CN101067132A - 一种凝血酶的提取分离方法 - Google Patents

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本发明涉及生物工程技术领域，更具体地说涉及一种凝血酶的提取分离方法。本发明是采用CaCl2激活凝血酶原成为凝血酶的同时加入(NH4)2SO4，使其生成CaSO4沉淀吸附凝血酶，以简化其生产工艺流程，缩短后续纯化的周期和降低成本。本发明提取方法简便易行，易于工业化生产，不通过离子交换层析和亲和层析等复杂步骤，而直接经过洗脱，超滤和冻干步骤，这样节省了成本和提取时间，由原来约需的7天时间缩短到2～3天。每立升血液可获得冻干凝血酶粉0.7g左右，其比活力约为100U/mg(蛋白)。

Description

一种凝血酶的提取分离方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，更具体地说涉及一种凝血酶的提取分离方法。
背景技术
凝血酶是一种丝氨酸蛋白水解酶，它催化纤维蛋白原中血纤维肽A和B的断裂，使之变为不溶性的血纤维蛋白，从而促使了血液的凝固。国内外对其作了大量的研究，并已作为一种新型速效局部止血药，应用于临床。一般提取分离方法是乙醇、丙酮和乙醚等的有机溶剂法，柠檬酸钡吸附法和氢氧化镁吸附法等。它们将其制备成凝血酶或凝血酶原的粗制品，然后再通过离子交换层析、凝胶层析和亲和层析等方法将其纯化、冻干获得了纯度较高的凝血酶，但是由于其制备工艺流程复杂，技术要求高，成本昂贵，不易广泛使用。
发明内容
本发明的目的是提供一种凝血酶的提取分离方法，采用CaCl2激活凝血酶原成为凝血酶的同时加入(NH4)2SO4，使其生成CaSO4沉淀吸附凝血酶，以简化其生产工艺流程，缩短后续纯化的周期和降低成本。
本发明有下述顺序的步骤：
a、以成牛血液或猪血液为原料，在此血液中加入3.8％的柠檬酸钠(W/V)作为抗凝剂，搅拌均匀，然后用4000转/分钟，离心20分钟，获得血浆；
b、将获得的血浆用去离子水稀释9～10倍(V/V)，用2mol/L醋酸调节pH值为5.30，在4～5℃下，静置10～12小时，再用4000转/分钟，离心20分钟，沉降后弃去上清液，获得凝血酶原沉淀；
c、将获得的凝血酶原沉淀，用含1.5％～2％CaCl2(W/V)的去离子水溶介凝血酶原，在4～5℃下放置1.5小时，然后用4000转/分钟，离心20分钟，沉降后弃去沉淀物，获得上清液；
d、将获得的上清液放在37℃水浴中搅拌，按体积加入10～15％(NH4)2SO4(W/V)，生成CaSO4沉淀吸附溶液中的凝血酶，静置30分钟左右，用4000转/分钟，离心20分钟，沉降后弃去上清液，收集沉淀物；
e、将收集的沉淀物用pH值为7.30的0.9％(W/V)生理盐水洗脱，然后用4000转/分钟，离心20分钟，沉降后弃去沉淀物获得凝血酶溶液；
f、将获得的凝血酶溶液用超滤器对其进行浓缩，冷冻干燥，获得白色的凝血酶冻干粉。
本发明的优点是：提取方法简便易行，易于工业化生产。在用CaCl2激活凝血酶原成为凝血酶的同时，加入(NH4)2SO4使其生成CaSO4沉淀吸附凝血酶，不通过离子交换层析和亲和层析等复杂步骤，而直接经过洗脱，超滤和冻干步骤，这样节省了成本和提取时间，由原来约需的7天时间缩短到2～3天。每立升血液可获得冻干凝血酶粉0.7g左右，其比活力约为100U/mg(蛋白)。
具体实施方式
实施例1
本发明有下述顺序步骤：
a、首先取牛血液1000mL为原料，在此血液中加入3.8％的柠檬酸钠(W/V)作为抗凝剂，搅拌均匀，在4℃以下用4000转/分钟，离心20分钟，获得血浆。
b、用去离子水将获得的血浆稀释9倍(V/V)，用2mol/L醋酸调节pH值为5.30，在4℃下，静置10小时，再用4000转/分钟，离心20分钟，沉降后弃去上清液，获得凝血酶原沉淀。
c、将获得的凝血酶原沉淀，用含1.5％CaCl2(W/V)的去离子水300毫升溶介凝血酶原，在4℃下放置1.5小时，然后用4000转/分钟，离心20分钟，沉降后弃去沉淀物，获得上清液。
d、将获得的上清液置于37℃水浴中搅拌，在搅拌的同时，缓慢地按体积加入10％的(NH4)2SO4(W/V)，使其与Ca++起化学反应，生成CaSO4沉淀
Figure A20061010494300051
，吸附溶液中的凝血酶，静置30分钟左右，用4000转/分钟，离心20分钟，沉降后弃去上清液，收集沉淀物。
e、将收集的沉淀物用100毫升pH值为7.30的0.9％生理盐水(W/V)洗脱，然后用4000转/分钟，离心20分钟，沉降后弃去沉淀物获得凝血酶溶液。
f、将获得的凝血酶溶液用超滤器对其进行浓缩，并去掉Ca++，NH+ 4离子，部分杂蛋白和杂菌等。冷冻干燥，就可获得白色的凝血酶冻干粉。
上述的CaCl2和(NH4)2SO4的顺序必须先加入CaCl2激活凝血酶原，然后加入(NH4)2SO4使其生成CaSO4沉淀才能吸附凝血酶。
实施例2
本发明有下述顺序步骤：
a、首先取牛血液1000mL为原料，在此血液中加入3.8％的柠檬酸钠(W/V)作为抗凝剂，搅拌均匀，在5℃以下用4000转/分钟，离心20分钟，获得血浆。
b、用去离子水将获得的血浆稀释10倍(V/V)，用2mol/L醋酸调节pH值为5.30，在5℃下，静置12小时，再用4000转/分钟，离心20分钟，沉降后弃去上清液，获得凝血酶原沉淀。
c、将获得的凝血酶原沉淀，用含2.0％CaCl2(W/V)的去离子水300毫升溶介凝血酶原，在5℃下放置1.5小时，然后用4000转/分钟，离心20分钟，沉降后弃去沉淀物，获得上清液。
d、将获得的上清液置于37℃水浴中搅拌，在搅拌的同时，缓慢地按体积加入15％的(NH4)2SO4(W/V)，使其与Ca++起化学反应，生成CaSO4沉淀
Figure A20061010494300061
，吸附溶液中的凝血酶，静置30分钟左右，用4000转/分钟，离心20分钟，沉降后弃去上清液，收集沉淀物。
e、将收集的沉淀物用100毫升pH值为7.30的0.9％生理盐水(W/V)洗脱，然后用4000转/分钟，离心20分钟，沉降后弃去沉淀物获得凝血酶溶液。
f、将获得的凝血酶溶液用超滤器对其进行浓缩，并去掉Ca++，NH+ 4离子，部分杂蛋白和杂菌等。冷冻干燥，就可获得白色的凝血酶冻干粉。
实施例3
本发明有下述顺序步骤：
a、首先取牛血液1000mL为原料，在此血液中加入3.8％的柠檬酸钠(W/V)作为抗凝剂，搅拌均匀，在4℃以下用4000转/分钟，离心20分钟，获得血浆。
b、用去离子水将获得的血浆稀释9倍(V/V)，用2mol/L醋酸调节pH值为5.30，在4℃下，静置11小时，再用4000转/分钟，离心20分钟，沉降后弃去上清液，获得凝血酶原沉淀。
c、将获得的凝血酶原沉淀，用含1.8％CaCl2(W/V)的去离子水300毫升溶介凝血酶原，在4℃下放置1.5小时，然后用4000转/分钟，离心20分钟，沉降后弃去沉淀物，获得上清液。
d、将获得的上清液置于37℃水浴中搅拌，在搅拌的同时，缓慢地按体积加入13％的(NH4)2SO4(W/V)，使其与Ca++起化学反应，生成CaSO4沉淀
Figure A20061010494300062
，吸附溶液中的凝血酶，静置30分钟左右，用4000转/分钟，离心20分钟，沉降后弃去上清液，收集沉淀物。
e、将收集的沉淀物用100毫升pH值为7.30的0.9％生理盐水(W/V)洗脱，然后用4000转/分钟，离心20分钟，沉降后弃去沉淀物获得凝血酶溶液。
f、将获得的凝血酶溶液用超滤器对其进行浓缩，并去掉Ca++，NH+ 4离子，部分杂蛋白和杂菌等。冷冻干燥，就可获得白色的凝血酶冻干粉。
实施例4
取猪血液1000mL为原料，该实施例的方法与实施例1相同，所不同的是原料为猪血，最后也获得白色的凝血酶冻干粉。
实施例5
取猪血液1000mL为原料，该实施例的方法与实施例2相同，所不同的是原料为猪血，最后也获得白色的凝血酶冻干粉。
最后冷冻干燥所得到的凝血酶是一种白色或类白色的冻干粉末，溶于水，水溶液澄清透明，但在室温下极易失活。冻干粉贮存在4℃左右较稳定。

