TWI554270B - Butenyl phthalide and a process for preparing it as a pharmaceutical composition - Google Patents

Description

丁烯基苯酞之用途及將其製備為醫藥組合物之方法

本發明係有關於化合物之用途，特別係指丁烯基苯酞之用途及將其製備為醫藥組合物之方法。

按，阿茲海默症係為全球發生率最高之神經退化性疾病，其主要之病理特徵係在於腦內有過量之β類澱粉樣蛋白質(β-amyloid protein,Aβ)沈積，形成Aβ斑塊(plaque)(Glenner and Wong 1984；Masters,C.L.et al.,1985)以及細胞內纏結之神經纖維(neurofibrillary tangles，NFT)(Grundke-Iqbal,I.et al.,1986；Goedert,M.et al.,1988)。而Aβ斑塊係由澱粉樣前驅蛋白質(amyloid protein precursor，APP)，經過BACE酵素(β-site amyloid precursor protein cleaving enzyme)(Hussain,I.et al.,1999；Vassar,R.et al.,1999)以及γ分泌酶(γ-secretase)切割後所產生(Wolfe,M.S.et al.,1999；Yu,G.et al.,2000)，主要包含有Aβ40以及Aβ42兩種形式(Jarrett,J.T.et al.,1993)。當β類澱粉樣蛋白質於細胞內外大量累積時，會成為神經細胞死亡之主要因素。

唐氏症患者係為第21對染色體減數分裂時，染色體分離不均，導致細胞內多帶一條染色體所致。而由於澱粉樣前驅蛋白質之基因位於第21條染色體上(Rumble,B.et al.,1989；Selkoe,D.J.,1996)，因而 大多認為澱粉樣前驅蛋白質過量表現會使唐氏症患者具有早發性認知障礙之症狀(Burger,P.C.and F.S.Vogel,1973)。目前許多研究顯示，Aβ斑塊係會出現於唐氏症患者之腦內(Masters,C.L.et al.,1985；Beyreuther,K.et al.,1992；Gyure,K.A.et al.,2001；Mori,C.et al.,2002)。另有研究指出，利用來自唐氏症患者之誘導型萬能幹細胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)所產生之神經細胞，得用以重現典型阿茲海默症之病理特徵，例如Aβ42及Aβ40之累積、高度磷酸化之Tau蛋白質等。因此，利用唐氏症患者之誘導型萬能幹細胞分化系統可用以作為篩選治療或預防與β類澱粉樣蛋白質相關神經退化性疾病之藥物平台。

目前臨床上治療阿茲海默症之藥物包含膽鹼酯酶抑制劑(cholinesterase inhibitors)(Birks,J.,2006)以及NMDA接受體拮抗劑(NMDA receptor antagonist)(McShane,R.et al.,2006)，而該兩種藥物皆適用以改善阿茲海默症患者認知功能，然而，對於由阿茲海默症所衍生之疾病，如憂鬱、失眠等，須藉由其他適合之藥物進行治療(Tariot,P.N.et al.,2004；Feldman,H.et al.,2006；Howard,R.et al.,2012)，並且，該兩種藥物僅能用於改善症狀，不能達到治癒阿茲海默症之功效(Farlow,M.R.et al.,2010)。除此之外，許多研究係針對減低腦內Aβ之累積而設計治療阿茲海默症之新藥(Hong-Qi,Y.et al.,2012)，具體來說，包含有BACE抑制劑(BACE inhibitors)，例如MK-8931以及ACI-91(Mullard A.,2012)，或γ分泌酶抑制劑，例如LY450139(Siemers,E.et al.,2005)及BMS-708163(Tong,G.et al.,2012)，或以免疫途徑對抗Aβ之抗體等。

由此可知，如阿茲海默症之神經退化性疾病確實對於人體健 康造成莫大之威脅，而基於目前臨床上仍未有療效較佳之藥物，是以，開發治療或預防神經退化性疾病之醫藥組合物乃係科學家之重要課題。

