CN105311014A - 丁烯基苯酞的用途及将其制备为医药组合物的方法 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明揭露一种将丁烯基苯酞、其类似物或上述成分的组合用于制备治疗或预防神经退化性疾病的医药组合物的用途,及将其制备为医药组合物的方法。所揭丁烯基苯酞具有降低细胞内β类淀粉样蛋白质浓度的能力,而能达到治疗或预防神经退化性疾病的功效。据此,通过本发明所揭医药组合物的制备方法,其将以高分子物质作为药物载体,将为活性成分的丁烯基苯酞包覆在高分子物质中,用以减缓或降低丁烯基苯酞的细胞毒性,达到提升医药组合物的安全性及治疗或预防神经退化性疾病的功效。
Description
技术领域
本发明涉及化合物的用途,特别涉及丁烯基苯酞的用途及将其制备为医药组合物的方法。
背景技术
阿兹海默症为全球发生率最高的神经退化性疾病,其主要的病理特征在于脑内有过量的β类淀粉样蛋白质(β-amyloidprotein,Aβ)沉积,形成Aβ斑块(plaque)(GlennerandWong1984;Masters,C.L.etal.,1985)以及细胞内缠结的神经纤维(neurofibrillarytangles,NFT)(Grundke-Iqbal,I.etal.,1986;Goedert,M.etal.,1988)。而Aβ斑块由淀粉样前驱蛋白质(amyloidproteinprecursor,APP),经过BACE酵素(β-siteamyloidprecursorproteincleavingenzyme)(Hussain,I.etal.,1999;Vassar,R.etal.,1999)以及γ分泌酶(γ-secretase)切割后所产生(Wolfe,M.S.etal.,1999;Yu,G.etal.,2000),主要包含有Aβ40以及Aβ42两种形式(Jarrett,J.T.etal.,1993)。当β类淀粉样蛋白质在细胞内外大量累积时,会成为神经细胞死亡的主要因素。
唐氏症患者为第21对染色体减数分裂时,染色体分离不均,导致细胞内多带一条染色体所致。而由于淀粉样前驱蛋白质的基因位于第21条染色体上(Rumble,B.etal.,1989;Selkoe,D.J.,1996),因而大多认为淀粉样前驱蛋白质过量表现会使唐氏症患者具有早发性认知障碍的症状(Burger,P.C.andF.S.Vogel,1973)。目前许多研究显示,Aβ斑块会出现在唐氏症患者的脑内(Masters,C.L.etal.,1985;Beyreuther,K.etal.,1992;Gyure,K.A.etal.,2001;Mori,C.etal.,2002)。另有研究指出,利用来自唐氏症患者的诱导型万能干细胞(inducedpluripotentstemcells,iPSCs)所产生的神经细胞,可用以重现典型阿兹海默症的病理特征,例如Aβ42及Aβ40的累积、高度磷酸化的Tau蛋白质等。因此,利用唐氏症患者的诱导型万能干细胞分化系统可用以作为筛选治疗或预防与β类淀粉样蛋白质相关神经退化性疾病的药物平台。
目前临床上治疗阿兹海默症的药物包含胆碱酯酶抑制剂(cholinesteraseinhibitors)(Birks,J.,2006)以及NMDA接受体拮抗剂(NMDAreceptorantagonist)(McShane,R.etal.,2006),而该两种药物皆适用以改善阿兹海默症患者认知功能,然而,对于由阿兹海默症所衍生的疾病,如忧郁、失眠等,须通过其他适合的药物进行治疗(Tariot,P.N.etal.,2004;Feldman,H.etal.,2006;Howard,R.etal.,2012),并且,该两种药物仅能用于改善症状,不能达到治愈阿兹海默症的功效(Farlow,M.R.etal.,2010)。除此之外,许多研究针对减低脑内Aβ的累积而设计治疗阿兹海默症的新药(Hong-Qi,Y.etal.,2012),具体来说,包含有BACE抑制剂(BACEinhibitors),例如MK-8931以及ACI-91(MullardA.,2012),或γ分泌酶抑制剂,例如LY450139(Siemers,E.etal.,2005)及BMS-708163(Tong,G.etal.,2012),或以免疫途径对抗Aβ的抗体等。
