TW202214265A - 預防、治療及診斷神經退化性疾病的醫藥組成物及方法 - Google Patents

預防、治療及診斷神經退化性疾病的醫藥組成物及方法 Download PDF

Info

Publication number
TW202214265A
TW202214265A TW109134157A TW109134157A TW202214265A TW 202214265 A TW202214265 A TW 202214265A TW 109134157 A TW109134157 A TW 109134157A TW 109134157 A TW109134157 A TW 109134157A TW 202214265 A TW202214265 A TW 202214265A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
mirna
pharmaceutical composition
psen
amyloid
butenylphthalide
Prior art date
Application number
TW109134157A
Other languages
English (en)
Inventor
林欣榮
韓鴻志
邱紫文
吳李偉
Original Assignee
佛教慈濟醫療財團法人
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 佛教慈濟醫療財團法人 filed Critical 佛教慈濟醫療財團法人
Priority to TW109134157A priority Critical patent/TW202214265A/zh
Priority to CN202011428086.XA priority patent/CN114306603A/zh
Priority to US17/491,064 priority patent/US20220096431A1/en
Publication of TW202214265A publication Critical patent/TW202214265A/zh

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A61K31/375—Ascorbic acid, i.e. vitamin C; Salts thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本揭露提供一種預防、治療及診斷神經退化性疾病的醫藥組成物及方法，該方法包括從受試者獲得生物樣本和確認其miRNA的表現量，並促進該miRNA的表現。本揭露亦提供在有需要的個體中診斷神經退化性疾病的套組。

Description

預防、治療及診斷神經退化性疾病的醫藥組成物及方法
本揭露係關於預防、治療及診斷神經退化性疾病的醫藥組成物及方法。本揭露亦關於診斷神經退化性疾病的生物標記及套組。
研究發現，類澱粉蛋白(amyloid)分佈在身體各種器官中，而過多的類澱粉蛋白堆積會造成多種神經退化性疾病，其中之一為在腦中具有類澱粉蛋白堆積現象的阿茲海默症(Alzheimer's disease，AD)。
降低腦中的類澱粉蛋白堆積被視為可預防或治療AD的可行策略之一。目前已知，降低腦中類澱粉蛋白的有效方法包括抑制可剪切出類澱粉蛋白的酵素，如β分泌酶(β-secretase)及γ分泌酶(γ-secretase)，或抑制造成類澱粉蛋白堆積的原料，即類澱粉前驅蛋白(amyloid precursor protein，APP)。然而，目前抑制APP或β分泌酶的方法多已失敗，而調控γ-分泌酶則被認為是治療阿茲海默症最有潛力的方法。
γ分泌酶由四個蛋白所組成：早老素-1(presenilin-1，PSEN-1)、納卡斯楚因(nicastrin，NCSTN)、前咽缺陷蛋白1(anterior pharynx-defective 1， APH-1)和早老素增强子2(presenilin enhancer 2，PEN-2)，其中，PSEN-1被認為是調控γ分泌酶最重要的蛋白，且已有報導指出，有效調控PSEN-1可以顯著降低類澱粉蛋白的堆積(Int.J.Mol.Sci.2020,21(4),1327)。
然而，目前仍未有安全有效的γ分泌酶調控劑，像是已知的γ分泌酶抑制劑(γ-secretase inhibitor，GSI)──LY450139，會產生嚴重的不良反應，不僅損害Notch信號傳導，還會導致皮膚腫瘤及腸上皮細胞分化等。此外，現有治療阿茲海默症的藥物尚無法獲得滿意的療效，故仍需要積極尋找阿茲海默症的治療方法。再者，現有診斷阿茲海默症的方法並無法完全涵蓋所有阿茲海默症的病患，因而對於預測或診斷阿茲海默症，仍需要更為有效的生物標記和方法。
本揭露提供一種預防或治療類澱粉蛋白堆積之神經退化性疾病的醫藥組成物和方法。本揭露發現，miRNA-29b-2-5p(miR-29b-2-5p)在PSEN-1較高的大腦中具有顯著性的減少。本揭露進一步發現，增加miRNA-29b-2-5p表現量可減少腦中類澱粉蛋白沉積，進而預防或治療類澱粉蛋白沉積導致的神經退化性疾病。本揭露提供一種預防或治療神經退化疾病的醫藥組成物，其中該醫藥組成物包含miRNA-29b-2-5p的調控劑。
