FR2791698A1 - Procede pour la purification d'un virus ou antigene viral, et procede pour la production d'un vaccin - Google Patents
Procede pour la purification d'un virus ou antigene viral, et procede pour la production d'un vaccin Download PDFInfo
- Publication number
- FR2791698A1 FR2791698A1 FR0003558A FR0003558A FR2791698A1 FR 2791698 A1 FR2791698 A1 FR 2791698A1 FR 0003558 A FR0003558 A FR 0003558A FR 0003558 A FR0003558 A FR 0003558A FR 2791698 A1 FR2791698 A1 FR 2791698A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- virus
- viral antigen
- purification
- hydroxyapatite
- range
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24151—Methods of production or purification of viral material
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
L'invention concerne un procédé pour purifier un virus ou un antigène viral.L'échantillon le contenant est mis en contact avec de l'hydroxyapatite frittée, formée de particules poreuses, capable d'absorber ce virus ou cet antigène viral, puis le virus ou l'antigène viral est élué en utilisant un éluat dans la plage des pH neutres.Application : production d'un vaccin au moyen d'un tel procédé de purification.
Description
La présente invention a pour objet un procédé pour la purification d'un
virus ou d'un antigène viral, et un procédé pour la production d'un vaccin, en particulier un procédé pour séparer et purifier aisément un virus ou un antigène viral à partir d'une solution de culture contenant ce virus ou cet antigène viral, et un procédé pour la production d'un vaccin au moyen de ce
procédé de purification.
La séparation et la purification d'un virus ou antigène viral (appelé également ci-après "virus ou élément similaire") à partir d'une solution de culture, d'un milieu de culture et de cellules hôtes sont des étapes importantes dans les domaines du génie génétique, du diagnostic clinique et de la
production de vaccins.
En général, dans la solution de culture ou un milieu similaire, un virus ou un antigène viral n'existe pas seul, mais existe conjointement avec des cellules en culture et des protéines impures. Ainsi, il est nécessaire de séparer et de purifier seulement un virus ou antigène viral à partir de la solution de
culture ou d'un milieu similaire.
De manière classique, la séparation et la purification d'un virus ou antigène viral ont été effectuées en utilisant un procédé de séparation par ultracentrifugation ou un procédé de centrifugation en gradient de densité, ou bien un procédé similaire. Cependant, puisque ces procédés nécessitent des appareils coûteux et à grande échelle et des opérations complexes, le travail
imposé par ces procédés est très laborieux.
D'autre part, comme procédé pour extraire aisément un virus, il a été proposé un procédé utilisant la chromatographie sur une colonne d'hydroxyapatite (Sumiaki Tsuru et ai., Bio-Medical Materials and Engineering,
volume 1, pages 1-5, 1991).
Suivant ce procédé, un éluat à un pH d'approximativement 7 est utilisé, ce qui permet d'extraire un virus ou un élément similaire d'un échantillon
à un taux élevé d'extraction.
Cependant, on peut difficilement considérer que le virus extrait est séparé de manière satisfaisante des protéines impures. En conséquence, lorsque le virus extrait est utilisé pour la production d'un vaccin, une séparation par ultracentrifugation doit en outre être effectuée. Ainsi, il se pose un problème de la nécessité de mise en oeuvre d'une étape de purification supplémentaire
afin d'obtenir un virus de grande pureté.
En outre, comme autre procédé pour purifier aisément un virus, il a été proposé la chromatographie sur colonne dans laquelle de la silice est utilisée comme support solide. Dans ce procédé, un avantage consiste en la possibilité d'extraire un virus en une étape à partir d'une substance biologique telle qu'une solution de culture. Cependant, puisqu'un éluat dont le pH est élevé est utilisé, I'activation du virus est susceptible d'être réduite. En conséquence, dans ce procédé, il est très difficile de purifier efficacement le virus sans
diminuer son activation.
L'objectif de la présente invention consiste à proposer un procédé pour la purification d'un virus ou antigène viral, permettant de séparer et purifier aisément et rapidement un virus ou antigène viral à partir d'une solution de culture ou d'une solution émulsionnée avec des cellules, ou bien d'un milieu similaire contenant ce virus ou cet antigène viral, sans suppression ou diminution de l'activation du virus ou de l'antigène viral, et un procédé pour la
production d'un vaccin au moyen dudit procédé.
Afin d'atteindre l'objectif précité, la présente invention concerne un procédé pour la purification d'un virus ou antigène viral, qui comprend les étapes consistant: à mettre en contact un échantillon contenant un virus ou antigène viral avec de l'hydroxyapatite servant de support solide, ladite hydroxyapatite étant frittée à une température comprise dans l'intervalle d'environ 400 à environ 1300 C, et étant capable d'absorber le virus ou I'antigène viral; et à éluer le virus ou l'antigène viral absorbé par le support
solide en utilisant un éluant dans la plage des pH neutres.
