CA1111415A - Separation et purification de proteines par chromatographie - Google Patents

Abstract

Procédé perfectionné pour la séparation et la purification de protéines, d'unités morphologiquement organisées par chromatographie d'exclusion sur un support solide doublement passivé. Ce perfectionnement peut être encore améliore en traitant le support et le liquide par une proportion d'agent antiseptique comprise dans les limites de la solubilité de cet agent dans l'eau. Procédé particulièrement utilisé pour la purification des virus.

Description

14~5 , La présente invention concerne un procédé perfectionné
pour la séparation et la purification de protéines de masses molé-culaires très diverses, pouvant se trouver à l'état d'unites mor-phologiquement organisees; elle utilise la méthode chromatogra-phique d'exclusion, en phase liquide. Elle s'applique en parti-culier à la séparation ou/et purification de virus à partir du milieu de culture de ces der~iers, ou à partir du milieu déjà con-centré et partiellement purifie; ansi convient-elle avantageuse-ment à la separation et purification des virus de la grippe.

Malgre le succès rencontre par les méthodes chromato-graphiques, en analyse et dans l'extraction de différentes sub-stances, ces méthodes n'ont pas pu jusqu'à présent s'appliquer uti-lement au traitement industriel de proteines de bases et tres hau-tes masses moleculaires; c'est notamment le cas des virus. L'uti-lisation de la chromatographie d'exclusion, dans la purification et la separation des macromolecules solubles ou organisees en uni-tés morphologiques plus ou moins complexes, telles que micelles li-pidiques,fractions organisées de corps bactériens ou virus, estdécrite dans diverses publicationsn C'est ainsi qu'une am~lioration de la pureté des protéines, en particulier de virus a été obtenue par l'application de la chromatographie d'exclusion sur gels sou-ples, notamment sur des billes d'agar (Bengtsson et Philipson Biochim. Biophys. Acta 79 (399) 1964): cependant, ces supports, manquant de resistance;mécanique, se prêtent mal fi une exploitation économique et industrielle o~ deforts débits, c~rrespondant à des pressions relativement elevees, doivent être appliqués a la colonne chromatographique. D'autre part, ces gels ne supportent pas la ste-rilisation par la chaleur, ce qui limite leur emploi pour la sé-paration de produits qui doivent être conservés stériles. Il est également connu que l'on peut utiliser, en chromatographie d'exclu--1- ~
B

-- .

sion ou d'affinité, des supports rigides, tels que billes de verre~ ces supports présentent l'avantage d'une bonne résis-tance mécanique et peuvent supporter des pressions élevées;
ils ont également d'avantage de pouvoir être stérilisés avant l'utilisation. Ces supports présentent toutefois l'in-convénient d'une adsorption importante de protéines; cet in-convénient a pu être atténué par un prétraitement du support avec des réactifs bloquant les sites actifs adsorbants du support; ainsi est-il connu de traiter les supports par du polyéthyl2ne-glycol; cependant ce traitement ne conduit pas a des résultats stables et les sites actifs réapparaissent peu à peu au cours du traitement.
Il est à noter egalement que, dans l'art anterieur ~Analytical Biochemistry 58, 30-38, 1974), des protéines n'ont pu être séparées par la chromatographie d'exclusion en phase liquide, sur du gel de silice poreux, que sous des fortes pressions de l'ordre de dizaines de bars. D'autre part, cette technique s'appliquait seulement à des protéines de masses moléculaires de 250 000 ~ 800 000 et à des fins analytiques seulement. Le probl2me restait entier, lorsqu'il s'agissait de séparer avec des débits industriels, sous des pressions voisines de l'atmospherique, des proteines de très hautes ; masses moleculaires, notamment au-dessus du million, comme c'est particuli2rement le cas des virus de la grippe, dont la moyenne des masses moléculaires est supérieure à quelques -- millions.
Ce probl8me est résolu par la présente invention qui permet de séparer efficacement des protéines de très hautes masses molaires de l'ordre de plusieurs millions, aussi bien que celles dont les masses vont d'environ 10 000 à 1 000 000.
On connait d'autre part divers procédés de sépara-~,. .

~ 1111415 tion et de purification ae virus. Parmi ces procédés, cer-tains comportent une séparatîon par densité sur appareil d'ultracentrifugation en continu, les ~irus étant piégés dans un gradient continu de saccharose; d'autres consistent en une adsorption spécifique, notamment sur erythrocytes, ou sur complexe insoluble de polymare et de sels bivalents, suivie d'une désorption, ou bien en une adsorption sur des tels insolubles, tels que phosphate de calcium ou sulfate de baryum, ou en une simple précipitation, par exemple au sulfate d'ammonium, au polyéthylèneglycol et solvants orga-niques. Ces procédés, combinés entre eux, qui sont a l'heure actuelle des procédés industriels, conduisent encore à des produits insuffisamment purifiés; cela peut nécessiter ul-térieurement des traite~ents par solvants qui dénaturent les protéines et dissolvent les lipides. En outre, leurs rende-menta ne sont pas optimum.
La presente invention apporte un perfectionnement a la séparation et a la purification de protéines, par l'appli-cation de la chromatographie d'exclusion pratiquée d'une façon nouvelle. elle remedie aux inconvenients de l'art an-térieur et peut être avantageusement combin~e avec d'autres moyens déjà connus. Le procédé suivant l'invention permet des opérations à l'échelle industrielle, conduisant à des ` rendements voisins de 100%.
Le terme proteine comprend - dans la présente des-cription - également des unités morphologiquement organisées, notamment virus, qui peuvent être extraits des mllieux qui les contiennent, ~ l'état de tres grande pureté. Le nouveau proc~dé et ses variantes donnent en particulier d'excellents résultats dans la séparation et la purification des virus de la grippe multipliés sp~écialement sur oeufs embryonnés ou sur substrats cellulaires culti~és in ~itro.