由此可知,如阿兹海默症的神经退化性疾病确实对于人体健康造成莫大的威胁,而基于目前临床上仍未有疗效较佳的药物,因此,开发治疗或预防神经退化性疾病的医药组合物是科学家的重要课题。
发明内容
本发明的主要目的在于提供丁烯基苯酞的用途,其用于制备治疗或预防神经退化性疾病的医药组合物。
为能达成上述目的,本发明揭露丁烯基苯酞、其类似物或上述成分的组合用于制备治疗或预防神经退化性疾病的医药组合物的用途。
较佳地,所述神经退化性疾病为脑内累积过量β类淀粉样蛋白质的病征。
较佳地,所述神经退化性疾病为阿兹海默症。
较佳地,所述丁烯基苯酞可自天然植物中萃取而得,例如伞形科植物、菊科植物等,其中,所使用的萃取技术为该技术领域且具通常知识者周知。
较佳地,所述丁烯基苯酞可由化学合成技术制备而得,其中,所使用的化学合成技术为该技术领域且具通常知识者周知的化学合成方法。
本发明的另一目的在于提供一种上述医药组合物的制备方法,其用以降低医药组合物内活性成分的细胞毒性,达到提升医药组合物安全性及减少副作用的功效。
为能达成该目的,本发明所揭一种医药组合物的制备方法,其将丁烯基苯酞与高分子物质以重量比1∶1~1∶2混合后,加入一极性有机溶剂及水,使丁烯基苯酞与高分子物质在水相通过分子间引力进行吸附作用而使该高分子物质包覆丁烯基苯酞,再去除该极性有机溶剂。
较佳地,所述极性有机溶剂为类杂环醚类化合物。
较佳地,所述极性有机溶剂为四氢呋喃(tetrahydrofuran)。
较佳地,所述高分子物质为F127高分子物质。
较佳地,所述去除该极性有机溶剂的方法为加热法。
本发明的有益效果为:
本发明所揭丁烯基苯酞能显著降低神经细胞内的Aβ40浓度,并且其效果类似于投予γ分泌素抑制剂DAPT,具有改善或减缓细胞内累积过量β类淀粉样蛋白质的能力。本发明所揭医药组合物制备方法能以高分子物质作为药物载体,减缓或降低丁烯基苯酞的细胞毒性,确实能有效提升医药组合物的安全性。而通过本发明的方法所制得的医药组合物具有降低细胞内β类淀粉样蛋白质浓度的功能,通过投予有效量的医药组合物至生物体,能达到治疗或预防神经退化性疾病的功效。
附图说明
图1为以包覆高分子物质F127的丁烯基苯酞及未包覆高分子物质F127的丁烯基苯酞进行细胞毒性试验的结果。
图2为T21诱导性万能干细胞进行神经分化培养的流程图。
图3为T21诱导性万能干细胞进行神经分化培养后,以免疫荧光染色分析观察其内N-cadherin表现的结果,其中,红色为经免疫荧光染色的N-cadherin,蓝色为以DAPI染色的细胞核。
图4为T21诱导性万能干细胞进行神经分化培养后,以免疫荧光染色分析观察其内nestin表现的结果,其中,绿色为经免疫荧光染色的nestin,蓝色为以DAPI染色的细胞核。
图5为T21诱导性万能干细胞进行神经分化培养后,以免疫荧光染色分析观察其内Pax-6蛋白质表现的结果,其中,红色为经免疫荧光染色的Pax-6蛋白质,蓝色为以DAPI染色的细胞核。
图6为T21诱导性万能干细胞进行神经分化培养后,以免疫荧光染色分析观察其内βIII微管蛋白质表现及神经突起生长情形的结果,其中,绿色为经免疫荧光染色的βIII微管蛋白质,蓝色为以DAPI染色的细胞核。
图7为经不同细胞所分化的神经细胞,分别以酵素连结免疫吸附分析法统计分析各细胞内Aβ40表现量的结果。
图8为T21诱导性万能干细胞所分化的神经细胞经不同处理条件进行培养后,以酵素连结免疫吸附分析法统计分析各细胞内Aβ40表现量的结果。
具体实施方式