在本揭露的一個具體實施例中，miRNA-29b-2-5p的調控劑為增加miRNA-29b-2-5p活性的生物活性劑，包括增加miRNA-29b-2-5p表現量的生物活性劑。在一個具體實施例中，該生物活性劑包括促進miRNA-29b-2-5p表現量的促進劑。本揭露的一個具體實施例中，該促進劑包括與人類PSEN-1基因序列的3' UTR(untranslated region)互補或雜交的核苷酸，另一個具體實施例中，該促進劑是與 人類PSEN-1基因序列的3' UTR核酸位置第3791至第3797及第3856至第3862互補或雜交的核苷酸。在一個具體實施例中，該促進劑為具有cugguuucacaugguggcuuag序列(SEQ ID NO.：1)的核苷酸。在另一個具體實施例中，該促進劑是一種小分子化合物、胜肽、蛋白質、核苷酸或碳水化合物。
在一個實施例中，促進miRNA-29b-2-5p表現量的促進劑為苯酞化合物(phthalide)，包含其代謝前驅物、其代謝前驅物之醫藥可接受鹽、其代謝前驅物之醫藥可接受酯以及前述之組合。在一個實施例中，該苯酞化合物為正丁烯基苯酞(n-Butylidenephthalide,BP)、(Z)-亞丁基苯酞((Z)-butylidenephthalide，順式亞丁基苯酞)、(E)-亞丁基苯酞((E)-butylidenephthalide，反式亞丁基苯酞)、藁本內酯(ligustilide)、丁苯酞(3-N-Butylphthalide)、洋川芎內酯(Senkyunolide I)。在一個實施例中，在預防或治療神經退化疾病的醫藥組成物中做為促進miRNA-29b-2-5p表現量的促進劑的正丁烯基苯酞未進行任何形式的包覆。在另一個具體實施例中，在預防或治療神經退化疾病的醫藥組成物中做為促進miRNA-29b-2-5p表現量的促進劑的正丁烯基苯酞未使用藥物載體。在一個實施例中，做為促進miRNA-29b-2-5p表現量的促進劑的正丁烯基苯酞在細胞中的使用濃度為30μM至100μM。在另一個具體實施例中，做為促進miRNA-29b-2-5p表現量的促進劑的正丁烯基苯酞在動物中的劑量為30mg/kg至200mg/kg。在另一實施例中，正丁烯基苯酞在動物中的劑量為50mg/kg至150mg/kg。在另一實施例中，正丁烯基苯酞在動物中的劑量為60mg/kg至120mg/kg。在另一個具體實施例中，做為促進miRNA-29b-2-5p表現量的促進劑的正丁烯基苯酞在人體的有效劑量為每日30mg至1500mg；在其他具體實施例中，該有效劑量為每日30mg至1000mg、每日50mg至1500mg或每日100mg至1500mg。在另一個具體實施例中，做為促進miRNA- 29b-2-5p表現量的促進劑的正丁烯基苯酞在人體的最低有效劑量為每日30mg，在其他具體實施例中，該最低有效劑量為每日50mg、每日60mg、每日70mg、每日80mg、每日90mg、每日100mg、每日200mg、每日300mg、每日400mg或每日500mg。在另一個具體實施例中，做為促進miRNA-29b-2-5p表現量的促進劑的正丁烯基苯酞在人體的有效劑量為每日1500mg、1400mg、1300mg、1200mg、1100mg、1000mg、900mg、800mg、700mg或600mg。
本揭露所提供的一種預防或治療神經退化疾病的醫藥組成物包括增加miRNA-29b-2-5p表現量的生物活性劑，抗氧化劑或可共同促進miR-29b家族表現之藥物。在一個具體實施例中，該miR-29b家族為miR-29b-3p、miR-29b-1-5p或miR-29b-2-5p。在一個具體實施例中，該抗氧化劑包含水溶性及脂溶性之抗壞血酸(維生素C)、酯化維生素C、穀胱甘肽、硫辛酸、尿酸、胡蘿蔔素、α-生育酚(維生素E)、泛醌(輔酶Q)及視黃醇(維生素A)。在一個具體實施例中，該抗氧化劑為維生素C，在動物中的使用劑量為50mg/kg至150mg/kg。在另一個具體實施例中，該抗氧化劑在動物中的使用劑量為100mg/kg。在另一個具體實施例中，該抗氧化劑在人體的使用劑量為每日50至2000mg，包含每日50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950mg。
本揭露所提供的一種預防或治療神經退化疾病的醫藥組成物的劑量可以依其製劑型式、給藥時間、給藥途徑、患者的年齡、體重、性別、疾病狀態、排泄速度及對藥物之敏感性之類的因素而進行調整，通常，負責處置的醫生能夠容易的決定給藥方式及有效的給藥劑量。在一個具體實施例中，本揭露用於 預防或治療神經退化疾病的醫藥組成物的給藥劑量為每天0.001mg/kg至100mg/kg。
