CN1211397C - 干燥蛋白质晶体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种起始于含水蛋白质晶体悬浮液的干燥蛋白质晶体的方法，包括在离心干燥器中干燥该蛋白质悬浮液，其中优选在蛋白质晶体悬浮液中滤出蛋白质晶体之后将其转到一种由水和可以任意比率与水混溶并具有比水更低蒸汽压的非水溶剂的混合物组成的干燥介质中。在该方法中，优选使用已用水润湿的干燥气体。优选将该蛋白质晶体悬浮液转化成流化床以进行干燥。

Description

干燥蛋白质晶体的方法

背景技术

蛋白质存在于多种商业可得的剂型中。尤其是，蛋白质作为活性成分存在于某些药剂中。为了制备这些剂型，宜于使用结晶形式的蛋白质。除了更为易于处理，干燥晶体形式的蛋白质尤其比溶解形式更为稳定。

因此，例如为了制备含有激素胰岛素作为活性成分的药剂，使用结晶形式的蛋白质胰岛素。例如结晶的胰岛素在-20℃下稳定若干年。

已知分子量达几十万道尔顿的蛋白质和具有较低分子量的多肽的结晶形式。这些蛋白质的氨基酸序列可以与天然产生的序列相同或可以相对于天然形式发生变化。这些蛋白质除了含有氨基酸链以外还可含有糖基或其它配基作为侧链。这些蛋白质可以是已从天然来源中分离的，或已通过基因工程或合成制备的，或已由这些方法的组合而获得的。

在水溶液中，蛋白质具有以特定的氨基酸链的空间折叠为基础的或多或少复杂的三维结构。蛋白质的完整结构是其生物活性所必需的。在从水溶液中结晶蛋白质的过程中，这种结构大部分被保留。蛋白质的晶体结构主要由其氨基酸序列决定，此外还决定于所包含的低分子量物质如金属离子盐和水分子。尤其某种数量的晶体内水分子(结晶水)的存在是这种蛋白质晶体结构稳定性所必需的。

因此，例如胰岛素晶体要求最佳的含水量(大约在1-7％之间)。如果晶体被过度干燥而获得的含湿量过低，则结晶水已从晶体中除去。其结果是胰岛素的化学稳定性受到不良的影响，例如导致形成较高分子量的化合物。推测胰岛素中较高分子量部分导致免疫学不相容反应。在极端的情况下，胰岛素可以变性至该晶体不再溶于含水介质的程度。另一方面，如果干燥获得太高含湿量的晶体，则在各个晶体之间存在太多的水。该胰岛素部分溶于该晶体间水。但是这种溶解的胰岛素的稳定性显然低于固体形式。

已知可以通过以下方法干燥蛋白质晶体，尤其是胰岛素晶体：通过过滤从晶体悬浮液中分离出晶体，并在0℃以上温度减压干燥滤饼。还已知在干燥前用乙醇取代晶体间水可以加快干燥的过程。在干燥期间，该晶体以薄层分配在干燥板上或在过滤器上振动。

在另一种方法中，蛋白质晶体如胰岛素晶体作为含水悬浮液在0℃以下温度凝结至干燥板上，然后减压冷冻干燥。

在上述的两种方法中，都不能充分保证在该干燥晶体中达到预定的或最佳的残留含湿量。在两种方法中，干燥过程被动态控制到最后并必须在适宜的时候结束以避免过度干燥。经验表明，确定结束干燥的正确时间点是困难的。晶体的最终含湿量不仅取决于干燥板的层厚度，还取决于该晶体的大小(或它们的表面积)。由于这种结晶方法导致胰岛素晶体具有或多或少宽的大小分布，在该动态控制方法中干燥的晶体由较干的小晶体和较潮的大晶体的混合物组成。

这些方法的另一缺点是难以对用于干燥的装置进行加料或排空。因此，加料和排空的操作仍主要要求手工工作，它带来了被细菌和异物粒子污染的风险。因此，现行有效的药典要求制备药剂的结晶胰岛素必须含有较少的细菌但不是无细菌。

