CN105255992B - 隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测及质控试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测及质控试剂盒，包括隐孢子虫阳性质控和贾第鞭毛虫阳性质控、抗隐孢子虫多克隆抗体免疫磁颗粒和抗贾第鞭毛虫多克隆抗体免疫磁颗粒，所述隐孢子虫阳性质控和贾第鞭毛虫阳性质控是由粒径为4‑6μm的量子点标记聚苯乙烯荧光微球包被有隐孢子虫特异性表面蛋白和粒径为6‑10μm的量子点标记聚苯乙烯荧光微球包被有贾第鞭毛虫特异性表面蛋白组成。本发明的隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测及质控试剂盒检测样品中的隐孢子虫和贾第鞭毛虫阳性质控成本低，保质期长，能够有效控制检测成本，促进“两虫”检测的开展。

Description

隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测及质控试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒，特别是涉及一种基于免疫磁分离技术的隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测及质控试剂盒。

背景技术

污水再生利用是解决水资源短缺的有效途径，而预防病原性污染和保障水质安全是其重要前提。隐孢子虫是介水传播的寄生性原虫，主要导致人畜共患的隐孢子虫病。隐孢子虫病呈世界性分布，迄今已经有6大洲80多个国家至少300多个地区发现了隐孢子虫病，美国、英国、新西兰等发达国家以及中国、非洲等发展中国家都相继报道了隐孢子虫病的病例。1993年美国威斯康辛州密尔沃基市40.3万人因感染隐孢子虫而患病，经调查确认为市政供水系统被隐孢子虫污染所致。我国于1987年在南京市首次发现了隐孢子虫病例，随后在徐州、安徽、内蒙古、福建、山东和湖南等省市均报道发现病例。流行病学调查发现，青海、云南等地的发病率最高。

美国国家环保总局(USEPA)于1999年2月制定并发布的1623方法是国际上最为常用的两虫(隐孢子虫和贾第鞭毛虫)标准检测方法，它包括浓缩、分离和鉴定三个步骤，即通过滤筒过滤、免疫磁性分离(IMS)和免疫荧光(IFA)显微镜检测和计数，并借助DAPI染色和微分干涉(DIC)显微镜检观察其内部的特征结构来证实卵囊和孢囊的存在。IMS是指用标记有与卵囊和孢囊表面抗原特异结合的抗体的磁珠与卵囊和孢囊相结合，形成的复合体被磁珠收集器吸附在样品管壁上，杂质随上清液被去除，从而实现与杂质的分离，是保证检测过程特异性的关键步骤。目前，在检测过程中作为阳性对照的质控主要为灭活的隐孢子虫，保质期短(3个月)，且成本较高。平均每个样品的检测费用在1500左右。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种成本低，保质期长的基于免疫磁分离技术的隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测及质控试剂盒。

本发明的技术方案概述如下：

一种隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测及质控试剂盒，包括隐孢子虫阳性质控和贾第鞭毛虫阳性质控、抗隐孢子虫多克隆抗体免疫磁颗粒和抗贾第鞭毛虫多克隆抗体免疫磁颗粒，所述隐孢子虫阳性质控和贾第鞭毛虫阳性质控是由粒径为4-6μm的量子点标记聚苯乙烯荧光微球包被有隐孢子虫特异性表面蛋白和粒径为6-10μm的量子点标记聚苯乙烯荧光微球包被有贾第鞭毛虫特异性表面蛋白组成。

隐孢子虫特异性表面蛋白优选为Cowp，Cp41或Cdg6，所述Cowp的氨基酸序列是SEQID.NO.1所示；所述Cp41的氨基酸序列是SEQ ID.NO.3所示，所述Cdg6的氨基酸序列是SEQID.NO.2所示。

贾第鞭毛虫特异性表面蛋白优选为VSP或G3，所述VSP的氨基酸序列是SEQID.NO.4所示，G3的氨基酸序列是SEQ ID.NO.5所示。

本发明的优点：

实验证明，本发明的隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测及质控试剂盒检测样品中的隐孢子虫和贾第鞭毛虫阳性质控成本低，保质期长，能够有效控制检测成本，促进“两虫”检测的开展。现有技术的“基于原虫卵囊的阳性质控”成本高，每支1500元，而本申请的用隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测及质控试剂盒进行检测，成本低，每个水样需150元。