Claims (1)

1、一种凝血酶的提取分离方法，该方法有下述顺序的步骤：
a、以成牛血液或猪血液为原料，在此血液中加入3.8％的柠檬酸钠(W/V)作为抗凝剂，搅拌均匀，然后用4000转/分钟，离心20分钟，获得血浆；
b、将获得的血浆用去离子水稀释9～10倍(V/V)，用2mol/L醋酸调节pH值为5.30，在4～5℃下，静置10～12小时，再用4000转/分钟，离心20分钟，沉降后弃去上清液，获得凝血酶原沉淀；
c、将获得的凝血酶原沉淀，用含1.5％～2.0％CaCl2(W/V)的去离子水溶介凝血酶原，在4～5℃下放置1.5小时，然后用4000转/分钟，离心20分钟，沉降后弃去沉淀物，获得上清液；
d、将获得的上清液放在37℃水浴中搅拌，按体积加入10～15％(NH4)2SO4(W/V)，生成CaSO4沉淀吸附溶液中的凝血酶，静置30分钟，用4000转/分钟，离心20分钟，沉降后弃去上清液，收集沉淀物；
e、将收集的沉淀物用pH值为7.30的0.9％生理盐水(W/V)洗脱，然后用4000转/分钟，离心20分钟，沉降后弃去沉淀物获得凝血酶溶液；
f、将获得的凝血酶溶液用超滤器对其进行浓缩，冷冻干燥，获得白色的凝血酶冻干粉。
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Assignee: Lanzhou min Hai Bioengineering Co., Ltd.

Assignor: Ma Zhongren|Yin Mingshan

Contract record no.: 2011640000012

Denomination of invention: Thrombin extracting and separating process

Granted publication date: 20090715

License type: Exclusive License

Open date: 20071107

Record date: 20110829

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Granted publication date: 20090715

Termination date: 20161117

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