发明内容

以下描述了一种干燥方法，其中所有的关键处理步骤在机器上(离心干燥器)先后发生。

1.从含水悬浮液中过滤出晶体

2.清洗滤饼

3.用干燥介质取代清洗液体

4.离心干燥滤饼

5.从过滤器上分离滤饼并将其转化成流化床

6.在流化床中用润湿的氮气流干燥该晶体

7.采用氮气压冲力将干燥晶体排空至凸缘容器

因此，本发明涉及一种起始于含水蛋白质晶体悬浮液的干燥蛋白质晶体的方法，它包括在离心干燥器上干燥该蛋白质晶体悬浮液。

在商购得到的离心干燥器上进行以下所述的实验。

为进行所述的干燥方法，如果将分离的滤饼转至流化床则特别有利。这些实验表明如果不用以下所述的一种干燥介质取代晶体间水，则不能产生流化床；实际上形成了各种大小的晶体聚集体的混合物，从而使得均匀干燥变得不可能。

其它的实验已表明，采用纯非水干燥介质如100％浓度的乙醇或100％浓度的丙醇取代晶体间水，由此在该蛋白质晶体中只存在晶体内水(结晶水)，则不能产生流化床。而在随后的干燥阶段，该干燥介质不能被充分的除去，即使在延长干燥时间之后也是如此。干燥产物中干燥介质的残留量大于5％。另一方面，某些结晶水已在干燥期间被除去。

令人惊奇的是，现在已发现采用由水和非水物质的混合物组成的干燥介质取代晶体间水有可能避免所述的缺点。在用以下所述的一种干燥介质取代晶体间水以后，有可能从分离的滤饼产生流化床并令人满意地干燥晶体。在采用润湿的干燥气体的条件下干燥大约1-4小时以后得到不含有晶体聚集体并具有小于0.1％残留非水物质含量的产物。

因此，本发明涉及一种起始于含水蛋白质晶体悬浮液的干燥蛋白质的方法，其特征尤其在于，在从蛋白质晶体悬浮液中滤出蛋白质晶体以后将其转到由水和可以任意比率与水混溶并具有比水更低蒸汽压的非水溶剂的混合物组成的干燥介质中。本发明干燥蛋白质晶体悬浮液的方法优选在离心干燥器中进行。

作为适宜的干燥介质组分的非水物质在约40℃的温度下具有低蒸汽压(即具有比水更低的蒸汽压)，与水以任意比例混溶，并在给定的条件下对蛋白质不具有化学活性。例如醇如甲醇、乙醇、正丙醇和异丙醇尤其好地满足这些条件。醇的混合物也是适宜的。

在干燥介质中，在适宜的与水混合物中，非水物质的含量约为10-80％，优选含量约为15-60％，进一步优选含量约为20-80％。

在所述的采用氮气作为干燥气体的干燥方法中，动态控制该干燥方法至最后，以致所述的缺点可能会发生。

采用润湿氮气作为干燥气体的试验已表明，在干燥阶段，停止了从晶体中去除水，并且在干燥的晶体中所获得的残余水含量取决于干燥气体中的水含量。也就是说，在干燥阶段结束时，在干燥气体的水含量和晶体的水含量之间建立了热力学平衡。因此，在干燥晶体中的残余水含量不取决于其大小(或表面积大小)。

此外，采用干氮气作为干燥气体的实验已表明不能充分地除去该干燥介质中的非水组分，即使在延长干燥时间以后。该干燥产物所具有的残留非水组分的含量大于1％。

令人惊奇的是，已发现在采用干燥气体的干燥蛋白质晶体的方法中，如果采用含水干燥气体，则可以除去干燥介质的非水组分至小于0.1％。该干燥方法优选在离心干燥器中进行。在该干燥蛋白质晶体的方法中，特别优选在从蛋白质晶体悬浮液中滤出蛋白质晶体以后将其转到由水和可以任意比率与水混溶并具有比水更低蒸汽压的非水溶剂的混合物组成的干燥介质中。在该方法中，特别优选在从蛋白质晶体悬浮液中滤出蛋白质晶体以后将其转化成流化床以进行干燥。

我们对所述的干燥方法进行的实验已表明如果采用不含有异物粒子的无菌晶体悬浮液，并无菌过滤洗涤水、干燥介质和干燥气体，以及对离心干燥器适宜地清洗和消毒，则得到不含有细菌和异物粒子的干燥产物。

本发明的方法特别适于干燥动物胰岛素、人胰岛素或其类似物的蛋白质晶体。

这里的胰岛素类似物指天然产生的胰岛素，即人胰岛素或动物胰岛素的衍生物，它由于至少一种天然产生的氨基酸残基被取代和/或至少一种氨基酸残基和/或有机基团的加成而不同于对应的否则的话相同天然来源的胰岛素。