附图说明

图1为实施例9的试剂盒捕获回的阳性质控。

图2为实施例9的试剂盒捕获回的基于原虫卵囊的阳性质控。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，本发明的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。

选择隐孢子虫和贾第鞭毛虫特异性表面蛋白，将其包被于与其对应大小(隐孢子虫4-6μm，贾第鞭毛虫6-10μm)量子点标记的聚苯乙烯微球，所制备出的微球表面“两虫”对应的特异性表面蛋白，可以作为具有“两虫”特异性功能的质控，替代“两虫”原虫作为阳性质控。制备出相应蛋白的多克隆抗体，进而制备出对应的抗“两虫”多克隆抗体免疫磁颗粒，即可进行检测。

实施例1

从NCBI数据库中分别检索隐孢子虫和贾第鞭毛虫特异性表面蛋白，并对获得的隐孢子虫和贾第鞭毛虫特异性表面蛋白的氨基酸序列通过blastp软件进行同源性比对，同源性比对相似性较高的作为实验的考虑对象。我们从隐孢子虫的表面蛋白中选取了同源性较高的三个蛋白，名称分别为Cowp(其氨基酸序列是SEQ ID.NO.1所示)，Cp41(其氨基酸序列是SEQ ID.NO.3所示)和Cdg6(其氨基酸序列是SEQ ID.NO.2所示)，贾第鞭毛虫表面蛋白中选取了同源性较高的两个蛋白，名称分别为VSP(其氨基酸序列是SEQ ID.NO.4所示)，G3(其氨基酸序列是SEQ ID.NO.5所示)。

SEQ ID.NO.1：FTFSGKQCVQSDTAPPNPECPPGTVLENGTCKLIQQVDTICPPGFVEEGNRCVQYLPANKICPPGFNLSGQQCMAPESAELESTCPPNTILENGKCKVIKNVDMVCPPGYTDSGDECVLYVAPAKECPPNFTLQG

SEQ ID.NO.2:EMDYSRIPISSEVICGLLNGMEYCICKCDELDILLERWNPFLLYKFEQEYLKNGAVLMDNNIGILVNNTMVGIGKRMNNTQSMEVTDTNIGNMSGIITSSPDSITVTNNLNGNNNSNSNTASIIDIKGGIGSGNFIPVGTSSSTSIGNSNGVTFTSIHSNNNNSNNSNNNNSNTTVTTVATNA

SEQ ID.NO.3:NFFFYDDSKKYEGGLLKKEGYDGCTVVGSDCLCWRCYFNQRPFFEEMDYSRIPISSEVICGLLNGMEYCICKCDELDILLERWNPFLLYKFEQEYLKNGAILMDNNTGILVNNTMVGIGKRMNTTQSMEVTDTNIGNMSGIITSSGDSTAVTNNLNGNNNSNSNIGSGNFIPVGTCSSTSIGNSNGVAFTAIHPNNNNSNNINNNNNNNSNTTLTTVATNANITTNTTNTTTTTTNNNNNNNNNNN

SEQ ID.NO.4:MTCKASGIVDCTTCEYNPATGGPKCTACNGAKIVKEEADGTTTCIDAGTCTQSGATGENFLSDGDAECILCSNDSSKTDNNKGSPGCGTCSKNGAKPECKTCLDGYYDSGNGNPAVCVACAGDCGKCGPGGAIDTCEKCKPGFFLKNDGTKKCVPCDDPTDGVPGCATCTLSGSFTCDSCKVNYQKKVGAGGAVTCVKTCEDPTACGGTAGACDAMIIDDQGNTKHYCSYCGETNKIPIDGKCVDSGSINGNTCNSHTCTSCAANYFLYMGGCYKATEVPGSLMCKTADNGVCTAANANNKYFVVPGATNQNQSVLACGNPLGTLVGTQGTAKAYVGVDGCSQCTAPAAPSDGGMTAAICTSCDNSKKPNRDGSGCVLCPVSDCKSCVVDNICEECVDGLYFKAGETPSCVSAEACTNEEGFFIDATEKKCTACADDNCAVCAAKEQQKCSRCKTSGTKKYLMKDGESTTGTCVDTAGCPATHYVDEEAKECNTCVSGGTVDCTTCEKGANGVVCKTCTTDTKTIFGLNRKSCVASCPANSTPKATGQGSQMCECNEGLQPNTESTECQPISNCNTEHCLECTGEGADKEVCTKCLSEYYLTPTSQCVSDCTTLKGYYGNDTDRKCKKCNDACVECKGEGADKCTACPAGRMLQYTDADTPANGGTCMNQCSVSPANDGCAECGAQIGGTAYCSKCKNTQQAPLDGNCAANTRTRFCTTVSNGACTQCENNYFLKDGGCYQTDRQPGKQVCTTVQGGKCTKCASGLTADNGDCSNKRCHLSCETCTAANDANACATCSTGYYKPQSAGTKCNPCSEGLAGCRQCTVSSTGAFMCLVMGDGTGDNTGGSVNRGGLSTGAIAGISVAVIVVVGGLVGFLCWWFICRGKA