~ ~11415 Le procédé suivant l'invention est caractérisé en ce que la charge ou support d'une colonne chromatographique d'exclusion est soumise, avant l'emploi, a une double passi-vation: une au moyen d'une solution aqueuse d'un polymere non protéinique, selon un mode connu en soi, et une seconde a l'aide d~une solution aqueuse de protéine de masse molécu-laire inférieure ~ celle de la protéine a séparer, et sus-ceptible d'être adsorbée par la charge. On entend par passi-vation la mise des grai~s de la charge au contact d'un réactif susceptible de bloquer les sites adsorbants de cette charge.
Comme on a vu plus haut, la passivation d'apras l'art connu, notamment avec du polyéthyleneglycol ne donne pas des résultats stables; par contre, les sites actifs de la charge ne réapparaissent plus au cours du travail, lors~
qu'une passivation supplémentaire a été effectuée avec une protéine.
Dans le procédé suivant l'invention, la charge chromatographique peut être constituée par de la silice ou par un silicate, notamment gel de silice ou billes de verre, c'est-~-dire un silicate de métal alcalin. Le diamatre poreux est de préférence 5 a 200 nm, la surface spécifique pour des grains de 40 a 200 microns étant respectivement de 500 a 20 m2/g.
Apres passage du milieu renfermant la protéine à
séparer, a travers ce support, le produit est élué par de l'eau a pH tamponné entre 5,5 et 7,5 a une température de 0 a 30C et de préférence entre 4 et 20C, a une pression correspondant à la perte de chargede la colonne. Le pH préféré de l'éluant a une valeur proche de 7, pratiquement 6,5 a 7,5.
La pression est en général de 1 à 2 bars.

La nature du tampon doit, bien entendu, être com-patible avec celle des protéines a traiter, afin d'é~iter ~` . .

11114~5 des précipitations ou alt~rations de celles-ci. Les tampons a base de phosphates alcalins, connus en soi, conviennent bien a cet effet. D'autre part, il est avantageux que l'eau d'élution renferme également un électrolyte fort, qui peut ~tre du chlorure de sodium, a la concentration de 0,1 a 0,2 M.
Des gels de silice, convenant a la réalisation du procédé suivant l'invention, se trouvent dans le commerce, .. . . . _ _ _ ................. . _ ..
sous ~
. .

" ` 11~14~5 .

la denomination de Sphérosil* On peut utiliser tout autre gel de même qualité, ou des billes de verre.
Lorsque les conditions opératoires sus-indiquées sont respectées, il devient possi~le d'utiliser des colonnes de dia-mètres intérieures allant de 8 à 200 mm, susceptibles de debits de l'ordre de 3 à 30 l/h correspondant à des productions biologiques industrielles. La hauteur de la colonne depend de la nature des produits à separer et à purifier, des caractéristiques du support et de la courbe chromatographique du système donn~; elle peut, par exemple, être de 0,5 à 2 mètres.
L'invention peut être avantageusement realisee à 7'aide de plusieurs colonnes disposees en series et chargees eventuelle-ment de supports sus-indiques aux caracteristiques differe~tes;
cela permet de separer les unes des autres, differentes proteines, et parachever la purification d'un produit donne.
Comme dans les proaedes connus, le polymère pour la ; première passivation du support chromatographique peut être un compose aliphatique hydrosoluble, en particulier porteur d'hydro-xyles. Ainsi, peut-on employer des polyethylène-glycol, poly-propylène-glycol, polybutylène-glycol, alcool polyvinylique, poly-vinylpyrrolidone, copolym~re (polyethyl~ne~polypropylène) glycol, etc. Il est preférable que la masse moleculaire d'un tel blo-queur soit de l'ordre de 5 000 à 30 000.
Le blocage des sites adsorbants du support est obtenu par passage d'une solution aqueuse du reactif choisi, par exemple du polyéthylène-glycol, de poids moleculaire 20 000, assez dilue, par exemple à 0,5 à 5 g par litre, à travers la charge de la co-lonne; le volumc de cette solution doit etre egal à plusieurs fois celui de la charge; un ordre de grandeur de 10 fois ce vo-lume est approprié. Cependant, cette passivation est insuffisante,et une partie des proteines ou produits à separer restent fixes sur le support, si l'on n'applique pas, en outre, la seconde * marque de commerce ~, .Y,,~

passivation suivant la presente invention. Cette seconde passi-vation est effectuee par traitement du support chromatographique avec une solution aqueuse d'une ou de plusieurs proteines de ! masses moleculaires plus petites que celle de la protéines à se-parer. Ainsi, selon la nature de cette dernière, diverses protei-nes, accessibles industriellement, telles par exemple qu'albumine, notamment sérum -albumine, ovalbumine ou lactalbumine, gelatine, peptones etc. peuvent être utilisees. Il est pratique d'employer celles des proteines, plus legères, qui accompagnent la proteine plus lourde que l'on veut separer. Des produits de degradation de differents polypeptides peuvent être employ~s. En general, la masse moleculaire de la ou des proteines de passivation est de preference inferieure à lO0 000 et, mieux encore, ne depase pas 50 000. La solution peut renfermer 0,2 à 20% en poids de proteine de passivation, et plus particulièrement 1 à 15%.
Dans le cas de la separation et purification des virus de la grippe, d'excellents resultats sont obtenus par un ou plu-sieurs passages de liquide allantoique préleve sur des oeufs em-bryonnes! non infectes par le virus grippal. Dans ces conditions, la colonne de gel de silice a perdu tout son pouvoir de fixation des virus; elle est stable et peut fonctionner pendant des mois avec l'eluant tamponne, pour extraire lès unites morphologiquement or-ganisees, voulues, sans que celles-ci subissent une adsorption par la silice ou le silicate.
Le procede et appareil suivant l'invention permettant , d'obtenir des produits proteiniques très purs a partir de milieux aqueux, et, en particulier, des virus à partir de milieu de cul-ture de ces microorganismes. Toutefois, etant donne le mecanisme de la chromatographie d'exclusion, qui comporte l'elution avec des volumes plus ou moins grands de liquide, la concentration de la proteine cherchee, dans la solution purifiee, obtenue, n'est generalement pas très forte. ~uand l'utilisation envisagee n'exige ` 1111415 pas une solution très concentree, le produit obtenu, comme dé-crit ci-dessus, convient parfaitement; mais, si des concentra-tions plus elevees sont necessaires, elles peuvent être atteintes par une variante de la presente invention.

