JPH02227070A - 細胞分離材及び分離器 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 「利用分野」 本発明は、動植物細胞を分離する細胞分離材及び分離器
に係り、さらに詳しくは、動植物細胞の浮遊液中から目
的とする細胞をそのポピユレーションを変えずに分離し
うる細胞分離材及び分離器に関する。

「従来技術及びその問題点」 近年、医学や生化学の各分野において、臨床検査をはじ
めとして、一連の生体防御機構に関連した物質の基礎的
評価を行う免疫診断や免疫治療を目的として、様々な細
胞が混在する細胞浮遊液から特定の細胞群を分離するこ
とが行われている。

しかしながら、例えばリンパ球の中からＴ細胞、Ｂ細胞
、Ｋ細胞、ＮＫ細胞などを分離する場合に、目的とする
細胞のポピユレーションを変えずに迅速かつ低コストで
分離する方法はなく、その開発が強く望まれている。

特開昭５７−２０４４５４号及び同５６−１４０８８６
号公報には、酸性官能基を有する粒状体や微細孔を有す
る疎水性かつ水不溶性粒状体を利用して一段階の分離手
段でＴ細胞を獲得する手法が提案されている。しかしな
がら、この細胞分離方法では、粒状体の平均粒径が小さ
いので、カラムが詰まりやすく、細胞の回収率が一定し
ないばかりでな（、著しく低い。

また、現在、学術上、国際的に認められている細胞分離
材及び分離方法では、いずれも分離前の準備に多大の時
間がかかり、細心の処理過程を必要とし、操作が複雑で
時間と手間がかかり、使用材料の製造ロフトによって、
その分離能と分離パターン（細胞ポピユレーションのス
ペクトル）に大きな差異が生じて再現性に乏しいという
問題点がある。

さらに、特開昭６３−２８４号及び同６１−２３５７５
２号公報には、ハイドロキシ・カルシウム・アパタイト
顆粒を利用した一段階の分離手段でＴ細胞を獲得する手
法が提案されている。しかしながら、この分離方法では
、ハイドロキシ・カルシウム・アパタイト顆粒の混入は
さけられないし、ハイドロキシ・カルシウム・アパタイ
ト顆粒は、製造コストが高く、臨床検査などに用いるに
はあまり実用的でないという問題点がある。

さらに具体的には、デキストラン・セルを用いるセファ
デックスＧＩＯ法が知られている。この方法の原理は、
未だ完全には解明されていないが、細胞付着性の大小関
係が主役を演じていると考えられており、マクロファー
ジやサイズの大きい付着性のアクセサリ−細胞が吸着に
よって分離され、Ｔ細胞やＢ細胞は通過する。しかしな
がら、この方法では、非吸着性の小型アクセサリ−細胞
は通過してしまうし、また、Ｔ細胞のサブポピユレーシ
ョンのあるものは付着してしまうので、Ｔ細胞ポピユレ
ーションを完全な形で得ることができず、このことが免
疫診断上のネックポイントになっていた。

さらに、ナイロンウールを用いる分離カラムが知られて
いる。これは、Ｔ細胞に富む分離細胞群を得る手段とし
て使用されているが、ターゲット細胞の実質的収率は概
して低く、１２〜２５％と言われている。そして、比較
的純度の高いＴ細胞が得られるが、分離前の細胞浮遊液
中のＴ細胞ポピユレーションが通過後変わってしまうと
いう欠点を有している。この方法では、ナイロンウール
を秤量して用いるが、製造ロフトの違いや、ウールのほ
ぐし方やカラムへの詰め方、洗浄の仕方によって分離能
や分離パターンが変動する。

このように、細胞の吸着性を利用する細胞分離技術は、
現在、実用の緒についたばかりであり、分離方法の改良
や分離材の改良あるいは新素材の開発によって、−段と
高能率、高速度、高精度にすることが強く期待され、広
くバイオテクノロジーの分野や免疫診断学、免疫治療学
など、重要な医学分野において今後径々その改良発達が
要望されている。