SEQ ID.NO.5:DNTRAAACTTKDGKGGCSVCASGYFLLDGGCYQTSRQPGSQVCTTADSNGQCSQCANTLSPNDGVCPACPAGCSKCSGSSTCTECLAGYYLDSANACKKCSETSGDIQGVENCISCLAPTSPSTPTPVTCYVTQTPTVDPADPSVNKTGLSSGAIAGISVAVIAVVGGLVGFLC

实施例2

隐孢子虫特异性表面蛋白Cowp的获得及粒径为4-6μm的量子点标记聚苯乙烯荧光微球包被有隐孢子虫特异性表面蛋白Cowp的获得：

针对Cowp的基因序列，我们设计的引物为：

Cowp-F:GCGGAATTCTAAATGTTTACATTTTCAGGGAAGCAG(SEQ ID.NO.6)

Cowp-R:GCGCTCGAGTAACCTTGCAGTGTAAAATTTGGGG(SEQ ID.NO.7)

首先利用PCR技术进行基因扩增，并用OMEGA胶回收试剂盒进行PCR产物回收。将扩增的Cowp目的片段与pMD18-T载体进行连接，生成克隆质粒pMD18-T-Cowp，并进行鉴定。后进行Cowp目的片段与表达载体pTIG-Trx连接。

方法是首先提取克隆质粒pMD18-T-Cowp阳性菌株的质粒，利用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切Cowp基因片段,将酶切出的目的基因进行胶回收，提取；然后提取pTIG-Trx菌株的质粒，利用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切pTIG-Trx基因片段并进行胶回收，最后将Cowp基因片段与表达载体pTIG-Trx进行连接，完成表达质粒pTIG-Trx-Cowp的构建，并通过培养扩增，筛选阳性克隆。通过以上步骤获得了Cowp蛋白克隆质粒。将Cowp蛋白克隆质粒诱导表达，制备大量Cowp蛋白。

将Cowp蛋白与粒径为4-6μm的量子点标记聚苯乙烯荧光微球偶联，得到粒径为4-6μm的量子点标记聚苯乙烯荧光微球包被有隐孢子虫特异性表面蛋白Cowp。

实施例3

隐孢子虫特异性表面蛋白Cp41的获得及粒径为4-6μm的量子点标记聚苯乙烯荧光微球包被有隐孢子虫特异性表面蛋白Cp41的获得：

针对Cp41的基因序列，我们设计的引物为：

Cp41-F:TGGTGTTGCTTTTACTGCTATTCA(SEQ ID.NO.8)

Cp41-R:AGTAGCAACAGTAGTAACAGTGG(SEQ ID.NO.9)

其他操作同实施例2，得到大量Cp41蛋白。

将Cp41蛋白与粒径为4-6μm的量子点标记聚苯乙烯荧光微球偶联，得到粒径为4-6μm的量子点标记聚苯乙烯荧光微球包被有隐孢子虫特异性表面蛋白Cp41。

实施例4 隐孢子虫特异性表面蛋白Cdg6的获得及粒径为4-6μm的量子点标记聚苯乙烯荧光微球包被有隐孢子虫特异性表面蛋白Cdg6的获得：

针对Cdg6的基因序列，我们设计的引物为：

Cdg6-F:TCCACGCTTGGTCTCAATTC(SEQ ID.NO.10)

Cdg6-R:CCTTGGTTTGCAGTTGGACG(SEQ ID.NO.11)