本發明之主要目的即在於提供丁烯基苯酞之用途，其係用於製備治療或預防神經退化性疾病之醫藥組合物。

為能達成上述目的，本發明係揭露丁烯基苯酞、其類似物或上述成份之組合用於製備治療或預防神經退化性疾病之醫藥組合物之用途。

較佳地，該神經退化性疾病係為腦內累積過量β類澱粉樣蛋白質之病徵。

較佳地，該神經退化性疾病係為阿茲海默症。

較佳地，丁烯基苯酞係得自天然植物中萃取而得，例如傘形科植物、菊科植物等，其中，所使用之萃取技術係為該技術領域且具通常知識者周知者。

較佳地，丁烯基苯酞係得由化學合成技術所製備而得，其中，所使用之化學合成技術乃係該技術領域且具通常知識者周知之化學合成方法。

本發明之另一目的係在於提供一種上述醫藥組合物之製備方法，其係用以降低醫藥組合物內活性成份之細胞毒性，達到提昇醫藥組合物安全性及減少副作用之功效。

為能達成另該目的，本發明所揭一種醫藥組合物之製備方法，其係將丁烯基苯酞與高分子物質以重量比1：1~1：2混合後，加入一 極性有機溶劑及水，令丁烯基苯酞與高分子物質於水相透過分子間引力進行吸附作用而使該高分子物質包覆丁烯基苯酞，再去除該極性有機溶劑。

較佳地，該極性有機溶劑係為類雜環醚類化合物。

較佳地，該極性有機溶劑為四氫呋喃(tetrahydrofuran)。

較佳地，該高分子物質係為F127高分子物質。

較佳地，去除該極性有機溶劑之方法係為加熱法。

第一圖係為以包覆高分子物質F127之丁烯基苯酞及未包覆高分子物質F127之丁烯基苯酞進行細胞毒性試驗之結果。

第二圖係為T21誘導性萬能幹細胞進行神經分化培養之流程圖。

第三圖係為T21誘導性萬能幹細胞進行神經分化培養後，以免疫螢光染色分析觀察其內N-cadherin表現之結果，其中，紅色為經免疫螢光染色之N-cadherin，藍色為以DAPI染色之細胞核。

第四圖係為T21誘導性萬能幹細胞進行神經分化培養後，以免疫螢光染色分析觀察其內nestin表現之結果，其中，綠色為經免疫螢光染色之nestin，藍色為以DAPI染色之細胞核。

第五圖係為T21誘導性萬能幹細胞進行神經分化培養後，以免疫螢光染色分析觀察其內Pax-6蛋白質表現之結果，其中，紅色為經免疫螢光染色之Pax-6蛋白質，藍色為以DAPI染色之細胞核。

第六圖係為T21誘導性萬能幹細胞進行神經分化培養後，以免疫螢光染色分析觀察其內βⅢ微管蛋白質表現及神經突起生長情形之結 果，其中，綠色為經免疫螢光染色之βⅢ微管蛋白質，藍色為以DAPI染色之細胞核。

第七圖係為經不同細胞所分化之神經細胞，分別以酵素連結免疫吸附分析法統計分析各細胞內Aβ40表現量之結果。

第八圖係為T21誘導性萬能幹細胞所分化之神經細胞經不同處理條件進行培養後，以酵素連結免疫吸附分析法統計分析各細胞內Aβ40表現量之結果。

本發明係揭露丁烯基苯酞(butylidenephthalide，Bdph)之用途及將之製備為醫藥組合物之方法。由於丁烯基苯酞係具有降低神經細胞內β類澱粉樣蛋白質之含量，而過量累積β類澱粉樣蛋白質於細胞內會導致神經退化性疾病，如阿茲海默症，因此，藉由投予有效量之丁烯基苯酞至生物體中，能達到預防或治療神經退化性疾病之功效。再者，本發明係藉由有機合成反應製備該醫藥組合物，透過如F127之高分子物質與丁烯基苯酞間產生共價鍵結，使高分子物質包覆丁烯基苯酞，達到減少醫藥組合物對於生物體細胞毒性之功效。

除非另有定義，於本發明之說明書及申請專利範圍所使用之技術及科學名詞之意義，其係與本發明所屬技術領域且具通常知識者之一般理解者相同。若有矛盾之情形，以本發明內容為準。

本發明所揭丁烯基苯酞之結構式為如式(I)： ，其製備或取得方式乃為該所屬技術領域且具 通常知識者之一般知識，並且非本發明之技術特徵，故於本發明不加以贅述。舉例來說，中國專利申請第200910066666號中揭露丁烯基苯酞得以有機溶劑自傘形科或菊科植物萃取而得；中國專利公告第1041725C號揭露丁烯基苯酞係以化學合成方式合成。

本發明所揭高分子物質F127，其係為聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯之三嵌段聚合物，化學式如式(II)： ，其中，x、y、z分 別為大於1之整數。由於高分子物質F127兩端之聚氧乙烯具有親水性，中段之聚氧丙烯屬於疏水性，因此，高分子物質F127為兩性物質。當高分子物質F127存在於水溶液中時，其會逐漸向界面擴散並吸附於界面上，使表面張力下降，並且，透過控制高分子物質內親疏水基之比例，能達到控制高分子物質之表面活性。