「発明の目的」 本発明の目的は、細胞分離のための事前処理、事前操作
及び分離操作そのものを簡略化し、迅速で低コストで分
離を行うことができ、分離性能が著しく良好で、再現性
の高い分離を行いうる分離材及び分離器を提供すること
を目的とする。

「発明の構成」 本発明による細胞分離材は、平均孔径１０〜１０００μ
ｍの連続気孔を有するポリビニルアセタール樹脂から成
ることを特徴とする。

また、本発明による細胞の分離器は、平均孔径１０〜１
０００μｍの連続気孔を有するポリビニルアセタール樹
脂から成る分離材を充填したことを特徴とする。

本発明の分離材は、上記のように特定の気孔を有するポ
リビニルアセタール樹脂から成るものである。この分離
材の素材として使用しうるポリビニルアセタール樹脂畝
下記の式によりポリビニルアルコールの水酸基（一部又
は全部）をアルデヒドでアセタール化して得られる樹脂
である：Ｒ 〔式中Ｒはアルキル基を表す、〕 本発明に使用しうるポリビニルアセタール樹脂の具体例
としては、ポリビニルホルマール樹脂、ポリビニルブチ
ラール樹脂などが挙げられる。このようなポリビニルア
セタール樹脂は、公知の方法で製造することができ、例
えばポリ酢酸ビニルを加水分解すると同時にアセタール
化するか又はポリ酢酸ビニルを加水分解してポリビニル
アルコールを一旦分離してからアセタール化することに
よって得られる。いずれの方法においても、加水分解は
ほぼ完全に行い、ポリビニルアルコールのヒドロキシル
基の５０％以上がアセタール化されたポリビニルアセタ
ール樹脂として用いるのが好ましい。このアセタール化
率が５０％未満であると、培養液中などで樹脂自体の形
状を保持することが困難となり、また、吸着性も低下す
るので、ひいては分離能が低下することになる。なお、
ポリビニルアセタール樹脂の製造原料として用いるポリ
酢酸ビニルは、重合度２００〜２０００のものであるこ
とが好ましい。

本発明に用いるポリビニルアセタール樹脂は、平均孔径
ｌＯ〜１ｏｏｏμｍの連続気孔を有するものである。平
均孔径がｌ１０Ａｌ未満であると、対象細胞の大きさか
ら流れが悪く、詰まり易くなり、また、平均孔径が１１
０００ＩＩを超えると、吸着表面積の低下に起因して分
離能が低下するという問題が生じる。このような連続気
孔を有する樹脂は、発泡剤の存在で重合を行うなど、自
体公知の方法で製造することができる。

さらに、本発明による分離材は、上記のようなポリビニ
ルアセタール樹脂から成るものであるが、その形状はス
ポンジ状構造のシートであるのが好ましい。球状体など
では、常時均一な孔径を維持することは困難であるため
、分離器に充・填して細胞分離を行うときに詰まり易く
、また、均一な流速を保持できなくなることがあり、再
現性に問題が生じる。また、シート杖の分離材の場合に
は、例えばカラムに充填する際に、打ち抜き等の方法で
カラムの内径に相当する適切な直径の円板の形の分離材
を作製し、これをカラムに充填すればよいが、粒状の分
離材の場合には、その流出を防止するストレーナあるい
はフィルターを設置する必要がある。

本発明による分離器を使用して細胞の分離を実施する場
合には、予め洗浄液で洗浄した分離器に細胞の浮遊液を
注入し、本発明の分離材に浮遊液が充分に浸透したら、
洗浄液を流して未吸着の細胞などを洗い流し、回収する
。

分離操作に使用する洗浄液及び浮遊液としては例えばハ
ンクス培地、無血清培地等の培地、生理食塩水などが挙
げられる。また、分離操作は、浮遊液に含まれる細胞に
障害を及ぼさないように室温〜約３７℃の温度範囲で行
うのが好ましい。

本発明の分離器を用いて分離される細胞は、生存率や性
質において分離操作前と実質的に同一であり、例えばリ
ンパ球から分離されたＴ細胞は、抗体産生調節能などに
おいても分離操作前と変化が認められない。