在一個具體實施例中，該預防或治療神經退化疾病的醫藥組成物可包括藥學上能接受的載體。在一個具體實施例中，藥學上能接受的載體包含藥劑學上許可的載體為在制備時常使用的載體，該載體包含乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、澱粉、阿拉伯橡膠、磷酸鈣、藻酸鹽、明膠、矽酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖槳、甲基化纖維素、羥苯甲酸甲酯、對羥苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂、脂質體、外泌體及礦物質等，但不限於此。本揭露的醫藥組成物除了上述成分以外還可以包含潤滑劑、濕潤劑、甜味劑、香味劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑、賦形劑等。本揭露的醫藥組成物的劑型可以是油性或者水性介質中的溶液、懸浮液或乳化液形態、或者也可以是浸膏劑、粉末劑、顆粒劑、片劑或者膠囊形態，還可以包括分散劑或者穩定劑。其他藥學上許可的適合的載體和劑型詳细記載於雷明登氏藥學全書(Remington's Pharmaceutical Sciences 19th ed.,1995)。
在一個具體實施例中，該預防或治療神經退化疾病的醫藥組成物的給藥方式包括口服或非口服。做為非口服給藥時，本揭露之醫藥組成物能通過靜脈內注射、鼻腔內注射、局部注射、腦室內注射、脊髓腔注射、皮下注射、腹腔注射、經皮給藥等方式進行給藥。
本揭露另一方面提供一種預防或治療類澱粉蛋白堆積導致神經退化性疾病的方法，包括投予有需要的個體增加miRNA-29b-2-5p活性的生物活性劑。
本揭露另一方面提供偵測神經退化性疾病的生物標記。在一個具 體實施例中，該生物標記為miR-29b的表現量。在另一個具體實施例中，該生物標記為miRNA-29b-2-5p、miRNA-29b-1-5p或miR-29b-3p的表現量。
本揭露另一方面提供偵測神經退化性疾病的套組，該套組包含具有miR-29b-2-5p序列或互補序列的核苷酸，或該等序列的片段。在一個實施例中，該套組所包含的具有miR-29b-2-5p序列或互補序列的核苷酸係做為微陣列上的表面探針。在另一個實施例中，該套組為包含引子的基因擴增套組，包含聚合酶連鎖反應所需的試劑，例如緩沖液、DNA聚合酶輔助因子及脫氧核醣核苷三磷酸(dNTPs)。
本揭露另一方面提供偵測神經退化性疾病的方法，在一個具體實施例中，該方法檢測受測者生物樣品中的miRNA-29b-2-5p的表現量。在一個具體實施例中，miRNA-29b-2-5p、miRNA-29b-1-5p或miR-29b-3p表現量減少代表神經退化性疾病存在。在一個實施例中，檢測受測者生物樣品中的miRNA-29b-2-5p、miRNA-29b-1-5p或miR-29b-3p的表現量係經由微陣列、聚合酶連鎖反應、即時聚合酶連鎖反應(real-time PCR)或反轉錄酶-聚合酶連鎖反應(RT-PCR，reverse transcriptase PCR)。
在一個具體實施例中，上述神經退化性疾病為類澱粉蛋白堆積導致之神經退化性疾病。在另一個具體實施例中，神經退化性疾病包括澱粉樣腦血管病、家族性類澱粉蛋白沉積、痴呆症、亨廷頓氏病、阿茲海默症、帕金森氏症或肌萎縮側索硬化症。
藉由參考以下描述並結合附圖，本揭露的內容將變得更加容易理 解：
圖1A及圖1B顯示miRNA-29b-2-5p及miRNA-29b-3p在阿茲海默症的患者(AD)與非阿茲海默症而死亡的患者(對照組)腦中的表現量。
圖2A為miR-29b-2-5p可能具有對PSEN-1及PSEN-2調控作用的示意圖。
圖2B顯示miRNA-29b-2-5p核苷酸序列與PSEN-1互補的序列位置。
圖2C顯示雙色冷光分析法分析miRNA-29b-2-5p抑制不同PSEN-1 3'UTR序列的結果，藍色柱狀圖顯示miRNA-29b-2-5p可有效抑制圖1B中所示的PSEN-1的3'UTR序列。
圖3A顯示正丁烯基苯酞(EF-005)調控阿茲海默症相關蛋白表現量的西方墨點法結果。
圖3B至圖3E分別為圖3A中PSEN-1、PSEN-2、乙型類澱粉蛋白1-42(β-amyloid 1-42，A β 1-42)和NICD西方墨點法結果的量化結果圖(p *<0.05，p **<0.01)。圖3A至圖3E所使用的C6-C99細胞為帶有人類片類澱粉蛋白前驅物(amyloid precursor protein，APP)的片段，此片段長度為99個胜肽片段(APP-C99)，經過誘導後能夠大量表現PSEN-1、PSEN-2、乙型類澱粉蛋白1-42的神經膠質瘤細胞。
圖4A顯示正丁烯基苯酞與γ分泌酶抑制劑DAPT的結構解析結果。
圖4B顯示正丁烯基苯酞(EF005)和miRNA-29b-2-5p反義寡核苷酸調控PSEN-1表現量以西方墨點法分析的結果。
圖4C為圖4B西方墨點法分析的量化結果圖。
圖5A顯示帶有Trisomy 21基因突變的誘導性多能幹細胞(Trisomy 21-iPSC)所呈現的阿茲海默症狀。該多能幹細胞所分化的神經細胞能夠產生磷酸化的Tau蛋白(hyperphosphorylated Tau，AT8)，其大量表現會影響神經細胞纏繞訊號與營養傳輸；A β 1-42為類澱粉蛋白堆積的主成分；微管相關蛋白(microtubule-associated protein 2，MAP2)主要維持神經樹突細胞的穩定性，為神經細胞的確認指標；微管蛋白(neuron-specific class III β-tubulin，TuJ1)同樣為神經細胞的確認指標。
圖5B顯示帶有阿茲海默症病徵之神經細胞加入正丁烯基苯酞(EF005)後與未加入的對照組的A β 1-42和磷酸化的Tau蛋白(p-Tau)的分泌表現量。