L'hydroxyapatite frittée dans la plage de températures précitée a une structure poreuse comportant des pores de fin diamètre et un taux de porosité permettant de parvenir à une excellente capacité d'absorption virale, ce qui fait que seul un virus ou un antigène viral peut être purifié et séparé efficacement d'une protéine impure ou d'une substance similaire qui coexiste avec ce virus ou cet antigène viral dans l'échantillon. En outre, I'hydroxyapatite qui a été frittée dans la plage de températures précitée présente une résistance accrue, ce qui fait que l'hydroxyapatite ne s'affaisse pas bien qu'elle ait des pores suffisants pour absorber le virus ou l'antigène viral et, en outre, cette hydroxyapatite est suffisamment résistante à une pression appliquée lors du procédé de purification au moyen de la chromatographie sur colonne. En outre, en utilisant un éluat dans cette plage de pH neutres, un
virus dont l'activation est maintenue peut être obtenu en une grande pureté.
Dans ce cas, I'expression "plage de pH neutres" désigne une plage de pH
d'approximativement 6 à 7,5.
Dans la présente invention, il est préféré que l'hydroxyapatite soit formée de particules poreuses sphériques et que le diamètre moyen de particules de l'hydroxyapatite soit compris dans l'intervalle d'environ 10 à environ 100 pm. Dans ce cas, I'hydroxyapatite est de préférence formée de
particules poreuses.
En outre, il est préféré qu'une solution tampon soit utilisée comme éluat. Dans ce cas, de préférence, la solution tampon est une solution tampon à
base d'acide phosphorique.
Dans la présente invention, il est préféré que les dimensions du virus ou de l'antigène viral soient comprises dans l'intervalle d'environ 10 à environ 500 nm. En outre, de préférence, le virus ou l'antigène viral est obtenu à partir d'un animal ou de cellules en culture. De plus, de préférence, le virus ou l'antigène viral est multiplié dans des cellules cérébrales ou neurones de mammifères. Dans ce cas, le virus ou l'antigène viral peut être multiplié dans un
oeuf ou dans des cellules en culture.
Dans la présente invention, il est préféré que le virus consiste en
le virus de l'encéphalite japonaise ou un virus grippal.
En outre, dans la présente invention, il est préféré que le virus ou
l'antigène viral soit purifié par chromatographie sur colonne.
De plus, il est également préféré que la vitesse d'élution lors du procédé d'élution soit comprise dans l'intervalle d'environ 0,05 à environ
2 ml/minute.
Un autre aspect de la présente invention concerne un procédé pour la production d'un vaccin, comprenant: un procédé de purification au moyen du procédé de purification de virus ou d'antigène viral tel que défini supra; et un procédé pour inactiver le virus ou l'antigène viral purifié dans ce
procédé de purification.
Ces objectifs, caractéristiques et avantages, parmi d'autres, de la
présente invention apparaîtront plus nettement dans la description suivante de
la présente invention, basée sur les exemples, faite en regard des dessins annexés, sur lesquels: la figure 1 est un diagramme représentant le schéma d'élution du virus de l'encéphalite japonaise par le procédé de purification de virus ou
d'antigène viral de la présente invention.
La figure 2 est un diagramme représentant le schéma d'élution du virus de l'encéphalite japonaise par le procédé de purification de virus ou
d'antigène viral de la présente invention.
La figure 3 est un diagramme représentant le schéma d'élution du virus de l'encéphalite japonaise par le procédé de purification de virus ou
d'antigène viral de la présente invention.
La figure 4 est un diagramme représentant le schéma d'élution d'un virus grippal ou antigène de virus grippal par le procédé de purification de
virus ou d'antigène viral de la présente invention.
La figure 5 est un diagramme représentant le schéma d'élution d'un virus grippal ou antigène de virus grippal par le procédé de purification de
virus ou d'antigène viral de la présente invention.
La figure 6 est un diagramme représentant le schéma d'élution d'un virus grippal ou antigène de virus grippal par le procédé de purification de
virus ou d'antigène viral de la présente invention.
La figure 7 est un diagramme représentant le schéma d'élution du virus de l'encéphalite japonaise par le procédé de purification de virus ou
d'antigène viral de la présente invention.
La présente invention est caractérisée en ce qu'elle comprend un procédé dans lequel un échantillon contenant un virus ou antigène viral est mis en contact avec de l'hydroxyapatite frittée à une température comprise dans l'intervalle d'environ 400 à environ 1300 C, servant de support solide capable d'absorber le virus ou l'antigène viral, et un procédé dans lequel le virus ou l'antigène viral absorbé par le support solide est élué en utilisant un éluat dans
une plage de pH neutres.
Dans ce cas, I'expression "plage de pH neutres" désigne une plage de pH d'approximativement 6 à 7,5. En utilisant un éluat dans cette plage de pH neutres, un virus dont l'activation est maintenue peut être obtenu en une
grande pureté.