このように、本発明による分離材及びこれを用いた分離
器によれば、細胞を免疫的に刺激することなく、従来法
に比べて極めて安定にかつインキュベートなどの複雑な
操作なしで分離して高い分離能を達成することができる
。また、インキュベートなどの複雑な操作を必要としな
いため、分離操作は著しく簡略化され、分離の所要時間
は従来法の数分の−あるいは十数分の−に短縮される。

すなわち、ワンステップ法での分離に利用でき、分離器
に直接細胞浮遊液を流し込むことができる。

さらに、ポリビニルアセタール樹脂は、安価でかつ分離
材のカラムへの装着は、極めて簡単で短時間でセットさ
れるので、低コストで済むし、装着後に滅菌（例えばエ
チレンオキシドガス滅菌など）して用いれば、実用上、
完全滅菌条件下で市場に提供することも極めて容易であ
る。

また、大量の細胞を処理するには、ポリビニルアセター
ル樹脂の断面積、気孔径の大きさ、充填高などを変える
ことにより、細胞浮遊液の通過速度を自在に制御するこ
とができる。

「発明の実施例」 以下、本発明を実施例に基づいてさらに説明するが、本
発明はこれに限定されるものではない。

第１図は、本発明の一実施態様を示す分離器の断面図で
ある６図示した分離器は、カラムｌ内に本発明の分離材
２を充填したものである。細胞の分離に当たって、カラ
ムｌの流入口３から細胞の浮遊液を流入すると、浮遊液
中の吸着性の細胞は分離材２に吸着され、非吸着性の細
胞を含む流出液は流出口４から流出する。

以下の実施例は、第１図に示した分離器を用いて行った
ものである。

実施例１ 内容積５Ｉｄのカラムに、平均孔径１００μｍでホルマ
ール化率８０〜８６％のポリビニルホルマール樹脂シー
トを２Ｉ１１になるように切断して充填し、細胞分離器
とした。この分離器の洗浄は、始め蒸留水を流し、次に
３７℃に保温したハンクス培地を流すことによって行っ
た。次に、予め比重遠心法により正常人末梢血から分離
した単核細胞をハンクス培地に浮遊させ、その０．２　
ｍｅを載せ、浸透させた後、ハンクス培地を用いて吸着
されていない細胞を流出させた。

この細胞分離器の分離能の評価を、次の三方法で行った
。その一つは、カラム通過前と通過後の細胞数をヘモサ
イトメーターを用いて数え、細胞の回収率を調べる方法
である。この結果を第１表に示す。

細胞分離状態を調べる第二の方法として、カラム通過後
の細胞を蛍光標識抗体、抗Ｌｅｕ　４、抗Ｌｅｕ１２で
ラベルし、Ｆ　Ａ　ＣＳ　（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　５ｏｒｔｅｒ）を用い
てＴ細胞及びＢ細胞の陽性率を測定した。結果を第２表
に示す。

第三の方法は、Ｔ細胞のポピユレーションを測定する方
法であり、カラム通過後の細胞を蛍光標識抗体、抗Ｌｅ
ｕ２ａ１抗Ｌｅｕ３ａでラベルし、ＦＡ　ＣＳ　（ｆｌ
ｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ
　５ｏｒｔｅｒ）を用いてＴ細胞のサプレッサー及びヘ
ルパーの陽性率を測定した。結果を第３表に示す。

さらに、カラム準備から分離終了までの所要時間を第４
表に示す。

実施例２ 内容積５ｍのカラムに、平均孔径５００μｍでホルマー
ル化率８０〜８６％のポリビニルホルマール樹脂シート
を２Ｉ１１になるように切断して充填し、細胞分離器と
した。

この細胞分離器を用いて、分離操、作及び分離能の評価
を実施例１と同様にして行った。分離能の評価結果を第
１表、第２表及び第３表に示し、分離所要時間を第４表
に示す。

実施例３ 内容積５ｔｅのカラムに、平均孔径１００μｍでブチラ
ール化率８０〜８６％のポリビニルブチラール樹脂シー
トを２ｄになるように切断して充填し、細胞分離器とし
た。