本發明所揭「分子間引力」包含有，但不限於，凡得瓦力、庫倫作用力、氫鍵、疏水鍵力。

本發明所揭「醫藥組合物」乙詞係包含一有效量之欲產生特定效果之所需化合物或活性成份，以及至少一藥學上能接受之載體。如同本發明所屬技術領域中具有通常知識者所瞭解者，醫藥組合物之型態得隨 著欲引起特定效果之投予方式有所不同，如錠劑、粉劑、針劑等，並且，該載體亦隨著醫藥組合物之型態而得為固態、半固態或液態。舉例來說，載體包含，但不限於，明膠、乳化劑、烴類混合物、水、甘油、生理食鹽水、緩衝生理鹽水、羊毛脂、石蠟、蜂蠟、二甲基硅油、乙醇。

本發明所揭「有效量」乙詞係指醫藥組合物內活性成份或化合物欲產生所求特定效果之量，通常以活性成份或化合物於醫藥組合物中所佔重量百分比表示。如同本發明所屬技術領域中具有通常知識者所瞭解者，該有效量會因為欲引起特定效果之投予方式而有所不同。一般來說，活性成分或化合物於組合物中之量可佔該組合物重量之約1%至約100%，較佳者係為約30%至約100%。

本發明所揭「類似物」乙詞係包含有化合物之鹽類、其酯類、其結構異構物，如Z型結構或E型結構，或進行結構修飾後之產物。

本發明所揭「高分子物質」乙詞係指通過聚合反應而生成具有香當高分子量之大分子，一般來說，高分子物質皆為有機分子。

以下，為能更進一步說明本發明之功效，將茲舉若干實例作詳細說明，惟，該等實例係為用以解說之例示，其中所使用之任何詞彙並不限制本發明說明書及申請專利範圍之範圍及意義。

實例一：合成水相丁烯基苯酞

自美國西格瑪奧瑞奇集團(Sigma-Aldrich)取得丁烯基苯酞(n-butylidenephthalide，Bdph，W333301)及F127高分子物質(Pluronic F127，P2443)。將10毫克丁烯基苯酞與F127高分子物質以重量比1：1或1：2之比例混合後，溶於2毫升之四氫呋喃(tetrahydrofuran)，再將之加入10 毫升之水中，而後快速加熱去除四氫呋喃，進行冷凍乾燥。之後，再回溶於水，於溶液中乳化後之丁烯基苯酞微粒大小約為30~200nm，多分散指數(polydispersity index)為0.2-0.5。

實例二：細胞培養

將人類萬能幹細胞培養於無血清培養基Essential 8^TM(Life Technology公司，美國)中，並且以matrigel^TM基質膠(Becton-Dickinson公司，美國)進行貼附培養。將培養液吸除，以磷酸鹽緩衝液沖洗細胞2次後，加入酵素Accutase^TM(Merck Millipore公司，美國)反應2~5分鐘後以培養液中和，並且將細胞沖刷下來後打散為小團塊，進行離心1000rpm、2分鐘，再吸除上清液，放入新培養皿中進行培養約3~5天，進行繼代培養，且於培養期間須每天更換培養液。

實例三：神經細胞分化

將人類萬能幹細胞培養至8-9分滿，以磷酸鹽緩衝液沖洗細胞2次後，以酵素Accutase^TM作用2~5分鐘後，加入培養液稀釋酵素，再將細胞沖洗下來，打散至適當大小後以800rpm之速度進行離心約2分鐘，再將細胞置於含有20%替代血清(knock out serum replacement，簡稱KSR，Life Technology公司，美國)之DMEM-F12培養基，以無蓋培養皿進行懸浮培養2天，獲得類胚體(Embryonic body)懸浮液。

將懸浮之類胚體至於離心管，待自然沈降後，去除上清液，以含有BiSF小分子藥物之神經誘導培養基進行懸浮培養2天，而後，懸浮之類胚體會出現環狀之上皮細胞結構，其中，小分子藥物包含有0.5μM之BIO(Sigma-Aldrich公司，美國)、10ng/ml之纖維母細胞生長因子-2(FGF-2， Peprotech公司，美國)以及10μM之SB431542(Sigma-Aldrich公司，美國)；神經誘導培養液之成份係如下表一所示。