Dans la présente invention, comme support solide, on utilise de I'hydroxyapatite qui est frittée à une température de frittage comprise dans l'intervalle d'environ 400 à environ 1300 C, de préférence de l'hydroxyapatite frittée à une température comprise dans l'intervalle d'environ 950 à environ
1050 C.
L'hydroxyapatite frittée dans cette plage de températures a une structure poreuse ayant des pores de fin diamètre, et un taux de porosité lui conférant une excellente capacité d'absorption de virus, ce qui fait que seul un virus ou antigène viral peut être purifié et séparé efficacement d'une protéine impure ou d'une substance similaire qui coexiste avec le virus ou l'antigène viral dans l'échantillon. En outre, l'hydroxyapatite qui a été frittée dans la plage de températures précitée présente une résistance accrue, ce qui fait que l'hydroxyapatite ne s'affaisse pas, bien qu'elle ait des pores suffisants pour absorber le virus ou l'antigène viral et, en outre, cette hydroxyapatite est suffisamment résistante à une pression appliquée lors du procédé de
purification par chromatographie sur colonne.
Dans le cas o la température de frittage de l'hydroxyapatite est inférieure à environ 400 C, la capacité d'absorption de l'hydroxyapatite devient trop grande, ce qui conduit au cas o l'élution du virus ou de l'antigène viral dans le procédé d'élution décrit plus loin devient difficile, ou bien une protéine impure est également absorbée conjointement avec ce virus ou cet antigène viral. D'autre part, lorsque la température de frittage est supérieure à environ 1300 C, I'hydroxyapatite peut subir une décomposition thermique, ce qui fait
qu'elle devient inutilisable comme support solide.
En particulier, dans l'hydroxyapatite frittée à une température comprise dans l'intervalle d'environ 950 à environ 1050 C, le nombre de pores à former est limité, ce qui fait que l'absorption d'une protéine impure peut être restreinte. En outre, de préférence, I'hydroxyapatite utilisée dans la présente invention est formée de particules poreuses sphériques. Au moyen de la structure poreuse, la surface effective par volume unitaire de l'hydroxyapatite peut être rendue maximale, ce qui permet d'améliorer la capacité d'absorption
du virus.
En outre, dans le cas de la chromatographie sur colonne, il est possible de remplir le plus efficacement une colonne avec de l'hydroxyapatite à une haute densité, ce qui permet d'effectuer de manière plus stable la séparation du virus. D'autre part, même dans le cas o la colonne est remplie avec de l'hydroxyapatite à une haute densité, des espaces sont formés entre les particules en raison des formes sphériques de ces particules, ce qui permet de maintenir de manière satisfaisante la perméation d'un liquide servant d'éluat,
tel qu'une solution tampon.
L'hydroxyapatite a avantageusement un diamètre moyen de particules d'environ 10 à environ 100 pm et de préférence d'environ 40 à environ 80 pm. Dans le cas o le diamètre de particules est inférieur à environ pm, le passage du virus ou de l'antigène viral à travers les espaces entre les particules d'hydroxyapatite devient difficile, ce qui fait que la probabilité que le
virus ou l'antigène viral soit absorbé par l'hydroxyapatite peut être réduite.
D'autre part, si le diamètre de particules dépasse environ 100 pm, les espaces entre les particules deviennent trop grands, ce qui fait que la vitesse de passage du virus ou de l'antigène viral à travers les espaces des particules augmente, rendant difficile l'absorption du virus ou de l'antigène viral par l'hydroxyapatite. En outre, si les particules sont trop volumineuses, I'espace interstitiel entre particules (grains tassés) devient important. L'espace vide entre grains tassés dans la colonne peut entraîner la diffusion des plaques séparées
(ou bandes). Cet inconvénient affecte le pouvoir de séparation de la colonne.
En outre, il est préférable que l'hydroxy-apatite soit formée de particules poreuses. Si l'hydroxy apatite est formée de particules denses, ayant un petit nombre de pores, la surface spécifique par volume unitaire est faible, ce qui a pour résultat un cas o une capacité suffisante d'absorption de virus ne
peut être obtenue.
En ce qui concerne la porosité des particules d'hydroxyapatite, l'intervalle est de préférence compris entre environ 50 % et environ 80 %, et de
manière encore plus préférée entre environ 65 % et environ 75 %.
Si la porosité est trop élevée, il n'est pas possible d'obtenir un
pouvoir absorbant suffisant, en raison d'une aire spécifique relativement petite.
Par contre, si la porosité est trop faible, la résistance mécanique est susceptible
d'être affectée.
Les particules poreuses sphériques d'hydroxyapatite peuvent être produites par le procédé suivant. Tout d'abord, une suspension d'hydroxyapatite obtenue par un procédé en milieu humide, connu de manière générale, est mise sous forme de particules en étant directement séchée par pulvérisation, ce qui permet de former des particules poreuses sphériques. En variante, des particules poreuses sphériques peuvent être formées en ajoutant un additif tel qu'un régulateur de viscosité, des particules d'un composé organique apte à la décomposition thermique ou des fibres, ou bien une matière similaire à la suspension d'hydroxyapatite, avec ensuite un séchage par pulvérisation. Puis les particules poreuses sphériques ainsi produites sont frittées à une température comprise dans l'intervalle d'environ 400 à environ
1300 C, ce qui permet d'obtenir des particules sphériques poreuses.
Les dimensions du virus ou de l'antigène viral à purifier ne font pas l'objet de limitations particulières, mais sont comprises de préférence dans l'intervalle d'approximativement 10 à 500 nm. Le virus ou l'antigène viral dans cet intervalle peut être séparé et purifié de manière satisfaisante par le procédé
conformément à la présente invention.