. .
~- Des variantes de la présente invention consistent en des combinaisons de la chromatographie d'exclusion en phase li-quide avec des moyens de purification diffcrents, par excmple pré-cipitation, adsorption, ou/et ultracentrifugation. Ces variantes peuvent être pratiquces de deux manières: la protéine recherchée est d'abord concentrée et/ou purifiée par une des methodes ci-dessus, connues, de fa~on à former une solution concentrée et/ou semi-purifiée du produit recherché; ce produit est ensuite extrait ; à l'état purifié par la chromatographie; ou bien, le milieu ini-tial est soumis à la chromatographie d'exclusion en vue de la se-paration des produits recherches à l'etat de bonne purete, la so-lution, ainsi obtenue, étant ensuite concentrée, et le produit i recherche, extrait, est purifie par une des methodes sus-indiquees.
Ainsi, dans le cas de la separation du virus de la-grippe a partir de solutions allantoiques, la premiare operation peut être la concentration du virus par adsorption-desorption sur hematies; adsorption sur lc phosphate de calcium, puis re-larguage par complexation du calcium; précipitation par des sels tels que BaSO~ ou (NH4)2S04 ou bien par du polyéthylène-glycol, ou autre poly (oxy-alcène); ultracentrifugation zonale en gra-~ dient de densitc; adsorption sur verre poreux ou gel de silice, i~` suivie d'une désorption par elevation du plI; ultrafiltration sur membranes ou fibres creuses; ou bien, la séparation du virus est d'abord rcalisée par la chromatographie d'exclusion suivant l'in-vention, après quoi la solution de ce virus est soumise à la con-, . .
centration par une de ces méthodes, ou par lyophilisation.
Un procédé remarquable pour la combinaison avec la chro-matographie colsiste en 1'adsorpt on semi-spéciiique par addition , .

dans le liquide contenant le virus purifié ou non, d'un polylaky-lène-glycol ou poly (oxy-alcène) en particulier du polyéthylène-glycol et d'un sel bivalent spécialement le chlorure de calcium.
Le complexe insoluble polymère-Ca++ qui dans son insolubilisation a entrainé les virus, est redissous dans une solution aqueuse de l'acide éthylene diaminotétra-acétique ou d'un sel alcalin de celui-ci (particulierement sel de sodium) ou de tout autre agent décomplexant le calcium.
La solution concentrée, ainsi obtenue, est alors soumise à la chromatographie d'exclusion décrite plus haut. Cette dernière fournit ainsi une solution à la fois concentrée et tres pure.
Bien que le principe de cette méthode soit connu en soi (Ph. Adamowicz, B. Legran~, J. Guerche et P. Prunet; Bull.
off. int. Epiz 1974, 81, (11-12), 1125, 1150) sa combinaison avec la purification chromatographie suivant l'invention com-porte une adaptation, sans laquelle les résultats ne seraient pas satisfaisants. En effet, selon la méthode connue, le poly-éthylène-glycol, utilisé à la complexation conjointement avec un sel de métal bivalent, doit avoir une masse molcculaire d'au moins 100 000, pouvant aller à 300 000; or, suivant la présente invention, des polymères de masses moléculaires nettement plus faibles doivent être appliqués car avec 100 000 ou plus le fonc-tionnement de la chromatographie peut être perturbé par la vis-cosité élevée et conduire à des préparations moins pures, le polymère étant moins bien séparé des virus. Conformcment à l'in-vention, le polymère d'oxyde d'alkylène utilisé doit avoir un degré de polymérisation limité à environ 80 à 1 400, ce qui -dans le cas du polyéthylène-glycol - correspond à des masses moléculaires d'environ 5000 à 85 000; des masses préférées sont de 6 000 à 30 000 et plus particulièremetn 10 000 à 25 000. Des résultats équivalents ont également ete obtenus en utilisant les .: . . . . .

-4~

polym~res cités précédemment.
Le nouveau procédé et ses variantes donnene d'excel- -lents résultats dans la préparation de solutions concentrées en virus pur de la grippe. Generalement les virus de la grippe, destinés à la préparation des vaccins, sont multipliés dans la cavité allantoique des oeufs de poule em~ryonncs. Lors de la récolte, les liquides allantoiques, déjà charges de diverses protéines et de sels, peuvent être contaminés avec les phospho-lipides prélevés accidentellement par altération de la membrane vitelline. C'est de ce milieu de culture que sont extraits les virus de la grippe, purs. Ces virus ont la propriété d'agglu-- tiner les hématies de poule, ce qui permet une détermination quantitative, rapide, exprimable en unités internationales d !hémagglutination.
Etant donné la sensibilité des protéines, en général, aux attaques par des microorganismes, et surtout celles des mi-lieux biologiques dont on extrait des enzymes, virus, etc., le traitement du milieu soumis à la séparation doit être effectuc dans des conditions stériles. La st~rilisation classique des appareils utilisés, par la chaleur, comporte l'obligation de dé-montage de l'appareil, lorsque celui-ci a les dimensions et cons-truction industrielles; cette opération ne peut d'ailleurs pas empêcher les contaminations au cours du travail. La méthode usuelle consiste à ajouter, au liquide traité, un ou plusieurs antiseptiques, dont les plus employés sont le formaldéhyde et le merthiolate de sodium (éthyl-mercuri-thiosalicylate de sodium);
on obtient ainsi une sterilisation convenable, mais - dans le cas de virus en particulier - l'antigène obtenu est inactive; la méthode courante ne permet donc pas la préparation d'un vaccin vivant dans des conditions stérilcs.