其他操作同实施例2，得到大量Cdg6蛋白。

将Cdg6蛋白与粒径为4-6μm的量子点标记聚苯乙烯荧光微球偶联，得到粒径为4-6μm的量子点标记聚苯乙烯荧光微球包被有隐孢子虫特异性表面蛋白Cdg6。

实施例5 贾第鞭毛虫特异性表面蛋白G3的获得及粒径为6-10μm的量子点标记聚苯乙烯荧光微球包被有贾第鞭毛虫特异性表面蛋白G3的获得：

针对G3的基因序列，我们设计的引物为：

G3-F:AGTACTCCTACCCCCGTCAC(SEQ ID.NO.12)

G3-R:TCCACCAACAACAGCGATCA(SEQ ID.NO.13)

其他操作同实施例2，得到大量G3蛋白。

将G3蛋白与粒径为6-10μm的量子点标记聚苯乙烯荧光微球偶联，得到粒径为6-10μm的量子点标记聚苯乙烯荧光微球包被有贾第鞭毛虫特异性表面蛋白G3。

实施例6 贾第鞭毛虫特异性表面蛋白VSP的获得和粒径为6-10μm的量子点标记聚苯乙烯荧光微球包被有贾第鞭毛虫特异性表面蛋白VSP的获得：

针对VSP的基因序列，我们设计的引物为：

VSP-F:CAACAGAGGTGCCTGGTAGC(SEQ ID.NO.14)

VSP-R:CTTGCAAACCACTCCGTTGG(SEQ ID.NO.15)

其他操作同实施例2，得到大量VSP蛋白。

将VSP蛋白与粒径为6-10μm的量子点标记聚苯乙烯荧光微球偶联，得到粒径为6-10μm的量子点标记聚苯乙烯荧光微球包被有贾第鞭毛虫特异性表面蛋白VSP。

实施例7

抗隐孢子虫多克隆抗体免疫磁颗粒的制备

以获得的Cowp、Cdg6和Cp41蛋白分别免疫新西兰大白兔，经过五次免疫后，取血采用ELISA方法测定抗血清的效价，采用辛酸硫酸铵沉淀法纯化多克隆抗体。将制备的多克隆抗体通过EDC和NHS分别与磁颗粒偶联，制备出基于不同蛋白三种抗隐孢子虫多克隆抗体免疫磁颗粒。

实施例8

抗贾第鞭毛虫多克隆抗体免疫磁颗粒的制备

以获得的G3和VSP蛋白分别免疫新西兰大白兔，经过五次免疫后，取血采用ELISA方法测定抗血清的效价，采用辛酸硫酸铵沉淀法纯化多克隆抗体。将制备的多克隆抗体通过EDC和NHS分别与磁颗粒偶联，制备出基于不同蛋白的两种抗贾第鞭毛虫多克隆抗体免疫磁颗粒。

实施例9

一种隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测及质控试剂盒

包括：(1)盛有隐孢子虫阳性质控和贾第鞭毛虫阳性质控的瓶，每瓶中隐孢子虫阳性质控和贾第鞭毛虫阳性质控数量各为100±2个；

隐孢子虫和贾第鞭毛虫阳性质控是由粒径为4-6μm的量子点标记聚苯乙烯荧光微球包被有隐孢子虫特异性表面蛋白Cdg6和粒径为6-10μm的量子点标记聚苯乙烯荧光微球包被有贾第鞭毛虫特异性表面蛋白G3组成。

(2)基于隐孢子虫特异性表面蛋白Cdg6的抗隐孢子虫多克隆抗体免疫磁颗粒。

(3)基于贾第鞭毛虫特异性表面蛋白G3的抗贾第鞭毛虫多克隆抗体免疫磁颗粒

(4)结合缓冲液为质量浓度为0.85％的NaCl水溶液。

(5)平衡缓冲液为pH6.4-6.6的磷酸盐缓冲液，用于维持反应的pH环境

实施例10

用实施例9的隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测及质控试剂盒进行检测

(1)在L10平测试管预先加入1mL结合缓冲液与1mL平衡缓冲液；将40L(根据《生活饮用水标准检验方法》(GB/T 5750-2006))对水源的要求，从20-100L中选取)待测水样(每个待测水样中加1瓶隐孢子虫阳性质控和贾第鞭毛虫阳性质控)用EPA1623方法所用的滤囊进行浓缩并转移至已加入了结合缓冲液与平衡缓冲液的L10平测试管中。