本发明揭露丁烯基苯酞(butylidenephthalide,Bdph)的用途及将之制备为医药组合物的方法。由于丁烯基苯酞具有降低神经细胞内β类淀粉样蛋白质的含量,而过量累积β类淀粉样蛋白质在细胞内会导致神经退化性疾病,如阿兹海默症,因此,通过投予有效量的丁烯基苯酞至生物体中,能达到预防或治疗神经退化性疾病的功效。再者,本发明通过有机合成反应制备该医药组合物,通过如F127的高分子物质与丁烯基苯酞间产生共价键结,使高分子物质包覆丁烯基苯酞,达到减少医药组合物对于生物体细胞毒性的功效。
除非另有定义,在本发明的说明书及权利要求书所使用的技术及科学名词的意义,其与本发明所属技术领域且具通常知识者的一般理解相同。若有矛盾的情形,以本发明内容为准。
本发明所揭丁烯基苯酞的结构式为如式(I):其制备或取得方式为该所属技术领域且具通常知识者的一般知识,并且非本发明的技术特征,故在本发明不加以赘述。举例来说,中国专利申请第200910066666号中揭露丁烯基苯酞得以有机溶剂自伞形科或菊科植物萃取而得;中国专利公告第1041725C号揭露丁烯基苯酞以化学合成方式合成。
本发明所揭高分子物质F127,其为聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯的三嵌段聚合物,化学式如式(II):
其中,x、y、z分别为大于1的整数。由于高分子物质F127两端的聚氧乙烯具有亲水性,中段的聚氧丙烯属于疏水性,因此,高分子物质F127为两性物质。当高分子物质F127存在于水溶液中时,其会逐渐向界面扩散并吸附于界面上,使表面张力下降,并且,通过控制高分子物质内亲疏水基的比例,能达到控制高分子物质的表面活性。
本发明所揭“分子间引力”包含有,但不限于,范德华力、库伦作用力、氢键、疏水键力。
本发明所揭“医药组合物”一词包含一有效量的欲产生特定效果的所需化合物或活性成分,以及至少一药学上能接受的载体。如同本发明所属技术领域中具通常知识者所了解,医药组合物的型态可以随着欲引起特定效果的投予方式有所不同,如锭剂、粉剂、针剂等,并且,该载体也随着医药组合物的型态而可以为固态、半固态或液态。举例来说,载体包含,但不限于,明胶、乳化剂、烃类混合物、水、甘油、生理食盐水、缓冲生理盐水、羊毛脂、石蜡、蜂蜡、二甲基硅油、乙醇。
本发明所揭“有效量”一词指医药组合物内活性成分或化合物欲产生所求特定效果的量,通常以活性成分或化合物在医药组合物中所占重量百分比表示。如同本发明所属技术领域中具通常知识者所了解,该有效量会因为欲引起特定效果的投予方式而有所不同。一般来说,活性成分或化合物在组合物中的量可占该组合物重量的约1%至约100%,较佳为约30%至约100%。
本发明所揭“类似物”一词包含有化合物的盐类、其酯类、其结构异构物,如Z型结构或E型结构,或进行结构修饰后的产物。
本发明所揭“高分子物质”一词指通过聚合反应而生成具有相当高分子量的大分子,一般来说,高分子物质皆为有机分子。
以下,为能更进一步说明本发明的功效,将举若干实施例作详细说明,该等实施例为用以解说的例示,其中所使用的任何词汇并不限制本发明说明书及权利要求书的范围及意义。
实施例1:合成水相丁烯基苯酞
自美国西格玛奥瑞奇集团(Sigma-Aldrich)取得丁烯基苯酞(n-butylidenephthalide,Bdph,W333301)及F127高分子物质(PluronicF127,P2443)。将10毫克丁烯基苯酞与F127高分子物质以重量比1∶1或1∶2的比例混合后,溶于2毫升的四氢呋喃(tetrahydrofuran),再将之加入10毫升的水中,而后快速加热去除四氢呋喃,进行冷冻干燥。之后,再回溶于水,在溶液中乳化后的丁烯基苯酞微粒大小约为30~200nm,多分散指数(polydispersityindex)为0.2-0.5。
实施例2:细胞培养