Une variante de la presente invention remédie à ces insuffisances de la technique antérieure: elle permet d'empecher - en permanence la prolifération de bacteries, tout au long du travail de séparation de protéines, sans toutefois inactiver le vérus donné, que l'on cherche à séparer. Le procéd de l'inven-tion s'applique donc fort utilement aussi bien dans le cas général des protéines non vivantes qu'à celui de la séparation de virus; ce dernier cas est - comme Oll le sait - très important pour la sérologie. L'invention permet ainsi la preparation aisée de vaccins vivants.
Cette variante réside dans le choix spécial d'un agent antiseptique, susceptible d'agir sélectivement comme bactericide ou, du moins, bactériostatique, inoffensif vis-à-vis des unités protéiniques, morphologiquement organisées, qu'il s'agit de sé-parer. Conformément à l'invention, de tels agents sont choisis parmi les hydrocarbures aliphatiques, inférieurs, halogénes;
; conviennent surtout des hydrocarbures di- et tri-halogénés, et principalement ces derniers. Selon la nature des unités, notam-ment virus, à respecter, et suivant la sensibilité de ceux-ci aux hydrocarbures halogénés, on peut utiliser, comme antisepti-ques, un ou plusieurs des composés tels que mono-, di-, tri-, et tétrachlorométhane, -éthane ou -propane, ou bien les dérivés bromés ou iodés correspondants, à condition que leur solubilite dans l'eau soit d'au moins 0,1 g/l et, de préférence, egale ou supérieure à 1 g/l. La proportion d'agent antiseptique utilisée est comprise dans les limites de la solubilite de l'agent dans l'eau. D'autre part, l'agent utilisé doit présenté une forte tension de ~apeur, pour pouvoir être éliminé facilement du produit fini.
Bien que des composés tels que chlorure, bromure ou iodure, de méthyle, à solubilité dans l'eau relativement élevee, soient utilisables, il vaut mieux employer des hydrocarbures halogénésssolubles à raison d'environ 1 à lO g/l. Appartiennent a cette classe, par exemple, les composés suivants:

dichloromethane, dibromo-methane, diiodo-methane, dichloro-ethanes-1,2 (cis et trans), dibromo-éthane-1,2, trichloro-méthane (chloroforme), tribromo-méthane (bromoforme), tri-chloro-1,1,2-eethane, trichloroethyl8ne, etc....................... ~ :
` L'iodoforme (CHI3), qui fut autrefois employé beau-coup en chirurgie, peut également convenir dans certains cas, mais, tant a cause de sa faible solubilite d'environ 0,1 g/l ~ -que de sa toxicité relativement élevée (DL50 630 mg/kg souris~, :
il est préférable d'avoir recours au chloroforme (CHC13), qui donne des résultats remarquables, sa solubilité dans l'eau étant d'environ 5 a 7 g!l, aux températures moderées.
Puisque les hydrocarbures halogenés sont des solvants puissantsdes lipides, on pouvait s'attendre a ce qu'ils af-fectent les microorganismes dont l'enveloppe est de nature lipidique' or, de façon tout à fait inattendue, on constate qu'une telle action n'a pas lieu avec les agents antisepti-ques suivant l'invention, lorsque les doses sont situées dans les limites de solubilité de ces agents. C'est ainsi que, par exemple, des concentxations de l'ordre de 5 g de chloroforme, par litre du milieu contenant un virus de la grippe, n'affectent nullement ce dernier, alors qu'ils sté-rilisent fortement la solution vis-a-vis de bactéries; a ces concentrations, ni le titre infectieux, ni le pouvoir hémoagglutinant du virus ne sont modifies, même apr~s 5 jours - d'incubation. Il en résulte, par conséquent, que malgré la connaissancedeja ancienne de l'effet antiseptique de cer-tains hydrocarbureshalogenés sus-mentionnés, l'application, sui~ant l'invention, est tout a fait nouvelle et imprévue.
Les agents antiseptiques, suivant l'invention, peuvent être ajoutés au liquide à traiter, a la solution tampon utilisée pour l'élution, ou bien dans ces deux milieux ' l , ` ~11~41S
.

à la fois. Lorsque la solution de la proteine séparee est soumise a la lyophilisation, cette operation élimine la très ....
- - falble quantité d'hydro~
- . - . . . _ . .

~ 14~5 carbure halogéné qui aurait pu rester dans la proteine.
La preserlte description est illustrée par les figures 1 à 4 suivantes.
Fig. 1 est la courbe chromatographio~ue d'une sépara-tion de virus de la grippe.
Fig. 2 est la courbe chromatographique de Ia solution de virus purifié de la figure 1.
Fig. 3 représente le chromatogramme d'une solution de catalase purifiée par le procédé de l'invention.
Fig. 4 est un schcma de l'appareil chromatographique qui a servi aux opérations d~crites dans lcs exemples.
Les dispositifs servant a la chromatographie d'exclu-sion pour la préparation de diverses substances sont connus,mais à des fins analytiques seulement, les colonnes ayant un diamètre int~rieur de 8 mm environ. Aucun matériel automatique de chroma-` tographie d'exclusion de grande capacité n'existait jusqu'à
:! présent.