圖5C顯示帶有阿茲海默症病徵之神經細胞加入正丁烯基苯酞(EF005)後的miRNA-29-2-5p表現量。
圖5D顯示帶有阿茲海默症病徵之神經細胞加入正丁烯基苯酞後的蛋白表現量。
圖6A顯示水迷宮實驗中正常鼠、口服橄欖油的帶有阿茲海默症基因的AD-3xTg老鼠做為對照組、以不同濃度的正丁烯基苯酞治療的AD-3xTg老鼠(EF-005 60mg/kg、EF-005 120mg/kg)、臨床用阿茲海默症藥物對照組(Donepezil 10mg/kg)的游泳軌跡圖。
圖6B為連續五天水迷宮實驗中各實驗組小鼠尋找隱藏救生平台所需的時間。
圖6C顯示第五天水迷宮測試的結果。
圖7A分別顯示以類澱粉蛋白酶追蹤試劑(18F-Florbetaben；FBB)追蹤正常鼠、帶有阿茲海默症基因的AD-3xTg鼠對照組、以不同濃度的正丁烯基 苯酞治療的AD-3xTg鼠(EF-005 60mg/kg、EF-005 120mg/kg)腦中位於海馬迴及皮質層的類澱粉蛋白堆積狀況。
圖7B顯示正常鼠、帶有阿茲海默症基因的AD-3xTg鼠對照組及從出生四個月(4m)開始口服正丁烯基苯酞(EF-005 60mg/kg & 120mg/kg)的AD-3xTg鼠在服用正丁烯基苯酞一個月後的類澱粉蛋白酶堆積情形。CTXR：皮質層右側；CTXL：皮質層左側；HIPR：海馬迴右側；HIPL：海馬迴左側；CB：小腦。
圖7C及圖7D顯示各組別小鼠腦海馬迴(HIP)與皮質層(CTX)的類澱粉蛋白酶在6個月(6m)及12個月(12m)時左腦(L)與右腦(R)的表現量分析結果。
圖7E顯示以免疫染色法追蹤AD-3xTg基因轉殖鼠腦中位於海馬迴及皮質層的類澱粉蛋白堆積狀況。
圖8顯示AD-3xTg基因轉殖鼠口服正丁烯基苯酞(EF-005 120mg/kg)與未服用正丁烯基苯酞的對照組的海馬迴中的基因表現量。
圖9A顯示使用正丁烯基苯酞合併維生素C對細胞存活率影響的實驗結果。
圖9B為對神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y使用正丁烯基苯酞或維生素C及合併治療對A β 1-42毒殺實驗的保護結果。
圖9C為在不同時間點檢測被A β 1-42毒殺的神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y使用正丁烯基苯酞或維生素C及合併治療進行保護實驗的結果。
圖10為單獨或合併使用正丁烯基苯酞(BP)或維生素C(Vitamin C)對帶有阿茲海默症病徵之神經細胞的miRNA-29b表現量的影響結果。
圖11顯示單獨或合併使用正丁烯基苯酞(BP)或維生素C(Vitamin C)對AD-3xTg基因轉殖鼠腦中的類澱粉蛋白沉積現象的治療效果。
本揭露發現，miRNA-29b-2-5p(miR-29b-2-5p)在PSEN-1表現量較高的大腦中反而會顯著減少。已知PSEN-1是γ分泌酶膜內蛋白酶的主要複合物之一，而γ分泌酶是調控腦中類澱粉蛋白產生的重要剪切酵素之一。本揭露進一步發現，增加miRNA-29b-2-5p的表現量可減少腦中類澱粉蛋白的堆積，進而預防或治療類澱粉蛋白堆積所導致的神經退化性疾病。
miRNA是一種內源性非編碼RNA分子，成熟的miRNA(mature miRNA)由21至25個核苷酸所組成，而成熟miRNA的前身則是由長度70至90個核苷酸所形成的環形miRNA，稱為前體miRNA(pre-miRNA)，其需經由Dicer酵素切割後以形成成熟的miRNA。
miRNA影響動植物中訊息RNA(messenger RNA，mRNA)的轉錄，對於細胞的發育、疾病發展和細胞轉錄調節具有重要的作用。已發現miRNA參與各種病症的發展，如癌症及年齡有關的發炎反應、心血管疾病和神經系統疾病。本揭露藉由調控miRNA，進而提供一種治療神經退化性疾病的醫藥組成物和方法，該神經退化性疾病包括由類澱粉蛋白沉積所引起者，其中包括AD。
小分子RNA(miRNA)是一類短的、內源性非編碼RNA，長度為18至24個核苷酸(nt)，標靶特定mRNA 3'非轉譯區(3'-UTR)，並降解或抑制其標靶mRNA的轉譯。如本文所使用，用語「小分子RNA」(miRNA或miR)包括人類miRNA、成熟的單股miRNA、前體miRNA(pre-miR)及其變體，其可以是天然存在的或人工合成的。在一些情況下，用語「miRNA」亦包括初級miRNA(pri-miR) 轉錄體和雙螺旋miRNA。除非另有說明，否則本文中所使用特定miRNA的名稱是指成熟的miRNA。例如，miR-122a是指源自pre-miR-122的成熟miRNA序列。對於某些miRNA，單個前體包含一種以上的成熟miRNA序列。在其他情況下，多個前體miRNA包含相同的成熟序列。在某些情況下，成熟的miRNA已根據新的科學共識重新命名。本領域技術人員將理解，關於特定的miRNA，特別是成熟形式的miRNA的精確核酸序列的科學共識可能隨時間改變。本揭露內容的miRNA包括miRNA天然存在或人工合成的序列。