将人类万能干细胞培养在无血清培养基Essential8TM(LifeTechnology公司,美国)中,并且以matrigelTM基质胶(Becton-Dickinson公司,美国)进行贴附培养。将培养液吸除,以磷酸盐缓冲液冲洗细胞2次后,加入酵素AccutaseTM(MerckMillipore公司,美国)反应2~5分钟后以培养液中和,并且将细胞冲刷下来后打散为小团块,进行离心1000rpm、2分钟,再吸除上清液,放入新培养皿中进行培养约3~5天,进行继代培养,且在培养期间须每天更换培养液。
实施例3:神经细胞分化
将人类万能干细胞培养至8-9分满,以磷酸盐缓冲液冲洗细胞2次后,以酵素AccutaseTM作用2~5分钟后,加入培养液稀释酵素,再将细胞冲洗下来,打散至适当大小后以800rpm的速度进行离心约2分钟,再将细胞置于含有20%替代血清(knockoutserumreplacement,简称KSR,LifeTechnology公司,美国)的DMEM-F12培养基,以无盖培养皿进行悬浮培养2天,获得类胚体(Embryonicbody)悬浮液。
将悬浮的类胚体至于离心管,待自然沉降后,去除上清液,以含有BiSF小分子药物的神经诱导培养基进行悬浮培养2天,而后,悬浮的类胚体会出现环状的上皮细胞结构,其中,小分子药物包含有0.5μM的BIO(Sigma-Aldrich公司,美国)、10ng/mL的纤维母细胞生长因子-2(FGF-2,Peprotech公司,美国)以及10μM的SB431542(Sigma-Aldrich公司,美国);神经诱导培养液的成分如下表1所示。
表1神经诱导培养液的成分
成分 | 含量(毫升) |
DMEM培养基(Life technologies公司,11965-092) | 326 |
F12培养基(Life technologies公司,11765-054) | 163 |
N2添加物(Life technologies公司,17502-048) | 5 |
非必需胺基酸(Life technologies公司,11140-035) | 5 |
肝素(1mg/mL) | 1 |
再将类胚体进行沉降后,放入含有10ng/mL的纤维母细胞生长因子-2的神经基础培养基中进行培养,其中,神经基础培养基的成分如下表2所示。悬浮2天后,待类胚体沉降后,以外力或酵素AccutaseTM将之打散至小团块,置于已涂布1%matrigelTM基质胶超过1小时的培养皿中进行细胞贴附。大约2~7天细胞会贴附、生长并且长出神经构造。而在细胞生长至7~8分满时进行分盘,其中,细胞分盘时使用磷酸盐缓冲液冲洗1次后,以磷酸盐缓冲液与酵素AccutaseTM以等比例混合的酵素溶液进行作用约2~5分钟,再以神经基础培养基稀释,而后使用细胞刮勺将细胞刮起并以机械力打散成为小团块或单细胞,进行800~1000rpm的离心约2~5分钟,再吸除上清液进行贴盘,并且贴盘时须加入10μM的Y27632(Stemgent公司,美国)1天,以帮助细胞贴附。
表2神经基础培养基的成分
成分 | 含量(毫升) |
神经基础培养基(Life technologies公司,21103-049) | 500 |
N2添加物(Life technologies公司,17502-048) | 5 |
非必需胺基酸(Life technologies公司,11140-035) | 5 |
肝素(1mg/mL) | 1 |
B27添加物(非必要)(Life technologies公司,17504-044) | 10 |
实施例4:细胞毒性试验
将人类胚胎干细胞TWl培养在Essential8TM培养基中,并且在继代时分为三组,分别在6孔盘放入1.2x105的细胞量以下述条件进行培养,其中,第一组为单纯以培养基进行培养;第二组在培养基中添加未包覆F127高分子物质的丁烯基苯酞,浓度为10μM;第三组在培养基中添加如实施例1所制得包覆F127高分子物质的丁烯基苯酞,浓度为10μM。在培养过程中观察各组细胞形态,并且于培养4~5天,进行细胞计数,每组重复1~3次,结果如图1所示,其中,图1的结果经单因子变异数分析(one-wayANOVA)及多重比较测定(Tukey’sMultipleComparisonTest分析)而得,P值小于0.05,95%信心水准,记号*表示在0.05的显著水准之下,记号**表示在0.01的显著水准之下。