De préférence, des exemples de virus à purifier comprennent un virus grippal ayant des dimensions d'approximativement 100 à 120 nm ou le virus de l'encéphalite japonaise ayant des dimensions d'approximativement 40 à 50 nm. En outre, des exemples d'antigène viral comprennent la protéine structurale du virus grippal, du virus de l'encéphalite japonaise, ou d'un virus similaire. Dans la présente invention, il est possible d'utiliser le virus ou l'antigène viral qui est obtenu par multiplication dans un animal ou des cellules en culture. Plus spécifiquement, par exemple, un virus multiplié dans les cellules cérébrales ou les neurones de mammifères, un virus multiplié dans un oeuf et un virus multiplié dans des cellules en culture, etc., peut être utilisé de préférence. En multipliant le virus dans un tel système, il est possible d'obtenir une grande quantité du virus, de manière constante. En outre, dans le cas o des cellules en culture sont utilisées pour la multiplication du virus, le virus peut être cultivé en présence d'une quantité relativement moindre d'impuretés, ce qui
a pour résultat une purification aisée du virus.
Comme mode opératoire pour la mise en contact du support solide formé d'hydroxyapatite avec le virus ou l'antigène viral dans le procédé de contact, il est possible d'utiliser sélectivement divers modes opératoires en fonction de la formation du support solide à utiliser et du volume de l'échantillon, ainsi que de paramètres similaires. Par exemple, un mode opératoire discontinu, dans lequel de l'hydroxyapatite est projetée dans un échantillon pour l'absorption du virus, ou bien un mode opératoire dans lequel un échantillon est introduit dans une colonne remplie d'hydroxyapatite peut être
utilisé sélectivement.
Puis le virus absorbé par l'hydroxyapatite servant de support solide est élué. Dans le procédé de la présente invention, un éluat dans la plage des pH neutres est utilisé pour collecter et séparer un virus désiré du support solide dans le procédé d'élution. Par exemple, dans le cas de la chromatographie sur colonne, les fractions contenant le virus désiré sont
extraites séparément.
Au moyen d'un tel éluat dans la plage des pH neutres, le virus peut être aisément élué, en outre, la diminution de l'activation ou la
dénaturation du virus peut être supprimée.
Comme éluat dans une telle plage de pH neutres, il est possible d'utiliser par exemple une solution tampon ayant une capacité tampon dans la plage de pH de 6 à 7,5. Des exemples d'une telle solution tampon comprennent une solution tampon à base d'acide phosphorique, une solution tampon à base d'acétate de sodium-acide acétique, une solution tampon à base d'acétate de sodium-acide chlorhydrique, une solution tampon à base de trisamino-méthane, etc. Parmi ces solutions, la solution tampon à base d'acide phosphorique est particulièrement préférable. La solution tampon à base d'acide phosphorique peut être utilisée comme solution tampon qui présente une action tampon à un pH d'approximativement 7, ce qui permet d'effectuer la séparation et la purification du virus, tout en maintenant l'activation de ce virus de manière
stable.
A cet égard, il est préféré, avant la mise en oeuvre du procédé d'élution à partir du procédé d'absorption du virus par l'hydroxyapatite, de laver cette hydroxy-apatite plusieurs fois en utilisant un éluat à une faible concentration en sel, afin d'éliminer une quantité aussi grande que possible des impuretés qui existent dans l'échantillon et qui ne sont pas absorbées par l'hydroxy-apatite. Des exemples de telles impuretés comprennent la matière broyée des cellules en culture, une partie des particules virales, une protéine
impure et des substances similaires qui existent dans l'échantillon.
L'élution du virus peut également être effectuée, par exemple, en augmentant la concentration de sel dans la solution tampon. La concentration de sel dans la solution tampon peut être accrue par une courbe d'augmentation linéaire ou incurvée. Par ce procédé, une substance peu absorbable, telle qu'une protéine, est tout d'abord éluée de l'hydroxyapatite. Cela signifie qu'il est possible de séparer sélectivement un virus désiré fortement absorbable par
I'hydroxyapatite de cette hydroxyapatite.
Comme procédé de purification du virus ou de l'antigène viral de la présente invention, il est possible d'utiliser un procédé discontinu, la chromatographie sur colonne ou un procédé similaire. Parmi ces procédés, la chromatographie sur colonne est particulièrement préférable car, par ce procédé de chromatographie sur colonne, le virus ou l'antigène viral peut être purifié à un taux d'extraction élevé et en une grande pureté, et la reproductibilité
de ce procédé est excellente.