以下尤其借助于实施例详细阐述了本发明的方法。

离心干燥器的构造和工作模式

该离心干燥器由水平安置的带整装壳的离心鼓组成。在该鼓内是与该鼓固定连接的圆柱形筛笼(Siebkorb)。该筛笼的多孔外壳表面和该鼓整装壳表面之间是径向分割成的多个小室。该鼓的后端面有开口，这样在该鼓旋转期间可以将气体(如干燥气体)从外面引入到室内，或可以将液体(如该晶体悬浮液的母液)从室内引到外面。在该鼓前部用与鼓一起旋转的活柱封闭。当该鼓静止时，该活柱可以是沿轴向移动。当该活柱退缩时，一个固定的圆形出口通道打开，该通道可通往该离心鼓的内部。在该鼓打开以后，该鼓可以再次缓慢旋转(为了排出该干燥产物)。

在该实验所用的离心干燥器中，离心鼓的直径为400mm，而圆柱形壳长度为200mm，该筛笼的过滤面积为0.25m2而孔大小为10μm。

当离心鼓旋转(475rpm)时，该离心机在轴向通过中空传动轴来加入产物(晶体悬浮液)，其中滤饼(晶体)在筛子上以层形式产生，滤液通过筛子被压进小室内，并在此通过该鼓的基底进入固定的外部空间。该滤液(结晶母液)通过排出口离开该离心机并被弃去。然后以相同的方式用水清洗滤饼。接着，以相同的方式使用一种实施例中给出的干燥介质取代清洗水。在该滤饼以较高转速(1200rpm)被离心干燥以后，以较低的转速(6rpm)通过吹入氮气将滤饼从筛子上分离出，将分离的产物转化成流化床并干燥。为此，将脉冲氮气流从外部(通过该鼓的底部开口)经过较低的鼓室和该筛子的下部进入该鼓的内部空间。干燥气体流经该产物的旋转流化床并通过该筛子的上部和上部鼓室离开该鼓。在干燥阶段完成以后，活柱缩回，借此打开圆形出口通道。氮气在低速度和压力波动下将该干燥产物推至排出通道内。在该排出通道的末端，旋流分离氮气并将干燥产物收集在储藏容器中。

在该干燥气体(氮气)进入该离心干燥器之前，在单独的装置内用无菌水蒸气将其润湿然后加热至干燥温度。调节温度和氮气流中的含水量。

具体实施方式

实施例1

在配备搅拌器的结晶容器中，往pH为5.5的水溶液中加入锌离子结晶出1000g的猪胰岛素。在结晶完成时，该悬浮液(大约100l)含有平均粒子大小为25μm的菱形晶体。如总体部分所述，将该搅拌的晶体悬浮液在30分钟内加入离心干燥器中。用约50l的水清洗该滤饼，然后用70％浓度的含水乙醇(干燥介质)取代该清洗水。在从筛子上分离出滤饼以后，在流化床中干燥晶体。在干燥期间，将干燥气体预热至40℃温度并调整含水量至4g水每1kg氮气。120分钟以后，完成干燥并将产物排空至储藏容器内。分析该干燥晶体表明残留的水含量为5％，而残留的乙醇含量小于0.1％。

实施例2

在配备搅拌器的结晶容器中，在无菌条件下往pH为5.5的水溶液中加入锌离子结晶出1500g的人胰岛素。在结晶完成时，该悬浮液(大约150l)含有平均粒子大小为20μm的菱形晶体。该离心干燥器在使用前依次用10％浓度的氢氧化钠溶液、无粒子的水、10％浓度的乙酸以及再用无粒子的水清洗。然后用无粒子水蒸气对离心干燥器消毒。如总体部分所述，将该搅拌的晶体悬浮液在约45分钟内转移至离心干燥器中。用约50l的水清洗该滤饼，然后用50％浓度的含水乙醇(干燥介质)取代该清洗水。已预先对两种液体进行无菌过滤。在从筛子上分离出滤饼以后，在流化床中干燥晶体。在干燥期间，将无菌过滤的干燥气体预热至40℃温度并调整含水量至3g水每1kg氮气。150分钟以后，完成干燥并将产物排空至储藏容器内。分析该干燥晶体表明残留的水含量为4％，而残留的乙醇含量小于0.1％。该产物不含有细菌和异物粒子。