由图1的结果可知,在培养5天后,第二组的细胞数量显著少于第一组或第三组的细胞数量。由此可知,丁烯基苯酞会对细胞具有较高的细胞毒性,而通过包覆高分子物质F127可有效减少丁烯基苯酞的细胞毒性。
实施例5:T21诱导性万能干细胞进行神经细胞分化培养
请参阅实施例2及图2,将T21诱导性万能干细胞(T21-iPSCs)依据实施例2所述进行神经分化,并且在第8天进行贴附。在细胞贴附后第12天进行免疫荧光染色分析,用以观察神经干细胞标的,包含N-cadherin、Nestin以及Pax-6蛋白质的表现,结果如图3至图5所示。另观察T21诱导性万能干细胞进行神经分化培养后的神经突起生长状况,在培养第27天以免疫荧光染色分析,通过Tui-1抗体观察其内如βIII微管蛋白质(tubulin)的成熟神经标记的表现,结果如图6所示。
而免疫荧光染色分析的操作流程如下:将细胞培养在盖玻片的4孔培养皿,进行染色时,先将细胞培养液吸除后,以磷酸盐缓冲液冲洗2次后,加λ4%的三聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)在冰上作用5分钟进行细胞固定后移除,再以磷酸盐缓冲液冲洗3次后,加λ0.3%的triton(PBST)在冰上作用10分钟进行打洞,再以磷酸盐缓冲液冲洗3次后,加入浓度为5%的马血清进行阻断(blocking)1小时,吸除液体并加入配置于浓度为3%马血清的一级抗体,室温下作用4小时或在4℃反应16小时。之后,吸除一级抗体并以PBST冲洗液冲洗3次,每次5分钟。二级抗体配置在磷酸盐缓冲中,吸除PBST后加入二级抗体并避光作用1小时后再以PBST冲洗液冲洗3次,加入浓度为1μg/mL的细胞核染剂DAPI室温避光作用10分钟,而后以PBST冲洗液冲洗2次,再以甘油与磷酸盐缓冲液等比例混合成的溶液200μL浸湿后,进行挑片,封片后在正立荧光显微镜下观察荧光。
由图3至图5的结果可知,T21诱导性万能干细胞在神经细胞分化培养第12天时会表现N-cadherin、Nestin及Pax-6神经干细胞特殊蛋白质,显示T21诱导性万能干细胞以上述培养基进行培养后能成功分化成为T21神经细胞。再者,由图6的结果可知,T21诱导性万能干细胞经过27天的培养分化后,其具有大量神经突起,并且能表现为成熟神经标的的βIII微管蛋白质,显示T21诱导性万能干细胞经过27天的分化培养化成为成熟的T21神经细胞。
实施例6:神经细胞的Aβ40表现量
将贴附培养的T21诱导性万能干细胞所分化的神经细胞进行细胞计数后,贴盘在4孔培养皿中,每48小时更换一次培养液,将每48小时收集的培养液保存在-20℃,通过酵素连结免疫吸附分析法(ELISA)进行Aβ40表现量的分析,并且使用核型正常的人类胚胎干细胞TW1分化的神经细胞作为控制组,其中,每组试验重复2或3次。分析结果如图7所示。
而酵素连结免疫吸附分析法的操作流程如下:以培养缓冲液(workingincubationbuffer)将ELISA套组的Aβ标准蛋白进行序列稀释,用以作为标准曲线。将收取的细胞培养液与该培养缓冲液以1∶2的比例进行稀释。分别取100μL的标准品溶液及样本放λ96孔盘中,置于4℃、16小时。吸除液体后,以300μL冲洗孔盘,并且晾干。加λ200μL的TMB受质,室温避光反应约40~45分钟后,读取620nm的吸光值。
由图7的结果可知,在分化第20天开始,由T21诱导性万能干细胞所分化的神经细胞内Aβ40表现量开始高于由人类胚胎干细胞TW1所分化的神经细胞,并且在分化第25天开始出现差异。详言之,由T21诱导性万能干细胞所分化的神经细胞内Aβ40表现量,在分化第25天时为105.38pg/mL,在分化第30天时为155.68pg/mL,并在分化第42天时为264.47pg/mL。
