要成分是氧化铁和多聚糖），从而利用生物降解，达到消除磁珠的目的，这一方法在一定程度上行的通，但实际上这一过程耗时长，而且，需要生物降解，就必须要重新添加如新的酶或者菌株，这对于细胞培养等来说，又是新的污染，产生新的影响，因此实际的可行度并不高。

发明内容

本发明提出一种细胞可逆分选载体，能够充分利用磁珠的磁性对细胞进行筛选，完成后还能将磁珠进行脱离，消除磁珠对细胞培养等的影响。

本发明还提出了一种细胞可逆分选载体在细胞可逆分选中的应用和方法，简单易行，便于实验室的推广与使用。

本发明的技术方案是这样实现的：一种细胞可逆分选载体，所述载体包括特异性抗体、海藻酸钠和磁珠，所述海藻酸钠包裹所述磁珠，所述抗体通过生物素-亲和素系统与所述海藻酸钠链接，并且所述抗体还链接有待分选的细胞，从而形成了由“磁珠+海藻酸钠+抗体+细胞”的复合结构，另外，根据本技术领域的一般知识，根据实验设计等的需要，所述抗体也可以为二抗，也能实现到需要的效果。

进一步，所述抗体偶联biotin（生物素），所述海藻酸钠偶联SA（链霉亲和素），所述抗体与所述海藻酸钠通过所述biotin与所述SA之间的偶联实现链接。采用链霉亲和素SA和biotin作为中间的偶联因子，具有提高结合强度的效果。

生物素-亲和素是一种生物反应放大系统，其具有高度专一性，稳定性，灵敏性等特点，而受到广泛应用，而其中，Biotin和SA之间的链接更是普遍采用的，链接非常紧密的一种方式 ，从而能够具有更好的实验效果。

进一步，所述载体通过以下方法制备：

(一)          将海藻酸钠包被磁珠；

(二)          将包被磁珠后的海藻酸钠偶联SA；

(三)          将抗体偶联biotin（生物素）；

(四)          将SA与步骤（三）中的biotin进行偶联。

用SA-海藻酸钠标记磁珠后SA上有4个biotin的结合位点，这样就可以结合4个标记了biotin 的抗体，相对于抗体标记的磁珠抓细胞更紧些，效果更好。

中国专利CN 1872028A中公开了“一种免疫磁性纳米微球及其制备方法和用途”，其中的“磁性纳米微球”的结构为“以生物可降解高分子材料为高分子包裹层，包裹层内包含缓释药物和纳米磁性材料，表层链接有单克隆抗体”，另外，还提到该可降解高分子材料选自琼脂糖、壳聚糖、葡聚糖、海藻酸钠中的一种或其组合。但是纵观该专利所公开的全部内容，其利用磁珠的磁性相应解决了定向药物聚集，并利用高分子材料（其中包含有海藻酸钠）解决药物缓释的问题，两者属于不同的应用领域，并且采用的技术手段，达到的技术效果，结果的技术问题全都不同，另外，根据本发明后面说明的在细胞可逆分选的过程中，对于海藻酸钠这一组分精准挑选，是不可替代的，即上述专利工公开的其他高分子材料不可替换的，因此具有极高的创造性，更进一步，上述专利中提到的组分缓释药物，也是不可缺少的必要组分。

一种细胞可逆分选载体在细胞分选中的应用。

一种细胞可逆分选的方法，采用了所述细胞可逆分选载体。

进一步，所述细胞可逆分选的方法，包括如下步骤：

         i.              收集并充分悬浮待分离细胞；

       ii.              将待分离细胞与可细胞逆分选载体特异性结合；

    iii.              将步骤ii中得到的结合物放入到位于磁场中的分离柱中进行初步分离，得到阳性结合的细胞；

    iv.              加入EDTA（乙二胺四乙酸）进行深度分离，海藻酸钠与抗体之间的分离，并得到表面链接抗体的细胞的拆分体，并分离和收集拆分体；

上述步骤中，通过利用本发明公开的所述细胞可逆分选载体，应用到细胞可逆分选的过程中，同常规利用磁珠载体的过程相比，在完成了细胞初步分离，获得阳性结合细胞后 ，极具创造性的增添了步骤iv，在添加EDTA后，其能够特异的打断海藻酸钠与抗体之间的链接，从而实现将由海藻酸钠包裹的磁珠与链接有抗体的细胞进行分离，然后通过磁珠的磁性等将磁珠、海藻酸钠和拆分体进行完全分离筛选。