实施例3

在配备搅拌器的结晶容器中，往pH为5.5的水溶液中加入锌离子结晶出1000g的人胰岛素。在结晶完成时，该悬浮液(大约100l)含有平均粒子大小为25μm的菱形晶体。如总体部分所述，将该搅拌的晶体悬浮液在30分钟内转至离心干燥器中。用约50l的水清洗该滤饼，然后用30％浓度的含水乙醇(干燥介质)取代该清洗水。在从筛子上分离出滤饼以后，在流化床中干燥晶体。在干燥期间，将干燥气体预热至40℃温度并调整含水量至5g水每1kg氮气。120分钟以后，完成干燥并将产物排空至储藏容器内。分析该干燥晶体表明残留的含水量为6％，而残留的乙醇含量小于0.1％。

实施例4

在配备搅拌器的结晶容器中，往pH为5.5的水溶液中加入锌离子结晶出1000g的猪胰岛素。在结晶完成时，该悬浮液(大约100l)含有平均粒子大小为30μm的菱形晶体。如总体部分所述，将该搅拌的晶体悬浮液在30分钟内转至离心干燥器中。用约50l的水清洗该滤饼，然后用72％浓度的含水丙醇(干燥介质)取代该清洗水。在从筛子上分离出滤饼以后，在流化床中干燥晶体。在干燥期间，将干燥气体预热至40℃温度并调整含水量至4g水每1kg氮气。140分钟以后，完成干燥并将产物排空至储藏容器内。分析该干燥晶体表明残留的水含量为5％，而残留的丙醇含量小于0.1％。

实施例5

在配备搅拌器的结晶容器中，往pH为6.3的水溶液中加入锌离子结晶出1500g的二精氨酸胰岛素(Di-Arg-Insulin)。在结晶完成时，该悬浮液(大约100l)含有平均粒子大小为20μm的晶体。如总体部分所述，将该搅拌的晶体悬浮液在约30分钟内转移至离心干燥器中。用约50l的水清洗该滤饼，然后用25％浓度的含水丙醇(干燥介质)取代该清洗水。在从筛子上分离出滤饼以后，在流化床中干燥晶体。在干燥期间，将干燥气体预热至40℃温度并调整含水量至3g水每1kg氮气。160分钟以后，完成干燥并将产物排空至储藏容器内。分析该干燥晶体表明残留的水含量为6％，而残留的丙醇含量小于0.1％。

实施例6

在配备搅拌器的结晶容器中，往pH为5.5的水溶液中加入锌离子结晶出1000g的人胰岛素。在结晶完成时，该悬浮液(大约100l)含有平均粒子大小为25μm的菱形晶体。如总体部分所述，将该搅拌的晶体悬浮液在约30分钟内转至离心干燥器中。用约50l的水清洗该滤饼，然后用15％浓度的含水正丙醇(干燥介质)取代该清洗水。在从筛子上分离出滤饼以后，在流化床中干燥晶体。在干燥期间，将干燥气体预热至40℃温度。在干燥时间开始时将干燥气体的含水量调整15％，并在干燥期间调整至8％。120分钟以后，完成干燥并将产物排空至储藏容器内。分析该干燥晶体表明残留的含水量为6％，而残留的丙醇含量小于0.1％。

Claims (11)

1.一种干燥蛋白质晶体的方法，包括在离心干燥器中干燥蛋白质晶体含水悬浮液，其中所述蛋白质晶体被干燥至1-7％的残余水含量，且其中所述蛋白质晶体是选自动物胰岛素、人胰岛素或其类似物的蛋白质晶体，其中使用在所述干燥方法之前已用水润湿的干燥气体。

2.权利要求1所要求的方法，包括：

a)向离心干燥器中加入蛋白质晶体悬浮液；

b)从所述蛋白质晶体悬浮液中过滤出蛋白质晶体；和

c)使所述蛋白质晶体与干燥介质接触至1-7％的残余水含量；所述干燥介质包括水和可以任意比率与水混溶并具有比水更低蒸汽压的非水溶剂。

3.权利要求2所要求的方法，其中所述溶剂在所述干燥介质中的比率为10-80％重量含量。

4.权利要求3所要求的方法，其中所述溶剂在所述干燥介质中的比率为15-60％重量含量。

5.权利要求2所要求的方法，其中所述溶剂为醇或醇的混合物。

6.权利要求5所要求的方法，其中所述溶剂为甲醇。

7.权利要求5所要求的方法，其中所述溶剂为乙醇。

8.权利要求5所要求的方法，其中所述溶剂为正丙醇。

9.权利要求5所要求的方法，其中所述溶剂为异丙醇。

10.权利要求1所要求的方法，其中所述干燥气体为氮气。

11.权利要求1-9之一项所要求的方法，其中在蛋白质晶体从蛋白质晶体悬浮液中滤出之后，将其转化成流化床以进行干燥。