Dans le cas o le virus ou l'antigène viral est séparé par chromatographie sur colonne, la vitesse du fluide s'écoulant lors de la mise en ceuvre du procédé d'élution est choisie convenablement en fonction de la capacité de l'échantillon et de la capacité de la colonne. Dans ce cas, il est préférable que la vitesse soit comprise dans l'intervalle d'environ 0,05 à environ
2 ml/min, de préférence d'environ 0,1 à environ 1 ml/min.
Si la vitesse du fluide est trop faible, ce fluide demande un temps relativement long pour que l'élution du virus se produise, avec pour résultat une diminution de l'activité du virus. D'autre part, si la vitesse du fluide est trop grande, la reproductibilité de l'efficacité de séparation du virus peut être détériorée. En outre, le procédé de production de vaccin de la présente invention est caractérisé par l'incorporation d'un procédé de purification de virus ou d'antigène viral conforme à la présente invention et d'un procédé pour
I'inactivation du virus ou de l'antigène viral purifié par ce procédé de purification.
Suivant le procédé de purification de vaccin de la présente invention, puisque le virus ou l'antigène viral est purifié à une grande pureté, le danger de contamination par d'autres microorganismes peut être réduit, ce qui permet de
produire un vaccin extrêmement sûr.
Dans le procédé d'inactivation du virus ou de l'antigène viral purifié par le procédé de la présente invention, l'inactivation peut être effectuée par
divers procédés, en fonction du type de vaccin à produire.
Le procédé de purification de virus ou d'antigène viral et le
procédé de production de vaccin de la présente invention ont été décrits ci-
dessus. Cependant, la présente invention n'est pas limitée à ces procédés. Par exemple, pour la purification du virus ou de l'antigène viral, il est possible d'utiliser un support solide dans lequel un ligand présentant une interaction spécifique biologique avec un virus cible est porté par la surface des particules
de la surface d'hydroxyapatite.
Exemples
Des exemples détaillés de la présente invention sont décrits ci-
dessous. 1. Purification d'un virus ou d'un antigène viral (Exemple 1) Une suspension d'hydroxyapatite obtenue par un procédé par voie humide (rapport molaire Ca/P égal à 1,67) a été mise sous forme de particules en étant directement séchée par pulvérisation, ce qui a produit des particules poreuses sphériques d'hydroxyapatite. Puis les particules poreuses sphériques ainsi produites ont été frittées à des températures respectives de 400 C, 700 C et 1000 C, et les particules poreuses sphériques frittées ont été ensuite calibrées pour obtenir des particules d'hydroxyapatite ayant un diamètre de particules de 40 pm. En utilisant des particules d'hydroxyapatite ainsi obtenues comme support solide, le virus de l'encéphalite japonaise a été purifié par
chromatographie sur colonne.
Comme échantillon, le virus de l'encéphalite japonaise a été multiplié dans un cerveau de souris, puis le cerveau a été extrait et une solution du cerveau émulsionné (émulsion de cerveau de souris infectée par le virus de
I'encéphalite japonaise) a été utilisée.
Sur un filtre ayant des pores d'un diamètre de 35 pm installé dans une seringue ayant un diamètre intérieur de 8 mm et une hauteur de 20 mm, 0, 45 g de particules d'hydroxyapatite obtenues par frittage à 400 C, 0,45 g de particules d'hydroxyapatite obtenues par frittage à 700 C et 0,9 g d'hydroxyapatite obtenue par frittage à 1000 C ont été introduits. Dans une colonne ainsi préparée, un volume de 0,1 ml de l'émulsion de cerveau de souris
infectée par le virus de l'encéphalite japonaise a été ajouté.
Puis une solution tampon à base d'acide phosphorique à pH 7 a été utilisée comme éluat pour l'élution du virus de l'encéphalite japonaise. La solution tampon d'acide phosphorique ayant un gradient linéaire de concentration d'acide phosphorique de 10 mM à 400 mM a été introduite dans la colonne à une vitesse du fluide de 0,5 ml par minute, ce qui a permis
d'effectuer l'élution.
La solution passée à travers la colonne a été extraite par fractions ayant chacune un volume de 1 ml, et l'activité biologique du virus de l'encéphalite japonaise dans chaque fraction a été calculée par un essai de formation de plages virales dans les cellules Vero (obtenues à partir du rein du singe vert africain). En outre, la teneur en protéine de chaque fraction a été étudiée au moyen du spectre d'absorption UV (280 nm). Les résultats sont
représentés sur les figures 1 à 3.
En outre, la protéine dans chaque fraction a été détectée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide au dodécylsulfate de sodium (SDS-
PAGE).