この細胞分離器を用いて、分離操作及び分離能の評価を
実施例１と同様にして行った０分離能の評価結果を第１
表、第２表及び第３表に示し、分離所要時間を第４表に
示す。

比較例１ ナイロンウールをよくほぐして多量の０．　Ｉ　ＮＨＣ
ｆｆｉ中に一夜浸漬しておき、翌日脱イオン水で数回も
み洗いし、その後、６０℃で３時間乾燥した。こうして
前処理したナイロンウール０．２５ｇを内容積５４のカ
ラムに約３−になるように充填し、細胞分離器とした。

細胞分離器の洗浄は、始め生理食塩水を流し、次に３７
℃に保温したハンクス培地を流すことによって行った。

次に、予め比重遠心法により正常人末梢血から分離した
単核細胞をハンクス培地に浮遊させ、その浮遊液０．２
　ｍを載せ、浸透させた後、３７℃で１時間インキュベ
ートした。その後、ハンクス培地を用いて吸着されてい
ない細胞を流出させた。

分離能の評価を実施例１と同様に行い、結果を第１表、
第２表及び第３表に示し、分離所要時間を第４表に示す
。

第１表　細胞の回収率 第３表　Ｔ細胞ポピユレーション（陽性率二％）第２表
　細胞分離状態（陽性率：％） 第４表　所要時間 （以下余白） これらの結果から明らかなとおり、本発明による分離材
を用いることにより、ナイロンウールを用いた場合より
著しく高い回収率と分離能が安定して達成され、分離さ
れたＴ細胞のポピユレーションもほとんど変化していな
いことが判る。また、ナイロンウールを用いた場合には
、長時間の洗浄や１時間のインキュベートを必要とする
のに、本発明の分離材を用いる場合には、それらの操作
は不要であるので、迅速な分離操作を行うことができる
。

上記の実施例には、Ｔ細胞の分離回収について記載した
が、本発明の分離材を他の細胞の分離に用いても、上記
と同様に良好な結果が得られる。

「発明の効果」 以上のように、本発明による特定孔径の連続気孔を有す
るポリビニルアセタール樹脂から成る細胞分離材は、従
来の分離材に比べて極めて安定にかつ高い分離能を有し
、しかも細胞のポピユレーションを変えずに細胞を分離
することができる。

さらに、本発明の分離材を用いれば、インキュベートな
どの複雑な操作を必要としないので、ワンステップ法を
利用し、直接細胞浮遊液を流し込むことができ、分離操
作を極めて簡易化することができ、分離所要時間を著し
く短縮することができる。

また、本発明の細胞分離材をシート状に成形しておけば
、カラム等の分離器の寸法及び形状に適合するように切
断することは極めて容易であり、カラム等の分離器への
装着及び装着後の滅菌も極めて容易であり、装着に当た
って特別なフィルターを必要としないという利点もある
。さらに、分離材の充填状態が均一であり、分離操作中
に目詰まりの起こる恐れがないので、常に均一な流速を
達成することができ、安定して効率のよい分離を達成す
ることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の一実施態様を示す細胞分離器の断面図
である。 符号の説明 １・・・カラム、２・・・細胞分離材、３・・・流入口
、４・・・流出口 特許出願人　　旭光学工業株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、平均孔径１０〜１０００μｍの連続気孔を有するポ
   リビニルアセタール樹脂から成ることを特徴とする細胞
   分離材。 ２、ポリビニルアセタール樹脂がアセタール化率５０〜
   １００％のものである請求項１記載の細胞分離材。 ３、ポリビニルアセタール樹脂が多孔質スポンジ状構造
   を有する請求項１又は２記載の細胞分離材。 ４、平均孔径１０〜１０００μｍの連続気孔を有するポ
   リビニルアセタール樹脂から成る細胞分離材を充填した
   ことを特徴とする細胞分離器。 ５、ポリビニルアセタール樹脂がアセタール化率５０〜
   １００％のものである請求項４記載の細胞分離器。 ６、ポリビニルアセタール樹脂が多孔質スポンジ状構造
   を有する請求項４又は５記載の細胞分離器。