再將類胚體進行沈降後，放入含有10ng/ml之纖維母細胞生長因子-2之神經基礎培養基中進行培養，其中，神經基礎培養基之成份如下表二所示。懸浮2天後，待類胚體沈降後，以外力或酵素Accutase^TM將之打散至小團塊，置於已塗布1%matrigel^TM基質膠超過1小時之培養皿中進行細胞貼附。大約2~7天細胞會貼附、生長並且長出神經構造。而於細胞生長至7~8分滿時進行分盤，其中，細胞分盤時係使用磷酸鹽緩衝液沖洗1次後，以磷酸鹽緩衝液與酵素Accutase^TM以等比例混合之酵素溶液進行作用約2~5分鐘，再以神經基礎培養基稀釋，而後使用細胞刮勺將細胞刮起並以機械力打散成為小團塊或單細胞，進行800~1000rpm之離心約2~5分 鐘，再吸除上清液進行貼盤，並且貼盤時須加入10μM之Y27632(Stemgent公司，美國)1天，以幫助細胞貼附。

實例四：細胞毒性試驗

將人類胚胎幹細胞TW1培養於Essential 8^TM培養基中，並且於繼代時分為三組，分別於6孔盤放入1.2 x 10⁵之細胞量以下述條件進行培養，其中，第一組為單純以培養基進行培養；第三組係於培養基中添加未包覆F127高分子物質之丁烯基苯酞，濃度為10μM；第二組係於培養基中添加如實例一所製得包覆F127高分子物質之丁烯基苯酞，濃度為10μM。於培養過程中觀察各組細胞型態，並且於培養4~5天，進行細胞計數，每組重複1~3次，結果如第一圖所示，其中，第一圖之結果係經單因子變異數分析(one-way ANOVA)及多重比較測定(Tukey’s Multiple Comparison Test分析)而得，P值小於0.05，95%信心水準，記號＊表示在0.05之顯著水準之下，記號＊ ＊表示在0.01之顯著水準之下。

由第一圖之結果可知，於培養5天後，第三組之細胞數量係顯著少於第一組或第二組之細胞數量。由此可知，丁烯基苯酞會對於細胞具有較高之細胞毒性，而藉由包覆高分子物質F127係得有效減少丁烯基苯酞之細胞毒性。

實例五：T21誘導性萬能幹細胞進行神經細胞分化培養

請參閱實例二及第二圖，將T21誘導性萬能幹細胞(T21-iPSCs)依據實例二所述者進行神經分化，並且於第8天進行貼附。於細胞貼附後第12天進行免疫螢光染色分析，用以觀察神經幹細胞標的，包含N-cadherin、Nestin以及Pax-6蛋白質之表現，結果如第三圖至第五圖所示。另觀察T21誘導性萬能幹細胞進行神經分化培養後之神經突起生長狀況，於培養第27天以免疫螢光染色分析，藉由Tuj-1抗體觀察其內如β Ⅲ微管蛋白質(tubulin)之成熟神經標記之表現，結果如第六圖所示。

而免疫螢光染色分析之操作流程如下：將細胞培養於蓋玻片之4孔培養皿，進行染色時，先將細胞培養液吸除後，以磷酸鹽緩衝液沖洗2次後，加入4%之三聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)於冰上作用5分鐘進行細胞固定後移除，再以磷酸鹽緩衝液沖洗3次後，加入0.3%之triton(PBST)於冰上作用10分鐘進行打洞，再以磷酸鹽緩衝液沖洗3次後，加入濃度為5%之馬血清進行阻斷(blocking)1小時，吸除液體並加入配置於為濃度3%馬血清之一級抗體，室溫下作用4小時或於4℃反應16小時。之後，吸除一級抗體並以PBST充洗液沖洗3次，每次5分鐘。二級抗 體配置於磷酸鹽緩衝中，吸除PBST後加入二級抗體並避光作用1小時後再以PBST充洗液沖洗3次，加入濃度為1μg/ml之細胞核染劑DAPI室溫避光作用10分鐘，而後以PBST充洗液沖洗2次，再以甘油與磷酸鹽緩衝液以等比例混合成之溶液200μl浸濕後，進行挑片，封片後在正立螢光顯微鏡下觀察螢光。

由第三圖至第五圖之結果可知，T21誘導性萬能幹細胞於神經細胞分化培養第12天時會表現N-cadherin、Nestin及Pax-6神經幹細胞特殊蛋白質，顯示T21誘導性萬能幹細胞以上述培養基進行培養後係能成功分化成為T21神經細胞。再者，由第六圖之結果可知，T21誘導性萬能幹細胞於經過27天之培養分化後，其具有大量神經突起，並且能表現為成熟神經標的之βⅢ微管蛋白質，顯示T21誘導性萬能幹細胞經過27天之分化培養化成為成熟之T21神經細胞。