Le dispositif pour la réalisation industrielle suivantl'invention est représenté par la figure 4: une pompe 2 pousse en permanence dans la colonne 5 le solvant d'élution contenu dans le réservoir 1. La solution à fractionner, contenue dans le réservoir 4, est injectée dans la colonne 5 à intervalles de temps réguliers par un système automatique 3 constitue d'électrovannes et d'une boucle d'échantillonnage de 500 ml (par exemple). La colonne 5, de grande capacité, par exemple 10 cm de diametre et 120 cm de hauteur, est en acier inoxydable; elle est entourée d'une double enveloppe 10 en acier inoxydablc également, pouvant supporter des pressions de stérilisation par la vapeur, et rac-cordée également à une circulation réfrigerante (+4C par exemple).

Le gel de silice est dispose dans la colonne 5. Des produits, issus de la chromatographie, peuvent être recoltés par fractions sélectionnées et le contrôle de l'effluent de la col~nne est ef-.

``; -` 1111415 fectué à l'aide d'un détecteur ultra-violet 6, dont la réponse est transmise à un enregistreur 8. Les différents produits élués sont recueillis dans un collecteur de fractions 7 constitué par une vanne automatique à n voies (20 voies par exemple), notamment par un ensemble d'électrovannes. Les differentes opérations, injections et collectes, sont effectuées automatiquement à l'aide d'un programmateur du commerce. Cet appareil peut fonctionner en continu 24 heures sur 24.
Il est possible de traiter avec l'appareillage décrit, 450 ~ 500 ml de liquide par heure, soit une quantit~ de 10,8 à 12 litres par jour, pour obtenir un produit parfaitement purifié.
Dans le cas de la purification du virus de la grippe on peut traiter 12 litres de liquide allanto~que/jour. On voit ainsi l'intérêt que présente la variante décrite, qui consiste à traiter ; dans la colonne un liquide prealablement concentré et partielle-ment purifié. Etant donné qu'il es~ possible de concentrer le liquide allantoique 40 fois, la quantité de liquide allantoique provenant des~oeufs, qui peut être traitee, est de 400 - 480 1, ce qui correspond à la production fournie par 60 000 oeufs environ.
Les exemples qui suivent illustrent non limitative-ment la présente invention.

Préparation de la colonne.
La colonne, décrite plus haut, a un diamètre intérieur de 10 cm et une hauteur de 120 cm. Elle est chargée avec de la poudre de gel de silice en particules de 100 à 200 microns, dont le diamètre poreux moyen est de 60 nm et la surface spécifique 50 m2/g, le volume poreux de la charge est de 1 ml/g. Le gel de silice utilisé est le "SPHEROSIL XOB 030"*(Rhône Poulenc). Après stérilisation par la vapeur, le gel, placé dans la colonne, est préalablement passivé, c'est-à-dire trait~ par une solution aqueuse de 1% de poly~thylène glycol de masse molaire 20 000, pendant 24 h, * marque de commerce. -13-.

de façon a bloquer ses sites adsorbants. La colonne re~oit ensuite une charge de 500 ml de liquide allantoique non char-gé de ~i~us grippal, qui produit la seconde passivation.
Cette double passivation est suivie d'un lavage avec une solution aqueuse, tampon, de phosphate monopotassi-que et disodique stérile, de p~ 7,5 renfermant du NaCl a la concentration 0,15 M. Une telle colonne est prête pour le traitement de solutions de produits à purifier.

., .
Séparation du virus de la grippe, souche A/X53, de son milieu de culture allanto~que.
:~i La solution de virus traitée provient de la culture classique dans la cavité allantoique de l'oeuf de poule em-~; bryonné, aprés 10 à 12 jours d'incubation; elle titre 1 200 '! .
~ unités HA (méthode d'hémato-agglutination) par 0,25 ml.
., :
~ 450 ml de cette solution sont injectés dans la colonne, avec :! ' .
un débit de 150 ml/mn, soit en 3 minutes, et cela toutes les heures. Pendant ce temps, on fait passer en permanence, à -! travers la colonne, un débit de la solution tampon susindi-.~ . :
quée. Ce débit est de 9 l/h, tant que seul le virus appa-ralt a la sortie de la colonne. A ce débit le ~irus commen-ce a apparaltre au bout de 30 minutes; le débit est triplé, c'est-à-dire augmenté à 27 l/h, lorsque l'éluat commence à
renfermer les impuretés du virus. Cela permet d'achever l'opération plus rapidement, notamment en 1 heure.
La colonne étant équipée de dispositifs d'automa-tion connus en soi, il est possible de la faire fonctionner sans interruption pendant tout le temps voulu.
La détection des composants de l'éluat, a la sortie de la colonne, est effectuée au moyen d'un dispositif de dé- -termination de la densité optique dans l'ultra-violet de longueur d'onde de 252 nmt cet appareil étant bien connu dans l'art, il n'y a pas lieu de le décrire ici.
La perte de charge dans la colonne étant assez faible, la circulation de la solution a travers la colonne n'exige qu'environ 1 bar de surpression a l'entree de celle-ci.
A partir des 450 ml de solution virale, traitée, on obtient, apres chromatographie 1 050 ml d'éluat renfermant du virus tres pur, tandis que les impuretés se trouvent dans le reste de la solution ~ampon passée par la colonne.
Sur la figure 1, qui montre la courbe chromatogra-phique de cette opération (densités optiques en ordonnées, volumes d'éluat en abscisses), on peut voir le pic V corres-pondant au virus et le pic I aux impuretés; la discontinuité
du pic I est due au changement du débit de 9 a 27 l/h. Lors-qu'on examine, dans une colonne chromatographique analytique de 0,8 cm de diametre sur 120 cm de haut, garnie de la même silice que plus haut, un échantillon de 3 ml, préleve dans les 1 050 ml de solution purifiée, on trouve un pic du virus seul, figure 2, les impuretés étant completement absentes.
On voit que la purification du virus a été remarquable.
Voici le bilan de l'opération déterminé par la me-sure de l'activité suivant la méthode d'hemato-agglutination (HA). Les 450 ml de solution allantoique de depart titraient 1 200 unités H~/0,25 ml, tandis que l'activité des 1 050 ml obtenus etait de 4~0 unités HA/0,25 ml. On avait ainsi, au départ, un total de 2 160 000 unités HA, et on en retrouve