(2)每个步骤(1)获得的L10平测试管中加入100μl基于隐孢子虫特异性表面蛋白Cdg6的抗隐孢子虫多克隆抗体免疫磁颗粒和100μl基于贾第鞭毛虫特异性表面蛋白G3的抗贾第鞭毛虫多克隆抗体免疫磁颗粒，置于样品混合器上，转速为18r/min室温下转动1h。

(3)取下L10平测试管，将所述试管平滑一侧朝向磁极，置于MPC-1上，90℃手工摆动2min，在不取下磁条的条件下弃去上清液。

(4)取下L10平测试管，加入1mL结合缓冲液，混匀后转移至1.5mL微量离心管中，将微量离心管插入磁极MPC-S上，插入磁条，180℃手工摆动1min，在不取下磁条的情况下弃去上清液。

(5)取下磁条，向微量离心管中加入50μl0.1mol/L的HCL，并涡旋混匀10s(也可以选10-15s之间的任何数)，室温下静置10min(也可以选10-15min之间的任何数)。

(6)涡旋混合微量离心管混匀，插入磁条静置10s后将除磁珠以外的所有液体转移到井形载玻片上，预先在载玻片上滴加5μl 1.0mol/L的NaOH，制作涂片。

(7)用DAPI染色(阳性质控为量子点激发荧光，DAPI染色不会影响质控荧光状态)，进行全玻片计数，计算回收率。图1为实施例9的试剂盒捕获回的阳性质控，图2为实施例9的试剂盒捕获回的基于原虫卵囊的阳性质控。

用Cowp蛋白替换实施例9的Cdg6蛋白，用VSP替代实施例9的G3蛋白，用基于隐孢子虫特异性表面蛋白Cowp的抗隐孢子虫多克隆抗体免疫磁颗粒替代基于隐孢子虫特异性表面蛋白Cdg6的抗隐孢子虫多克隆抗体免疫磁颗粒；用基于贾第鞭毛虫特异性表面蛋白VSP的抗贾第鞭毛虫多克隆抗体免疫磁颗粒替代基于贾第鞭毛虫特异性表面蛋白G3的抗贾第鞭毛虫多克隆抗体免疫磁颗粒，其它同实施例9，采用实施例10的检测方法，所检测的结果与实施例10相似。

用Cp41蛋白替换实施例9的Cdg6蛋白，用VSP替代实施例9的G3蛋白，用基于隐孢子虫特异性表面蛋白Cp41的抗隐孢子虫多克隆抗体免疫磁颗粒替代基于隐孢子虫特异性表面蛋白Cdg6的抗隐孢子虫多克隆抗体免疫磁颗粒；用基于贾第鞭毛虫特异性表面蛋白VSP的抗贾第鞭毛虫多克隆抗体免疫磁颗粒替代基于贾第鞭毛虫特异性表面蛋白G3的抗贾第鞭毛虫多克隆抗体免疫磁颗粒，其它同实施例9，采用实施例10的检测方法，所检测的结果与实施例10相似。

Claims (1)

1.一种隐孢子虫和贾第鞭毛虫检测及质控试剂盒，其特征是包括隐孢子虫阳性质控和贾第鞭毛虫阳性质控、抗隐孢子虫多克隆抗体免疫磁颗粒和抗贾第鞭毛虫多克隆抗体免疫磁颗粒，所述隐孢子虫阳性质控和贾第鞭毛虫阳性质控是由粒径为4-6μm的量子点标记聚苯乙烯荧光微球包被有隐孢子虫特异性表面蛋白和粒径为6-10μm的量子点标记聚苯乙烯荧光微球包被有贾第鞭毛虫特异性表面蛋白组成；所述隐孢子虫特异性表面蛋白为Cowp，Cp41或Cdg6，所述Cowp的氨基酸序列是SEQ ID.NO.1所示；所述Cp41的氨基酸序列是SEQID.NO.3所示，所述Cdg6的氨基酸序列是SEQ ID.NO.2所示；所述贾第鞭毛虫特异性表面蛋白为VSP或G3，所述VSP的氨基酸序列是SEQ ID.NO.4所示，G3的氨基酸序列是SEQ ID.NO.5所示。