关于EDTA分离抗体和海藻酸钠的成因在于：在钙离子（交联剂）存在的条件下，海藻酸钠会包裹在磁珠表面，EDTA可以络合钙离子而让海藻酸钠脱落下来。

进一步，步骤i中包括以下过程：离心收集待分离细胞，用少量PBE（戊巴比妥）孵育液，包括： 0.5%BSA(牛血清白蛋白)、0.08%EDTA、PH7.2 PBS(磷酸缓冲液)，真空抽滤除菌及液体内气体，充分悬浮细胞，达到约0.5mL / 1*10⁸细胞。

      进一步，步骤ii中包括以下过程：加入一抗和表面包裹有海藻酸钠的超微磁珠，取10~20μg/ml终浓度，混匀后置4~15℃孵育20~30分钟。

进一步，步骤iii中，包括如下步骤：

a)       将分离柱安装入磁场中，加入0.5mL PBE,在重力作用下自然流尽，以预处理分离柱；

b)      将孵育完毕的细胞悬浮液加到分离柱中，自然流尽；

c)       以0.5mL PBE加入到分离柱中，自然流尽，洗柱一次；

d)      从磁场中取下分离柱，插在试管口上，加入1~2mL PBE，用针芯用力推尽液体，冲出阳性结合的细胞。

进一步，步骤iv中，包括以下过程：加入0.05~0.2mol/L的EDTA溶液2ml，在5000~8000rpm下离心10分钟，弃去上清液，得到细胞沉淀，重复三次，得到阳性细胞，用培养基洗一次。

本发明的有益效果为：本发明提出了一种细胞可逆分选的载体，比常规的磁珠载体创造性的增加了一层海藻酸钠，将所述可逆分选载体应用到细胞的可逆分选上，结合EDTA的作用，实现在筛选出目标细胞后，能够将磁珠从细胞上拆离，从而不会影响后续细胞培养、分化等过程。

 

具体实施方式

下面将结合本发明的具体实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一种细胞可逆分选载体，该载体包括特异性抗体、海藻酸钠和磁珠，其中，海藻酸钠包裹磁珠，抗体通过生物素-亲和素系统与所述海藻酸钠链接，并且，抗体还链接有待分选的细胞，从而形成了由“磁珠+海藻酸钠+抗体+细胞”的复合结构，另外，根据本技术领域的一般知识，根据实验设计等的需要，抗体也可以为二抗，也能实现到需要的效果。

进一步，所述抗体偶联biotin（生物素），所述海藻酸钠偶联SA（链霉亲和素），所述抗体与所述海藻酸钠通过所述biotin与所述SA之间的偶联实现链接。

进一步，该载体通过以下方法制备：

（一）海藻酸钠包被磁珠

（1）海藻酸钠配成10mg/ml溶液，合成1-1.2μm磁珠，配制100mM CaCl2溶液（交联剂）。

（2）10mg/ml海藻酸钠与磁珠800ul:400ul (2：1)比例混合,室温摇床摇30min。

（3）离心取上清液后，400ul双蒸水重悬。

（4）将重悬液滴入100mM的CaCl2溶液，静置10min（在Cacl2的交联作用下，海藻酸钠紧密包裹磁珠）。

（5）磁性富集, 400ul CaCl2溶液重悬，静置10min。

（二）、海藻酸钠偶联SA（链霉亲和素）。

（1）1ml的10mg/ml 海藻酸钠加4.8mg EDC（碳二亚胺）和13.2mg NHS（N-羟基琥珀酰亚胺），室温摇床30min活化。

向活化的海藻酸钠中加入100ul浓度为1mg/ml的SA溶液，振荡器混匀4hour。

（三）将抗体偶联biotin（生物素）

抗体标记biotin使用的是Thermo的EZ-link NHS-biotin reagents。

过程如下：

A.     1-10mg蛋白或抗体溶于0.5-2.0mlPBS溶液

B.     biotin用DMSO或DMF配成10mM的溶液

C.     将适当体积的biotin溶液与蛋白或抗体溶液混合

D.     冰上孵育2小时或者室温孵育30min

E.      孵育后的溶液可直接使用或经过分子筛柱纯化后使用

（四）将SA与步骤（三）中的biotin进行偶联

SA-海藻酸钠标记磁珠后SA上有4个biotin的结合位点，这样就可以结合4个标记了biotin 的抗体，相对于抗体标记的磁珠抓细胞更紧些，效果更好。

该细胞可逆分选载体在细胞分选中的应用。

一种细胞可逆分选的方法，采用了上述细胞可逆分选载体。

进一步，细胞可逆分选的方法，包括如下步骤：

         i.              离心收集待分离细胞，用少量PBE孵育液（0.5%BSA、0.08%EDTA、PH7.2 PBS，真空抽滤除菌及液体内气体）充分悬浮细胞（0.5mL / 1*10⁸细胞）；