實例六：神經細胞之Aβ40表現量

將貼附培養的T21誘導性萬能幹細胞所分化之神經細胞進行細胞計數後，貼盤於4孔培養皿中，每48小時更換一次培養液，將每48小時收集之培養液保存於-20℃，藉由酵素連結免疫吸附分析法(ELISA)進行Aβ40表現量之分析，並且使用核型正常之人類胚胎幹細胞TW1分化之神經細胞作為控制組，其中，每組試驗重複2或3次。分析結果如係第七圖所示。

而酵素連結免疫吸附分析法之操作流程如下：以培養緩衝液(working incubation buffer)將ELISA套組之Aβ標準蛋白進行序列稀釋，用以作為標準曲線。將收取之細胞培養液與該培養緩衝液以1：2之比例進 行稀釋。分別取100μl之標準品溶液及樣本放入96孔盤中，置於4℃、16小時。吸除液體後，以300μl之充洗孔盤，並且晾乾。加入200μl之TMB受質，室溫避光反應約40~45分鐘後，讀取620nm之吸光值。

由第七圖之結果可知，於分化第20天開始，由T21誘導性萬能幹細胞所分化之神經細胞內Aβ40表現量係開始高於由人類胚胎幹細胞TW1所分化之神經細胞，並且於分化第25天開始出現差異。詳言之，由T21誘導性萬能幹細胞所分化之神經細胞內Aβ40表現量，於分化第25天時為105.38pg/ml，於分化第30天時為155.68pg/ml，並於分化第42天時為264.47pg/ml。

據此可知，由T21誘導性萬能幹細胞所分化之神經細胞內Aβ40表現量係會隨著分化時間增加而顯著上升，因而能作為用以篩選治療或預防神經退化性疾病之平台。

實例七：藥物篩選

將T21誘導性萬能幹細胞進行神經分化培養至第39天時分為三組，分別給予不同培養條件後，再進行培養3天，即於第42天時，以酵素連結免疫吸附分析各該組內之Aβ40濃度，並且與未進行神經分化培養之T21誘導性萬能幹細胞比較，結果如第八圖所示，其中，第一組係為未進行神經分化培養之T21誘導性萬能幹細胞；第二至四組係為進行神經分化培養之T21誘導性萬能幹細胞，而第二組於培養過程中未添加任何藥劑，第三組於培養第39天時添加γ分泌素抑制劑DAPT，第四組於培養第39天時添加10μM之包覆F127高分子物質之丁烯基苯酞。每組試驗進行2~3次，並且以單因子變異數分析及多重比較測定分析數值是否存在顯數差異，其中，P 值小於0.05，95%信心水準，記號＊表示在0.05之顯著水準之下，記號＊＊表示在0.01之顯著水準之下。

由第八圖之結果可知，第一組之Aβ40濃度係顯著低於第二組之Aβ40濃度，而第三組及第四組之Aβ40濃度係分別較第二組下降。由此可知，本發明所揭丁烯基苯酞係能顯著降低神經細胞內之Aβ40濃度，並且其效果係類似於投予γ分泌素抑制劑DAPT。據此，本發明所揭丁烯基苯酞確實具有改善或減緩細胞內累積過量β類澱粉樣蛋白質之能力，而能達到治療或預防神經退化性疾病之功效。

藉由上述實例之說明，本發明所揭醫藥組合物製備方法係能以高分子物質作為藥物載體，減緩或降低丁烯基苯酞之細胞毒性，確實能有效提昇醫藥組合物之安全性。而透過上述方法所製得之醫藥組合物確實具有降低細胞內β類澱粉樣蛋白質濃度之功能，因此，藉由投予有效量之醫藥組合物至生物體，能達到治療或預防神經退化性疾病之功效。

以上僅是藉由各該實例詳細說明本發明，熟知該技術領域者於不脫離本發明精神下，而對於說明書中之實施例所做的任何簡單修改或是變化，均應為本案申請專利範圍所得涵攝者。

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Claims (5)

1. 一種將丁烯基苯酞用於製備降低細胞之β類澱粉樣蛋白質濃度之醫藥組合物之用途。
2. 依據申請專利範圍第1項所述用途，其係用於治療或/及預防阿茲海默症。
3. 依據申請專利範圍第1項所述用途，其係用於治療或/及預防唐氏症之神經退化。
4. 依據申請專利範圍第1項所述用途，其中，丁烯基苯酞係由化學合成技術所製備而得。
5. 依據申請專利範圍第1項所述用途，其中，該醫藥組合物更包含一F127高分子物質，用以包覆丁烯基苯酞。