Comme le montrent nettement les figures 1 à 3 et les résultats de l'analyse SDS-PAGE (non illustrés), dans tous les cas, la plus grande partie de la protéine impure n'a pas été absorbée par l'hydroxyapatite, ou bien a été entraînée par la solution tampon d'acide phosphorique à une faible concentration. D'autre part, le virus de l'encéphalite japonaise a été absorbé énergiquement par l'hydroxyapatite et entraîné par la solution tampon d'acide phosphorique à une forte concentration, ce qui a permis de le séparer de
manière satisfaisante de la protéine impure.
En outre, le virus de l'encéphalite japonaise a été collecté pratiquement de la fraction n 8 à la fraction n 10 tout en maintenant le
caractère infectieux à une grande pureté, et un taux élevé de séparation.
(Exemple 2)
Comme dans l'Exemple 1, un virus grippal (antigène de virus grippal) a été purifié par chromatographie sur colonne en utilisant des particules d'hydroxyapatite ayant un diamètre de particules de 40 pm obtenues par frittage
à 400 C, 700 C et 1000 C, respectivement.
Comme échantillon, on a utilisé une solution préparée par un prétraitement prédéterminé d'un oeuf de poule fécondé dans lequel un virus
grippal avait été multiplié.
Une solution tampon d'acide phosphorique, identique à celle de l'Exemple 1 a été fournie à une vitesse du fluide de 0,1 ml/min, et la solution passée à travers la colonne a été extraite séparément par fractions ayant chacune un volume de 2 ml, et l'activité biologique du virus grippal dans chaque fraction a été calculée par l'essai de formation de plages virales dans des
cellules MDCK (cellules de rein de chien Madin-Darby).
En outre, la teneur en protéine de chaque fraction a été étudiée au
moyen d'un spectre d'absorption UV (280 nm).
De plus, un essai d'hémagglutination a été effectué pour chaque fraction, et la protéine HA qui consistait en un des antigènes viraux a été détectée. Les résultats sont représentés sur les figures 4 à 6. Comme le montrent nettement les figures 4 à 6, dans tous les cas, la plus grande partie de la protéine impure n'a pas été absorbée par I'hydroxyapatite, ou bien a été évacuée par la solution tampon d'acide phosphorique à une faible concentration. D'autre part, le virus grippal (antigène de virus grippal) a été absorbé énergiquement par l'hydroxyapatite, et a étéentraîné par la solution tampon d'acide phosphorique à une forte concentration,
ce qui a permis de le séparer de manière satisfaisante de la protéine impure.
En outre, le virus grippal a été collecté pratiquement de la fraction n 4 à la fraction n 5 en une grande pureté et un taux élevé de séparation, et il
a été trouvé qu'un tel virus grippal était doué d'activité biologique.
De plus, les résultats de l'essai d'hémagglutination étaient
également identiques aux résultats de l'essai de formation de plages virales.
(Exemple 3)
Le virus de l'encéphalite japonaise a été purifié de la même manière que dans l'Exemple 1, sauf que la couche claire supérieure des cellules en culture obtenues en soumettant des cellules C6/36 (cellules de moustique) à une inoculation du virus de l'encéphalite japonaise pour la
multiplication de ce virus a été utilisée.
Les résultats sont représentés sur la figure 7 (dans le cas de l'hydroxyapatite frittée à 1000 C). A cet égard, dans les cas o les températures de frittage étaient égales à 400 C et 700 C, des résultats
identiques à ceux représentés sur la figure 7 ont été obtenus.
Comme le montrent clairement la figure 7 et les résultats de l'analyse SDS-PAGE (non représentés), dans tous les cas, la plus grande partie de la protéine impure n'a pas été absorbée par l'hydroxyapatite ou a été entraînée par une solution tampon d'acide phosphorique à une faible concentration. D'autre part, le virus de l'encéphalite japonaise a été absorbé énergiquement par l'hydroxyapatite et a été entraîné par une solution tampon d'acide phosphorique à une forte concentration, ce qui a permis de le séparer
de manière satisfaisante de la protéine impure.
Le virus de l'encéphalite japonaise a été collecté près de la fraction n 9 à une grande pureté et avec un taux élevé de séparation et, ainsi, il a été constaté que ce virus de l'encéphalite japonaise était doué d'activité biologique. En outre, comparativement aux résultats de l'Exemple 1, le schéma d'élution du virus était net et, ainsi, il a été trouvé que la capacité de
séparation était excellente.
De plus, lorsque le virus a été purifié de la même manière que dans les Exemples 1 à 3 en utilisant de l'hydroxyapatite ayant un diamètre de particules de 80 pm obtenue aux températures de frittage respectives, des
résultats identiques à ceux des Exemples 1 à 3 ont été obtenus.
De la manière décrite ci-dessus, par le procédé de purification de virus ou d'antigène viral de la présente invention, il est possible d'obtenir efficacement, par des opérations simples, un virus ou antigène viral
extrêmement pur.
En outre, puisque le virus ou l'antigène viral séparé et purifié par le procédé de la présente invention conserve de manière satisfaisante son
activité biologique, il est possible de produire un vaccin efficace et sûr.