本文中所述之miRNA-29b包含miR-29b-3p、miR-29b-1-5p、miR-29b-2-5p。人類miRNA-29家族由miRNA-29a、miRNA-29b和miRNA-29c這三個密切相關的前體所組成。miRNA-29a和miRNA-29c是在細胞質中通過RNA誘導沉默複合體機制而發揮作用，而miRNA-29b是在細胞核調節標的基因的表現，其中miRNA-29b又分為miRNA-29b-1和miRNA-29b-2。miRNA-29a和miRNA-29b-1從7號染色體(7q32.3)轉錄，而miRNA-29b-2和miRNA-29c則是從1號染色體(1q32.2)轉錄。miRNA-29b-1和miRNA-29b-2雖然染色體的來源不同，但有相同的序列，被視為具有相同的作用。
在本文中，「核苷酸」包含具有特定miRNA的序列，尤其是與PSEN-1互補的序列，而能形成miRNA和二聚體(duplex)的核酸分子。因此，本文中的術語「核苷酸」可記載為「與PSEN-1互補的核酸抑制劑」。本文中的術語「互補」意指在預定的雜交條件下，以反義核苷酸與PSEN-1接觸而進行雜交，進而達到充分互補，其包括實質上互補(substantially complementary)與完全互補(perfectly complementary)。
如本揭露所屬技術領域中所已知的，核苷是鹼基與糖的組合，而 核苷酸則是核苷進一步包括與核苷的糖部分共價連接的磷酸基團。在形成核苷酸時，磷酸基團將相鄰的核苷彼此共價連接以形成線性聚合化合物，具有RNA和DNA的正常鍵或主鏈為3'至5'的磷酸二酯鍵。可用於本揭露的核苷酸特定實施例包括含有修飾的主鏈或非天然核苷間鍵的寡核苷酸。如本揭露中所定義的，主鏈中保留磷原子的核苷酸和在主鏈中缺少磷原子的核苷酸都包括在具有修飾主鏈的核苷酸。對於本揭露，如本揭露所屬技術領域中所曾經提到的，在其核苷間的主鏈中不具有磷原子的修飾核苷酸亦可被認為是核苷酸。本文中的核苷酸可以包括多種分子，核苷酸可以為去氧核糖核酸(DNA)分子或核糖核酸(RNA)分子。本揭露所利用的核苷酸為核糖核酸(RNA)、去氧核醣核酸(DNA)、寡核苷酸(oligonucleotide)、硫代磷酸寡核苷酸(phosphorothioate oligonucleotide)、肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)、鎖核酸(locked nucleic acid，LNA)、2'-O-改性寡核苷酸、2'-O-烷基寡核苷酸、2'-O-Cl-3烷基寡核苷酸及2'-O-Cl-3甲基寡核苷酸。本文中的核苷酸可包含基於胜肽的主鏈而代替糖與磷酸的主鏈，核苷酸所能包含的其他化學修飾結構包含：2'-O-烷基，例如2'-O-甲基、2'-O-甲氧基乙基、2'-氟及4'-硫氧修飾等糖修飾硫代磷酸、嗎碄代或磷羧酸鍵之類的主鏈修飾(例如美國專利第6,693,187號及第7,067,641號所揭露者)。核苷酸可以是未經包覆，或經包覆的型態，例如，以微脂體(liposome)包覆的核苷酸或包覆於外泌體(exosome)中的核苷酸。
於本文中，miR-29b-2-5p核苷酸可以是核糖核酸、去氧核醣核酸、寡核苷酸或修飾寡核苷酸。寡核苷酸包含至少一個化學改變，而修飾寡核苷酸能包含一個或一個以上的鎖核酸(locked nucleic acids，LANs)，鎖核酸為修飾的核醣核酸。在核醣部位的2'至4'碳之間包含額外的橋鍵，以具有鎖定(clocked)形態， 並藉此具有鎖核酸的寡核苷酸以改善熱穩定性。
相對於本文所提供的每個核酸序列和/或本文所提供的每個SEQ ID NO，至少80%的序列同一性包括至少82%、至少84%、至少86%、至少88%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%和100%序列同一性。
可使用多種序列比對方法中的任何一種來確定同一性百分比，包括但不限於全局方法(global method)、局部方法和雜合方法，例如分段式法(segment approach method)。確定同一性百分比的流程屬於本揭露所屬技術領域中的技術人員的一般程序範圍內。全局方法從分子的開始到末端比對序列，並藉由累加各別殘基對的分數並施加空位罰分來確定最佳比對。非限制性方法包括例如CLUSTAL W(例如，參見Julie D.Thompson等人，《CLUSTAL W：藉由序列加權、特定位置的空位罰分和權重矩陣選擇提高漸進多序列比對的敏感性》(CLUSTAL W：Improving the Sensitivity of Progressive Multiple Sequence Alignment through Sequence Weighting,Position-Specific Gap Penalties and Weight Matrix Choice,22(22)Nucleic Acids Research 4673-4680,1994)，以及迭代優化(例如，參見Osamu Gotoh，《多重蛋白質準確性的顯著提高。藉由迭代優化進行序列比對，參考結構比對進行評估》(Significant Improvement in Accuracy of Multiple Protein.Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Reference to Sfructural Alignments,264(4)J.Mol.Biol.823-838,1996)。