据此可知,由T21诱导性万能干细胞所分化的神经细胞内Aβ40表现量会随着分化时间增加而显著上升,因而能作为用以筛选治疗或预防神经退化性疾病的平台。
实施例7:药物筛选
将T21诱导性万能干细胞进行神经分化培养至第39天时分为三组,分别给予不同培养条件后,再进行培养3天,即在第42天时,以酵素连结免疫吸附分析各该组内的Aβ40浓度,并且与未进行神经分化培养的T21诱导性万能干细胞比较,结果如图8所示,其中,第一组为未进行神经分化培养的T21诱导性万能干细胞;第二至四组为进行神经分化培养的T21诱导性万能干细胞,而第二组在培养过程中末添加任何药剂,第三组在培养第39天时添加γ分泌素抑制剂DAPT,第四组在培养第39天时添加10μM的包覆F127高分子物质的丁烯基苯酞。每组试验进行2~3次,并且以单因子变异数分析及多重比较测定分析数值是否存在显数差异,其中,P值小于0.05,95%信心水准,记号*表示在0.05的显著水准之下,记号**表示在0.01的显著水准之下。
由图8的结果可知,第一组的Aβ40浓度显著低于第二组的Aβ40浓度,而第三组及第四组的Aβ40浓度分别较第二组下降。由此可知,本发明所揭丁烯基苯酞能显著降低神经细胞内的Aβ40浓度,并且其效果类似于投予γ分泌素抑制剂DAPT。据此,本发明所揭丁烯基苯酞确实具有改善或减缓细胞内累积过量β类淀粉样蛋白质的能力,而能达到治疗或预防神经退化性疾病的功效。
通过上述实施例的说明,本发明所揭医药组合物制备方法能以高分子物质作为药物载体,减缓或降低丁烯基苯酞的细胞毒性,确实能有效提升医药组合物的安全性。而通过上述方法所制得的医药组合物确实具有降低细胞内β类淀粉样蛋白质浓度的功能,因此,通过投予有效量的医药组合物至生物体,能达到治疗或预防神经退化性疾病的功效。
以上仅是通过各该实施例详细说明本发明,熟知该技术领域者在不脱离本发明精神下,而对于说明书中的实施例所做的任何简单修改或是变化,均应为本案权利要求所涵摄。
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Claims (11)
1.一种将丁烯基苯酞、其类似物或上述成分的组合用于制备治疗或预防神经退化性疾病的医药组合物的用途。
2.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述神经退化性疾病为脑内累积过量β类淀粉样蛋白质的病征。
3.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述神经退化性疾病为阿兹海默症。
4.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述丁烯基苯酞萃取自伞形科植物。
5.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述丁烯基苯酞萃取自菊科植物。
6.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述丁烯基苯酞或其类似物由化学合成技术所制备而得。
7.一种医药组合物的制造方法,其特征在于,将丁烯基苯酞与高分子物质以重量比1∶1~1∶2混合后,依序加入一极性有机溶剂及水,使丁烯基苯酞与高分子物质在水相通过分子间引力进行吸附作用而使该高分子物质包覆丁烯基苯酞,再去除该极性有机溶剂。
8.如权利要求7所述的制造方法,其特征在于,所述极性有机溶剂为类杂环醚类化合物。
9.如权利要求8所述的制造方法,其特征在于,所述极性有机溶剂为四氢呋喃。
10.如权利要求7所述的制造方法,其特征在于,所述高分子物质为F127高分子物质。
11.如权利要求7所述的制造方法,其特征在于,去除所述极性有机溶剂的方法为加热法。
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