Enfin, il est entendu que le présent mémoire descriptif se réfère au sujet figurant dans la demande de brevet japonais n 11-073915 (déposé le 18 mars 1999), qui est expressément cité dans son intégralité à titre de
référence dans le présent mémoire.
Il va de soi que la présente invention n'a été décrite qu'à titre explicatif, mais nullement limitatif, et que de nombreuses modifications peuvent
y être apportées sans sortir de son cadre.
Claims (17)
1. Procédé pour la purification d'un virus ou d'un antigène viral, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant: - à mettre en contact un échantillon contenant un virus ou un antigène viral avec de l'hydroxyapatite servant de support solide, ladite hydroxyapatite étant frittée à une température comprise dans l'intervalle d'environ 400 à environ 1300 C, et étant capable d'absorber ce virus ou cet antigène viral; et - à éluer le virus ou l'antigène viral absorbé par le support solide en utilisant un
éluat dans la plage des pH neutres.
2. Procédé pour la purification d'un virus ou d'un antigène viral suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'hydroxyapatite est formée de
particules poreuses sphériques.
3. Procédé de purification d'un virus ou d'un antigène viral suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le diamètre moyen de particules d'hydroxyapatite est compris dans l'intervalle d'environ 10 à environ pm.
4. Procédé pour la purification d'un virus ou d'un antigène viral suivant la revendication 1, caractérisé en ce que l'hydroxyapatite est formée de
particules poreuses.
5. Procédé pour la purification d'un virus ou d'un antigène viral suivant la revendication 1, caractérisé en ce qu'une solution tampon est utilisée
comme éluat.
6. Procédé pour la purification d'un virus ou d'un antigène viral suivant la revendication 5, caractérisé en ce que la solution tampon est une
solution tampon à base d'acide phosphorique.
7. Procédé pour la purification d'un virus ou d'un antigène viral suivant la revendication 1, caractérisé en ce que les dimensions du virus ou de
l'antigène viral sont comprises dans l'intervalle d'environ 10 à environ 500 nm.
8. Procédé pour la purification d'un virus ou d'un antigène viral suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le virus ou l'antigène viral est
obtenu à partir d'un animal ou de cellules en culture.
9. Procédé pour la purification d'un virus ou d'un antigène viral suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le virus ou l'antigène viral est
multiplié dans des cellules cérébrales ou des neurones de mammifères.
10. Procédé pour la purification d'un virus ou d'un antigène viral suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le virus ou l'antigène viral est
multiplié dans un oeuf.
11. Procédé pour la purification d'un virus ou d'un antigène viral suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le virus est multiplié dans des
cellules en culture.
12. Procédé pour la purification d'un virus ou d'un antigène viral suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le virus est le virus de
l'encéphalite japonaise.
13. Procédé pour la purification d'un virus ou d'un antigène viral
suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le virus est un virus grippal.
14. Procédé pour la purification d'un virus ou d'un antigène viral suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le virus ou l'antigène viral est
purifié par chromatographie sur colonne.
15. Procédé pour la purification d'un virus ou d'un antigène viral suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la vitesse d'élution dans le procédé d'élution est comprise dans l'intervalle d'environ 0, 05 à environ
2 ml/min.
16. Procédé pour la purification d'un virus ou d'un antigène viral suivant la revendication 1, caractérisé en ce que la "plage des pH neutres" est
une plage de pH d'approximativement 6 à 7,5.
17. Procédé pour la production d'un vaccin, caractérisé en ce qu'il comprend: - un procédé de purification au moyen du procédé de purification de virus ou d'antigène viral répondant à la définition suivant l'une quelconque des
revendications 1 à 16; et
- un procédé d'inactivation du virus ou de l'antigène viral purifié dans le procédé
de purification.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11073915A JP2000262280A (ja) | 1999-03-18 | 1999-03-18 | ウィルスまたはウィルス性抗原の精製方法およびワクチンの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2791698A1 true FR2791698A1 (fr) | 2000-10-06 |
Family
ID=13531951
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR0003558A Pending FR2791698A1 (fr) | 1999-03-18 | 2000-03-20 | Procede pour la purification d'un virus ou antigene viral, et procede pour la production d'un vaccin |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2000262280A (fr) |