局部方法是藉由確認所有輸入序列共有的一個或多個保守基序列來比對序列。非限制性方法則包括例如Match-box(例如，參見Eric Depiereux和Ernest Feytmans的Match-Box：《一種同時對齊多個蛋白質序列的根本新算法》(A Fundamentally New Algorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences,8(5)CABIOS 501-509,1992)、吉布斯採樣(例如，參見C.E.Lawrence等人，《檢測微妙的序列信號：多重對齊的吉布斯採樣策略》(Detecting Subtle Sequence Signals：A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment,262(5131)Science 208-214,1993)，和Align-M(例如，參見Ivo Van Wale等人，Align-M：《一種用於高度發散序列的多重比對的新演算法》(A New Algorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences,20(9)Bioinformatics：1428-1435,2004)。因此，本揭露的序列同一性百分比是藉由一般方法所確定。例如，參見Altschul等人，《數理生物學通報》(Bull.Math.Bio.48：603-16,1986；Henikoff & Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-19,1992)。
正丁烯基苯酞(n-Butylidenephthalide，BP)是由當歸萃取而得的小分子藥物，分子量為188.22，分子式為C12H12O2。
在本文中使用的所有用語，包括描述性用語或技術性用語，應被解釋為具有對本揭露所屬技術領域中普通技術人員顯而易見的含義，但根據本揭露所屬技術領域中普通技術人員的意圖、先例或新技術的出現，該等用語可能具有不同的含義。另外，申請人可以任意選擇一些用語，並且在這種情況下，將在本揭露的全面描述中詳述所選擇用語的含義。因此，必須基於用語的含義以及整個說明書中的描述來定義本文中所使用的用語。
本文中述及「包括」成分或步驟時，除非有與之相反的特定描述，否則可以進一步包括其他成分或其他步驟，而不排除其他成分或步驟。
如本文所使用，用語「進展」用於描述疾病(例如AD)的病程，疾病的進展為發展成更嚴重的病症。
用語「受試者」、「患者」和「個體(individual)」在本文可互換 使用，指的是溫血動物，例如罹患、懷疑患有或易患本揭露所述疾病的哺乳動物，或正在接受疾病篩檢。該等用語包括但不限於家畜、運動動物(sports animal)、靈長類動物和人類。例如，該等用語是指人類。
還應注意的是，如在本揭露中所使用的，單數形式「一種(a)」、「一種(an)」和「該(the)」除非明確地限於一個指示物，否則包括複數個指示物。除非上下文另外明確指出，否則用語「或」與用語「和/或」可互換使用。
實施例
以下實施例進一步描述本揭露的例示性具體實施例，其不限制本揭露的範圍。
實施例1：miRNA-29b-2-5p於阿茲海默症患者腦部檢體表現量具有顯著差異
在阿茲海默症患者的前額葉皮質背外側區(Brodmann Area 9，BA9)腦部檢體中，發現miRNA-29b-2-5p的表現量與其他未患有阿茲海默症的腦部檢體具有顯著差異。如圖1A及圖1B所示，在阿茲海默症的患者(AD)與非阿茲海默症而死亡的患者(對照組)中，隸屬同一miR-29b家族的miRNA-29b-3p在腦中並沒有顯著性差異，但miRNA-29b-2-5p在兩者之間則具有顯著性差異。
實施例2：miR-29b-2-5p與PSEN-1互補並調控PSEN-1的表現
經由miRNA分析軟體RNA22及MiRWalk探索未知但有可能影響阿茲海默症基因表現的miRNA，經過互相分析比對，發現miR-29b家族的miR-29b-2- 5p可能對PSEN-1及PSEN-2具有明顯的調控作用(圖2A)，而PSEN-1及PSEN-2是產生類澱粉蛋白的關鍵調控基因。
成熟的miRNA-29b-2-5p核甘酸序列為11-cugguuucacaugguggcuuag-32(SEQ ID NO.：1)，與PSEN-1全基因序列(NCBI Reference Sequence：NM_000021.4)的第90966至90972位置或自3'UTR起算(1617=3'UTR+1)的第3791至3797位置(+3791至+3797)的核苷酸序列片段ugugaaa(SEQ ID NO.：2)及PSEN-1全基因序列第91675至91681位置或自3'UTR起算的第3856至3862位置(+3856至+3862)的核苷酸序列片段cauguga(SEQ ID NO.：3)為互補序列。
如圖2B所示，miRNA-29b-2-5p自3'端起算的第12個核苷酸至第18個核苷酸共7個連續核苷酸序列與PSEN-1的第一位置(Site 1)的序列片段互補，而miRNA-29b-2-5p自3'端起算的第10個核苷酸至第16個核苷酸共7個連續核苷酸序列與PSEN-1的第二位置(Site 2)的序列片段互補，故符合miRNA有效影響基因的條件。