2 016 000 dans la solution purifiée. Le rendement est donc de ( 2 016 000: 2 160 000) x 100 = 93,3 %
ce qui peut être considéré comme tr2s élevé, car les méthodes classiques donnent des résultats de beaucoup inférieures.

' . ,' :
. ' . . ~

~141$

Séparation du virus grippal par un double procédé
d'adsorption - élution sur érythrocytes suivie d'une purifi-cation par chromatographie sur gel de silice.
50 litres de liquides allantoiques virulents, pro-venant d'oeufs de poule e~bryonnés de 10 a 12 jours, sont préalablement clarifiés selon l'art connu par centrifugation, pour éliminer les substances insolubles. Le liquide centri-. .
- fugé présente 1200 unités HA dans 0,25 ml.

On ajoute 4% (V/V) d'un culot d'hématies de poule à cette suspension. Après un temps de contact de 8 à 16 " .
heures à la température de +4C ou +37C, les érythrocytes sont séparées par centrifugation à 3 000 tours/minute, et le virus est élué par un tampon phosphate sous un volume de 5 litres. L'éluat a un titre hémagglutinant de 12 000 uni-'7 tés HA dans 0,25 ml.
450 ml de cette suspension virale sont automatique-, ment injectés dans la colonne, en 3 minutes à un débit de 150 ml/mn. Pendant ce te~ps, on fait passer en permanence, à travers la colonne, un débit de la solution tampon décrite dans l'exemple 1. Ce débit est de 9 litres/heure tant que seul le virus appara~t a la sortie de la colonne. Il est triplé (27 litres/heure), lorsque l'éluat ne renferme plus de virus mais des protéines contaminantes. Chaque opération dure 1 heure. Grâce à son dispositif d'automatisme la co-!J lonne fonctionne en continu jusqu'à épuisement des 5 litres de concentrat d'éluats. Les pics, correspondant aux virus purifiés, sont rassembles et donnent un volume de l5 litres.

Leur titre en unite hemagglutinante est de 32 000 unites HA
pour 0,25 ml, ce qui represente un rendement de l'ordre de 100%.

~111415 En partant de 10 litres d'une solution de liquide allantoique infecté par le virus grippal, similaire ~ celle de l'exemple 2, on procade en premiare étape ~ une concentra-tion-purification sur co~plexe polymare calcium. Pour cela, on ajoute ~ cette solution aqueuse 2 ~ en poids de polyéthy-lane-glycol de . _ _ . .. .

..

masse moléculaire 20 000, ainsi que 12 g de CaC12 en poudre.
Après melange homogène pendant 30 minutes, le précipite est sépar~
par décantation suivie de centrifugation; il est ensuite repris pour elution du virus, dans environ 500 ml d'une solution aqueuse ~ 0,2 M, du sel disodique de l'acide éthylène-diamino-tctraacétique, reajuste à pH 7,5 par de la soude 6 N.
La solution ainsi obtenue est centrifugée pour éliminer l'insoluble, et le liquide clair surnageant, soit environ 500 ml, est conservé.

Le rendement de cette opération de concentration puri-fication a été trouvé voisin de 65 %.
Les 500 ml de cette solution concentrée sont chromato-graphiés par exclusion dans une colonne de 10 cm de diamètre inté-rieur sur 120 cm de haut, garnie de la même silice qu'à l'exemple 1, et l'on utilise également la même solution tampon. Les 500 ml sont injectés comme dans l'exemple 2. Le pic virus est recueilli par élution dans 1500 ml de solution qui titre 10 800 U~A/0,25 ml, ; ce qui correspond à un rendement de purification voisin de 98 %.
La solution obtenue de virus est à la fois concentrée et très pure.

Du liquide allantoique infecte, comme décrit ci-dessus, est concentré par diafiltration sur des membranes ou fi~res creuses ayant un point de coupure de 1.106.
50 litres sont ainsi ramenés à un volume de 5 litres ou moins. Après clarification, ce concentrat est directement in-jecté dans une colonne conforme au modèle decrit dans les exemples précédents, et selon le même procédé.
Le pic viral contient la totalité des unités hémagglu-tinantes qui ont été déposées. Cette solution, très purifiée dupoint de vue protéique, peut encore être contaminee par des phos-pholipides du sac vitellin organisés en micelles; ce contaminant peut être séparé d'après la densite par une opération d'ultra centrifugation sur gradient de saccharose. 'routes les impuretés ayant eté éliminées par la chromatographie d'exclusion, les rende-ments de l'opération s'en trouvent très améliorés.

. , .
500 litres de liquide allanto1'que infectieux, comme décrit ci-dessus, sont purifiés par une première opération d'ultra-centrifugation sur gradient de saccharose.
Le pic viral récolté représente le volume de 1 litre.
Le rendement de cette opération est compris entre 30 et 80 %.
Le pic viral est introduit automatiquement dans une colonne de gel de silice, comme celle que décrit l'exemple 2, et l'on procède à
la chromatographie d'exclusion par le procédé de cet exemple 2.
Le volume récolté est ~e 3 litres.
Le rendement de l'opération de chromatographie est voisin de 100 % comme précédemment, alors que le liquide traité, issu de l'ultracentrifugation contenait encore une proportion sen-sible de contaminants protéiques.