       ii.              加入偶联有SA的被海藻酸钠包被的超微磁珠，加入偶联有biotin的一抗（10~20μg/ml终浓度），混匀后置4~15℃孵育20~30分钟；

    iii.              a) 将分离柱安装入磁场中，加入0.5mL PBE,在重力作用下自然流尽，以预处理分离柱；

b) 将孵育完毕的细胞悬浮液加到分离柱中，自然流尽；

c) 以0.5mL PBE加入到分离柱中，自然流尽，洗柱一次；

d) 从磁场中取下分离柱，插在试管口上，加入1~2mL PBE，用针芯用力推尽液体，冲出阳性结合的细胞

    iv.              加入0.05~0.2mol/L的EDTA溶液2ml，在5000~8000rpm下离心10分钟，弃去上清液，得到细胞沉淀，重复三次，得到阳性细胞，用培养基洗一次；

通过以上步骤，最终得到去除了磁珠和海藻酸钠的细胞，达到预期的效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种细胞可逆分选载体，其特征在于：所述载体包括特异性抗体、海藻酸钠和磁珠，所述海藻酸钠包裹所述磁珠，所述抗体通过生物素-亲和素系统与所述海藻酸钠链接，所述抗体表面还链接有待分选的细胞。

2.如权利要求1中所述细胞可逆分选载体，其特征在于：所述抗体偶联biotin，所述海藻酸钠偶联SA，所述抗体与所述海藻酸钠通过所述biotin与所述SA之间的偶联实现链接。

3.如权利要求1或2中所述细胞可逆分选载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将海藻酸钠包被磁珠；

将包被磁珠后的海藻酸钠偶联SA；

将抗体偶联biotin；

将SA与步骤（三）中的biotin进行偶联。

4.如权利要求1或2中所述细胞可逆分选载体在细胞分选中的应用。

5.一种细胞可逆分选的方法，其特征在于：采用了权利要求1或2中所述细胞可逆分选载体。

6.如权利要求5中细胞可逆分选的方法，其特征在于，包括如下步骤：

收集并充分悬浮待分离细胞；

将待分离细胞与可细胞逆分选载体特异性结合；

将步骤ii中得到的结合物放入到位于磁场中的分离柱中进行初步分离，得到阳性结合的细胞；

加入EDTA进行深度分离，实现海藻酸钠与抗体分离，并得到表面链接抗体的细胞的拆分体，并分离和收集拆分体。

7.如权利要求6中所述细胞可逆分选的方法，其特征在于：

步骤i中包括以下过程：离心收集待分离细胞，用少量PBE孵育液充分悬浮细胞。

8.如权利要求6中所述细胞可逆分选的方法，其特征在于：

步骤ii中包括以下过程：加入偶联有SA的被海藻酸钠包被的超微磁珠，加入偶联有biotin的一抗，混匀后置4~15℃孵育20~30分钟。

9.如权利要求6中所述细胞可逆分选的方法，其特征在于：

步骤iii中，包括如下步骤：

将分离柱安装入磁场中，加入0.5mL PBE，在重力作用下自然流尽，以预处理分离柱；

将孵育完毕的细胞悬浮液加到分离柱中，自然流尽；

以0.5mL PBE加入到分离柱中，自然流尽，洗柱一次；

从磁场中取下分离柱，插在试管口上，加入1~2mL PBE，用针芯用力推尽液体，冲出阳性结合的细胞。

10.如权利要求6中所述细胞可逆分选的方法，其特征在于：

步骤iv中，包括以下过程：加入0.05~0.2mol/L的EDTA溶液2ml，在5000~8000rpm下离心10分钟，弃去上清液，得到细胞沉淀，重复三次，得到阳性细胞，用培养基洗一次。