miRNA-29b-2-5p對於PSEN-1特定序列的專一性及抑制能力可以透過雙色冷光分析法(dual luciferase assay)確認。雙色冷光分析法包括將兩種冷光蛋白，亦即分別從螢火蟲(Photlnus pyralls)所分離的螢火蟲螢光素酶(firefly luciferase，分子量為61kDa，發光波長約為560nm)及從海腎(Renilla reniformis)所分離的海腎螢光素酶(Renilla luciferase，分子量為31kDa，發光波長約為480nm)與所欲進行分析的序列結合並製作載體進行放大，轉染進細胞後，使細胞發出冷光。本揭露共使用三種不同的PSEN-1序列進行雙色冷光分析，包括野生型PSEN-1的3'UTR序列、經預測可能與miRNA-29b-2-5p互補的PSEN-1第二位置序列的突變型、以及經預測可能與miRNA-29b-2-5p互補的PSEN-1第一及第二位置序列均進行 突變的雙突變型。
如圖2C所示，轉染野生型PSEN-1的3'UTR序列(PSEN-1 wild type)的細胞發出冷光，當該細胞加入隨機的miRNA時，所發出的冷光沒有顯著差異，但若加入經預測可與PSEN-1的3'UTR互補的miRNA-29b-5p，則所發出的冷光因miRNA-29b-5p與PSEN-1的3'UTR互補而抑制其表現，與未加入任何miRNA的對照組及加入隨機的miRNA實驗組之間具有顯著性差異。轉染PSEN-1第二位置序列的突變型(PSEN-1 site 2 mutant)的細胞發出相似程度的冷光，但加入隨機的miRNA或miRNA-29b-5p之後，由於PSEN-1第二位置序列發生突變而無法與miRNA-29b-5p互補，因而所發出的冷光並無任何顯著差異。轉染PSEN-1第一及第二位置序列均進行突變的雙突變型(PSEN-1 double mutant)的細胞亦發出相似程度的冷光，但加入隨機的miRNA或miRNA-29b-5p之後，由於PSEN-1第一及第二位置序列發生突變而無法與miRNA-29b-5p互補，因而所發出的冷光並無任何顯著差異。
實施例3：正丁烯基苯酞在細胞中降低類澱粉蛋白表現
使用西方墨點法偵測類澱粉蛋白相關蛋白的表現量，包括PSEN-1、PSEN-2及β-amyloid 1-42，並同時偵測做為藥物安全性指標的Notch蛋白(Notch intracellular domain，NICD)的表現，Notch蛋白不受影響代表具有藥物安全性。
如圖3A所示，加入100μM正丁烯基苯酞(EF-005)後，PSEN-1、PSEN-2及β-amyloid 1-42等與阿茲海默症相關的蛋白表現皆明顯受到調控並減少，而Notch蛋白則未受到影響。圖3B至圖3E為圖3A西方墨點法結果的量化結果圖，PSEN-1、PSEN-2及β-amyloid 1-42在加入EF-005後均有統計上的顯著差異(p *<0.05，p **<0.01)。
實施例4：正丁烯基苯酞為miRNA-29b-2-5p調控劑
如圖4A所示，經由結構解析正丁烯基苯酞與γ分泌酶的抑制劑DAPT(N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-butyl ester)和PSEN-1之間的結合能(binding energy)與抑制常數(inhibition constant，Ki)，正丁烯基苯酞的結合能遠低於DAPT，而抑制常數則高於DAPT，此結果表示正丁烯基苯酞並無法直接有效抑制PSEN-1。
如圖4B和圖4C所示，正丁烯基苯酞(EF005)經由西方墨點法分析，顯示確實可在細胞中抑制PSEN-1的表現量，但當miRNA-29b-2-5p受到反義寡核苷酸的抑制後，即使加入正丁烯基苯酞仍無法降低細胞中PSEN-1的表現，此結果證明正丁烯基苯酞為miRNA-29b-2-5p的調控劑，且是經由miRNA-29b-2-5p調控PSEN-1。
實施例5：正丁烯基苯酞減少誘導性多能幹細胞的阿茲海默症狀
基因體中具有3條第21號染色體的基因突變(Trisomy 21)會導致唐氏症，且會表現阿茲海默的症狀，例如A β聚集和Tau蛋白過度磷酸化，並影響突觸的形成與功能性。經由基因工程的方法，將Oct-4、Sox-2、c-Myc、Klf-4四種轉錄因子送入成體細胞中，並將其逆轉錄成帶有Trisomy 21基因突變的誘導性多能幹細胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)。如圖5A所示，Trisomy 21-iPSC經過培養與分化後產生A β聚集及Tau蛋白的磷酸化，然經加入正丁烯基苯酞(EF005)之後，可有效減低上述阿茲海默症狀中的A β聚集及Tau蛋白的磷酸化(圖5B)。檢測miRNA的表現量，發現miRNA-29b-2-5p的表現量在加入EF005後明顯上升(圖 5C)。圖5D顯示加入正丁烯基苯酞(EF005)之後，β-amyloid 1-42聚集及磷酸化Tau蛋白的蛋白質表現量均減少。
實施例6：正丁烯基苯酞(EF005)有效治療阿茲海默症