Les opérations, réalisées selon cet exemple, sont identiques à celles des exemples 2, 3, ~, 5 et 6. Cependant, la suspension virale, soumise à l'opération de chromatographie d'e~-clusion, est preaLablement inactivee par le formol, par la ~-propiolactone ou par les ultra-violets, et/ou traités par un sol-vant organique.

La colonne chromatographiquc,préparce selon l'exemple 1, est utilisée à la purification d'une solution aqueuse impure de --catalase, extraite, par des opérations préliminaires, du foie de boeuf. Cette solution présente une activité de 220 Unités Inter-nationales. L'éluant est tamponné à pH 7. On obtient une solu-tion à activité 180 U.I. soit un rendement de 86 % dans la fraction `f' 1~L11415 Sl du chromatogramme représenté par la figure 3.

EXE~PLE 9 .
Les opérations de l'exemple 2 sont répétées avec la colonne décrite dans l'exemple 1, mais la charge de la colonne est constituée par des billes de verre de ~imensions comprises entre environ 80 et 280 microns, au diamatre poreux moyen de 50 nm.
Le rendement en virus purifié est de 87 ~.
EXE~lPLE 10 Une purification du virus de la souche B/HK est effec--tuée conformément aux exemples 1 et 2, sauf que pour la seconde passivation de la charge de la colonne, on emploi 500 ml dlune solution aqueuse à 6% de lactalbumine de masse moléculaire d'envi-ron 18 000.
Les opérations conduisent à un rendement ~e 92 %.
EX~MPLE 11 : .
Dans l'exemple 10 la lactalbumine est remplacée par ` une solution à 8 % de peptone de viande, c'est-à-dire des pro-! duits de protéolyse des polypeptides de la viande. Le rendement ' ressort à 93 %.

Après la séparation du virus suivant l'exemple 2, le produit obtenu est examiné au point de vue de sa flore micro-bienne: le nombre de germes par ml est indique ci-dessous, en A.
Une séparation similaire est effectuée, avec cette dif-férence que la solution tampon est additionnee de 5 g de chloro-forme, CHC13,par litre, afin de stériliser le milieu sélectivement:
la solution obtenue, B, ne contient plus que très peu de germes.
Dans une opcration C, le même antiseptique est ajoute, à raison de 5 g/litre tant à la solution tampon qu'au liquide à traiter.
Le résultat est semblable à B.

` ' 1111415 D. D'autre part, une quantité du même milieu viral, initial, est soumise a l'ultracentrifugation zonale, après l'adjonction usuelle de 0,01% de merthiolate et 0,02 ~ de formaldéhyde.
Les résultats suivants ont été trouvés.
Germes/ml A Chromatographie; sans antiseptique ........... ....105 B Chromatographiei chloroforme dans le tampon .. ...~10 C Chromatographie; chloroforme dans le tampon et ~10 dans le liquide traité
D Ultracentrifugation zonale 3 000 Merthiolate ~ formaldéhyde Il y a lieu de noter en outre que les virus obtenus dans les opérations A, B et C étaient vivants, tandis que celuide l'opération D était inactivé.
De plus, les produits résultant des opérations B
et C, avec du chloroforme, ont conservé le même titre infec-tieux et le même pouvoir hemoagglutinant que ceux du produit A, dont la séparation a été effectuée sans aucun antisepti-que.

Une solution virale, similalre à celle qui a servi aux essais A à D, dans l'exemple 1, mais correspondant à
d'autres souches de virus, est soumise ~ la séparation par le procédé décrit dans l'exemple 2.
On étudie ainsi des liquides obtenus à partir de

3 souches de virus de la grippe: A/URSS, A/Texas, B/HK.
Dans chaque cas, on effectue la chromatographie avec 5 g de chloroforme par litre de liquide et de tampon, et sans chloroforme.
En outre, des séparations comparatives sont effec- -tuées par ultracentrifugation zonale.
Le tableau suivant donne les rendements par rapport . au liquide de départ, dans chaque cas, ainsi que le titre en :~
virus, en unites internationales par mg de protéine.
~IRUS: A/URSS A~TEXAS B/HK
Rendement %
Chromatographie avec Chloro- ........ 88 77,5 88 Chromatographie sans chloro- ........ 81 71,5 81 Ultracentrifugation zonale .......... 72 50 63 (merthiolate-formaldehyde) UI/mg protéine:
Chromatographie avec chloro- ........ 19 800 23 400 26 200 forme Chrfomatographie sans chloro_ ....... 12 100 19 200 Ultracentrifugation zonale .......... 12 900 13 600 15 3 (merthiolate-formaldéhyde) Ces résultats montrent que l'adjonction de chloro-:` forme améliore tant le rendement que la concentration du virus dans le produit obtenu, et cela non seulement par rapport au procédé classique d'ultracentrifugation zonale, mais même vis-à-vis du procédé perfectionne de chromatographie d'exclu-sion, decrit dans les exemples 1 a 11.
Dans le present exemple 13, on a constate, comme precédemment, que le virus, séparé en présence du chloroforme, est vivant et présente le même titre infectieux et le même pouvoir hemoagglutinant que le virus résultant de la chroma-tographie sans chloroforme. Par contre, le virus separe par ultracentrifugation zonale avec sterilisation classique, est inactive.

Dans des operations similaires aux cas B et C de l'exemple 12 on a utilise di bromoforme à la concentration d'environ 1 g/l, qui correspond au maximum de la solubilite ~- ~111415 du CHBr3 dans i'eau, on retrouve une centaine environ de germes, par ml, dans le liquide final.