| DE (1) | DE10013017A1 (fr) |
| FR (1) | FR2791698A1 (fr) |
| GB (1) | GB2348886A (fr) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020064860A1 (en) | 2000-11-29 | 2002-05-30 | Schering Corporation | Method for purifying adenoviruses |
| CN101329955B (zh) * | 2007-06-22 | 2011-07-06 | 西门子公司 | 双操作手柄装置 |
| US8709780B2 (en) | 2008-09-30 | 2014-04-29 | Denka Seiken Co., Ltd. | Method for producing purified influenza virus antigen |
| JP2011097918A (ja) | 2009-10-07 | 2011-05-19 | Hoya Corp | 精製方法およびワクチンの製造方法 |
| CN103013932B (zh) * | 2012-12-26 | 2014-11-05 | 宁波大学 | 一种三疣梭子蟹呼肠孤病毒的快速纯化方法 |
| JPWO2021002257A1 (fr) * | 2019-07-04 | 2021-01-07 | ||
| US20230212530A1 (en) * | 2020-06-16 | 2023-07-06 | Hoya Technosurgical Corporation | Virus purification method using apatite column |
| JPWO2022044727A1 (fr) * | 2020-08-28 | 2022-03-03 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0313090A2 (fr) * | 1987-10-22 | 1989-04-26 | Asahi Kogaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Matériau céramique poreux |
| EP0337123A1 (fr) * | 1988-03-11 | 1989-10-18 | Kanto Kagaku Kabushiki Kaisha | Procédé de préparation de corps microsphériques frittés d'hydroxyapatite et matériau de garnissage chromatographique composé de corps microsphériques frittés d'hydroxyapatite |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL141130A0 (en) * | 1998-08-14 | 2002-02-10 | Merck & Co Inc | Process for purifying human papilloma virus-like particles |
-
1999
- 1999-03-18 JP JP11073915A patent/JP2000262280A/ja active Pending
-
2000
- 2000-03-17 DE DE10013017A patent/DE10013017A1/de not_active Withdrawn
- 2000-03-20 GB GB0006716A patent/GB2348886A/en not_active Withdrawn
- 2000-03-20 FR FR0003558A patent/FR2791698A1/fr active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0313090A2 (fr) * | 1987-10-22 | 1989-04-26 | Asahi Kogaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Matériau céramique poreux |
| EP0337123A1 (fr) * | 1988-03-11 | 1989-10-18 | Kanto Kagaku Kabushiki Kaisha | Procédé de préparation de corps microsphériques frittés d'hydroxyapatite et matériau de garnissage chromatographique composé de corps microsphériques frittés d'hydroxyapatite |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| TSURU S ET AL: "adsorption and preparation of human viruses using hydroxyapatite column", BIO-MEDICAL MATERIALS AND ENGINEERING, vol. 1, 1991, pages 143 - 147, XP002923260 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB2348886A (en) | 2000-10-18 |
| GB0006716D0 (en) | 2000-05-10 |
| JP2000262280A (ja) | 2000-09-26 |
| DE10013017A1 (de) | 2000-09-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103966277B (zh) | 一种固定化磷脂酶d催化制备磷脂酰丝氨酸的方法 | |
| EP0187586B1 (fr) | Perfectionnements aux procédés et appareils d'électrophorèse préparative | |
| FR2791698A1 (fr) | Procede pour la purification d'un virus ou antigene viral, et procede pour la production d'un vaccin | |
| JP2013513468A (ja) | 前処理済みバイオマス流の再生浄化 | |
| Zhang et al. | Algal fouling control in a hollow fiber module during ultrafiltration by angular vibrations | |
| CA2557174C (fr) | Procede de purificaton d'albumine comprenant une etape de nanofiltration, solution et composition a usage therapeutique la contenant | |
| CN100336818C (zh) | 一种高纯度蛋黄卵磷脂和脑磷脂的同时制备方法 | |
| ES2618069T3 (es) | Método para tratar un aceite comestible y el aceite obtenido de esta manera | |
| JP4297148B2 (ja) | 核酸回収装置及び核酸回収方法 | |
| CN104045725A (zh) | 采用d301g阴离子树脂精制桦褐孔菌粗多糖的方法 | |
| JPH10323543A (ja) | 微生物反応における生成物の分離方法 | |
| JP4537486B2 (ja) | 糠臭が取り除かれた米糠浸出物の製造方法、糠臭が取り除かれた米糠浸出物、及びγ−アミノ酪酸の製造方法 | |
| CN1211397C (zh) | 干燥蛋白质晶体的方法 | |
| CN107827843A (zh) | 一种紫杉烷类口服液及其制备方法 | |
| KR102307780B1 (ko) | 디아이소노닐 아디페이트 합성용 고정화 리파아제, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 디아이소닐 아디페이트 제조방법 | |
| RU2510278C1 (ru) | Способ получения сапонинсодержащих экстрактов (вариант) | |
| FR2690444A1 (fr) | Procédé de préparation d'une solution d'albumine plasmatique purifiée. | |
| RU2346941C2 (ru) | Способ выделения дигидрокверцетина из древесины лиственницы и установка для его осуществления | |
| CA2426698A1 (fr) | Procede de production de proteines par electropulsation | |
| RU2551319C2 (ru) | Способ деструкции рибонуклеиновых кислот | |
| EP0888131B1 (fr) | Procede pour eliminer les agents transmissibles non conventionnels d'une solution proteique | |
| CN108117597A (zh) | 一种新型鲮鱼胶原抗氧化肽的制备工艺 | |
| Sander et al. | L-phenylalanine ammonia-lyase and pisatin induction by 5-bromodeoxyuridine in Pisum sativum | |
| JP3836824B2 (ja) | 固定化酵素の再生方法 | |
| FR2475062A1 (fr) | Procede de production de glucose-isomerase immobilisee |