Le remplacement du chloroforme, dans l'exemple 12, ... . _ _ . . _ .. . . . _ . .. .. _ .. _ .. ...

` ~ ` 11114~S

par du trichloro-1,1,2-éthane, à raison de 4 g/l (solubilite

4,4 g/l à 20C), conduit à une flore bactérienne également très réduite, de moins de 30 germes/ml.

Les opérations de l'exemple 2 sont realisées dans la colonne décrite dans l'exemple 1, mais sans la seconde passiva-tion, c'est-à-dire sans traitement de la charge avec du liquide allantoi'que. Le rendement en virus est alors de 70 %.

En opérant sans la seconde passivation, comme dans l'exemple 16, la charge étant constituee par les même billes de verre que pour l'exemple 9, on a un rendement de 64 % contre 87 %
dans ce dernier.
Les conditions du débit d'éluant, de la quantitué de liquide à traiter injectée dans la colonne, la frequence de cette injection, décrites dans les exemples ne sont pas limitatives;
elles peuvent varier dans d'assez larges limites.

Des solutions de liquide allantoique infecte de virus sont préparées à la maniere connue, à l'aide de diffésentes souches de virus. On introduit dans ces solutions 6 g/l de chloroforme.
Le tableau suivant montre que l'adjonction de chloro-forme ne modifie pas le titre infectueux et le pouvoir hémoag-glutinant de ces solutions.
A/Victoria 75 A/X47 HK 73 Titre HA -avant chloroforme 210 160 290 ~ après 24 heures 210 160 2~0 . .
après 2 jours 130 après 3 jours 230 160 après 5 jours 90 Titre infectieux sans chloroforme 107. lo7.25 105.5 avec chloroforme 107.3 1o7.25 1o5.25

Claims (15)

Les réalisations de l'invention, au sujet desquelles un droit exclusif de propriété ou de privilège est revendiqué, sont définies comme il suit:

1. Procédé de séparation de protéine ou d'unités mor-phologiquement organisées d'un milieu aqueux, par chromatographie d'exclusion en phase liquide, sur un support solide préalablement passivé par traitement avec une solution aqueuse d'un polymère non protéinique, caractérisé en ce que ce support subit, avant la chro-matographie, une seconde passivation consistant en sa mise en contact avec une solution aqueuse de protéine de masse moléculaire inférieure à celle de la protéine à séparer, et susceptible d'être adsorbée par le support.

2. Procédé suivant la revendication 1, caractérise en ce que le support solide est un gel de silice ou un silicate de métal alcalin en grains de 40 à 200 microns, dont le diamètre moyen des pores est de 5 à 200 nm.

3. Procédé suivant la revendication 1, dans lequel le polymère non protéinique de passivation est un compose ali-phatique portant un hydroxyle.

4. Procédé suivant la revendication 3, dans lequel le polymère est un polyéthylène-glycol, polypropylène-glycol, polybutylène-glycol, alcool polyvinylique, polyvinylpyrrolidone ou un copolymère (polyethylène-polypropylène) glycol.

5. Procédé suivant la revendication 4, dans lequel le polymère présente une masse moléculaire de 5 000 à 30 000 et sa concentration dans la solution aqueuse est de 0,5 à 5 g par litre.

6. Procédé suivant la revendication 1 , caractérisé
en ce que la ou les protéines , employées pour la seconde passivation, ont des masses moléculaires inférieures à 100 000.

7. Procédé suivant la revendication 6, caractérisé en ce que lesdites protéines sont des albumines, gélatines, peptones ou produits de dégradation de polypeptides, et leur masse molécu-laire ne dépasse pas 50 000.

8. Procédé suivant la revendication 1, 6 ou 7, carac-térisé en ce que la solution de la protéine, employée pour la se-conde passivation, renferme 0,2 à 20 % en poids de cette protéine.

9. Procédé suivant la revendication 1, dans lequel l'élution du support chromatographique est effectuée au moyen d'une solution aqueuse tampon de pH 5,5 à 7,5, caractérisé
en ce que cette solution tampon est additionnée d'un agent anti-septique, constitué par un ou plusieurs hydrocarbures aliphatiques inférieurs, halogénés, à une proportion comprise dans les limites de solubilité de cet agent dans l'eau, soit d'au moins 0,1 g par litre.

10. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le liquide, soumis à la chromatographie, est préalablement additionné d'un agent antiseptique constitué par un ou plusieurs hydrocarbures aliphatiques inférieurs, halogénés, à
une proportion comprise dans les limites de solubilité de cet agent dans l'eau, soit d'au moins 0,1 g par litre.

11. Procédé suivant la revendication 9 , carac-térisé en ce que l'agent antiseptique est un mono-, di-, tri-, ou tétra-halogéno-méthane, -éthane ou -propane, l'halogène étant le chlore, le brome ou l'iode.

12. Procédé suivant la revendication 9, 10 ou 11, caractérisé en ce que l'agent antiseptique est le chloroforme, employé à raison de 1 à 7 g par litre.

13. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la protéine à séparer est un virus.

14. Procédé suivant la revendication 13, caractérisé
en ce que le liquide, soumis à la chromatographie d'exclusion, est une solution relativement concentrée en virus, obtenue par une méthode de précipitation, d'agglutination, d'adsorption-desorption ou/et de centrifugation à partir d'un milieu aqueux, infecte par le virus.

15. Procédé suivant la revendication 14, caractérisé en ce que le liquide, soumis à la chromatographie, est une solution concentrée de virus, obtenue par absorption du virus sur un complexe insoluble d'un polyalkylène-glycol de degré de poly-mèrisation 80 à 1400, avec un sel de calcium, suivie de la se-paration de l'adsorbat et de sa redissolution dans une solution aqueuse d'acide éthylène-diaminotétracétique ou de sel de sodium de cet acide.