AD-3xTg基因轉殖小鼠為用於研究阿茲海默症的動物模式，該基因轉殖小鼠經基因工程方式殖入人類的類澱粉前驅蛋白(amyloid precursor protein，APP)、突變微管相關蛋白tau蛋白(microtubule-associated protein tau，MAPT P301L)及第一型早老蛋白(PSEN-1)點突變。帶有阿茲海默症突變基因的AD-3xTg基因轉殖小鼠會影響腦部並產生病徵，主要包括在海馬和大腦皮層表現出類澱粉蛋白沉積。AD-3xTg基因轉殖小鼠的發病進程為在3至4個月時，乙型類澱粉蛋白(β-amyloid)會增加，並在6個月時發現其神經突觸傳遞和長期增強作用(long-term potentiation)明顯受損，於12至15個月時則可在海馬迴中檢測到過度磷酸化的tau蛋白聚集體。
使用小鼠進行水迷宮(Morris water maze)所測試的行為模式實驗作為檢測短期記憶及複雜記憶的經典測試方法，透過其行為可判定經過藥物治療後的記憶能力是否有所差異。具體而言，水迷宮測試以直徑約120公分的水池測試AD-3xTg基因轉殖小鼠對複雜記憶的能力，其中包括兩次的訓練。第一次訓練時水池中無放置救生平台，使小鼠在水池中游泳，時間為120秒；第二次訓練則放置救生平台，使小鼠在水池中游泳，時間亦為120秒，120秒內仍未找到平台之AD-3xTg基因轉殖小鼠會被引導至隱藏平台，並使其停留於平台約10秒。每次訓練後更換平台方向，並連續進行五天的尋找平台試驗，每次實驗為90秒，並於收集數據後進行分析。
圖6A為水迷宮實驗中使用未進行治療的AD-3xTg基因轉殖小鼠、以低劑量EF-005治療的3xTg基因轉殖小鼠(EF-005 60mg/kg)每天口服一次、以高劑量EF-005治療的3xTg基因轉殖小鼠(EF-005 120mg/kg)每天口服一次、正常鼠和每天口服一次臨床用藥Donepezil的藥物對照組小鼠等各實驗組別的小鼠在水迷宮中尋找隱藏平台的游泳軌跡圖。圖6A中黑色空心圓圈為掩蓋於水面下的救生平台，紅色點為起始點，綠色點則為時間結束時所停留的位置。水迷宮測試結果顯示，正常鼠、每天口服一次臨床用藥Donepezil的藥物對照組及每天口服一次高劑量EF-005(EF-005 120mg/kg)的三個組別尋找救生平台所需時間均較短；相較於此，未進行治療的基因轉殖鼠對照組則無法在一定時間找到救生平台，而每天口服一次低劑量EF-005(EF-005 60mg/kg)的組別雖同樣能找到隱藏救生平台，但移動的軌跡卻較長。經連續五天的測試後，如圖6B所示，AD-3xTg小鼠在第一天檢測時對於尋找救生平台並無記憶上的區別。但在第五天，與對照組相比，正常鼠、低劑量EF-005組(EF-005 60mg/kg)、高劑量EF-005組(EF-005 120mg/kg)、藥物對照組尋找平台的時間均明顯降低，顯示正常鼠及經過治療的AD-3xTg基因轉殖小鼠具有較好的學習能力及記憶力。圖6C顯示第五天水迷宮測試的結果，在連續測試五天後，相較於對照組，正常鼠、高劑量EF-005組(120mg/kg)和藥物對照組尋找救生平台的時間都明顯降低，且有顯著性的差異(* P<0.05，** P<0.01)。
腦部組織中的類澱粉蛋白堆積可使用類澱粉蛋白酶追蹤試劑(18F-Florbetaben；FBB)進行檢測，類澱粉蛋白堆積在圖譜中呈現紅色，圖7A顯示正常鼠、帶有阿茲海默症基因的AD-3xTg鼠、以不同濃度的正丁烯基苯酞治療的AD-3xTg鼠(口服EF-005 60mg/kg或EF-005 120mg/kg)腦中位於海馬迴及皮質 層的類澱粉蛋白堆積狀況，發現經正丁烯基苯酞治療的AD-3xTg鼠腦中的類澱粉蛋白堆積狀況明顯改善。
圖7B為AD-3xTg基因轉殖小鼠從出生四個月(4m)開始口服正丁烯基苯酞(EF-005 60mg/kg & 120mg/kg)，檢測服用正丁烯基苯酞一個月內類澱粉蛋白酶堆積情形，結果顯示AD-3xTg基因轉殖小鼠的腦部皮質與海馬迴類澱粉蛋白堆積量無顯著差異。
圖7C與圖7D為AD-3xTg基因轉殖小鼠出生六個月(6m)與十二個月(12m)，經過三個月與六個月的口服正丁烯基苯酞的治療。發現AD-3xTg基因轉殖位於海馬迴及皮質層的類澱粉蛋白堆積明顯減少。正常小鼠在出生4個月(4m)時幾乎無類澱粉蛋白堆積的情形，而AD-3xTg基因轉殖小鼠的海馬迴與皮質層在4個月時類澱粉蛋白沉積情形不顯著。在出生十二個月(12m)，未給予藥物治療的類澱粉蛋白堆積情形轉趨嚴重。AD-3xTg基因轉殖小鼠給予EF-005低劑量(EF-005 60mg/kg)或高劑量(EF-005 120mg/kg)的治療後，6個月齡(6m)的低劑量組(EF-005 60mg/kg)的腦部海馬迴(圖7C)與皮質層(圖7D)能持續維持在較低的類澱粉蛋白堆積。而持續服用高劑量的EF-005(EF-005 120mg/kg)至12個月齡(12m)，發現包括與記憶有關的大腦的海馬迴部位(圖7C)與皮質層(圖7D)的類澱粉蛋白沉積都有明顯的改善。
圖7E為以免疫染色法追蹤AD-3xTg基因轉殖小鼠腦中類澱粉蛋白的沉積現象。圖7E顯示使用剛果紅追蹤AD-3xTg基因轉殖小鼠腦中海馬迴部位的類澱粉蛋白的沉積結果，發現在出生12個月後，正常的小鼠並無類澱粉蛋白沉積的現象(正常鼠)，而未給予藥物治療的AD-3xTg基因轉殖小鼠的類澱粉蛋白堆積情形則轉趨嚴重(AD-3xTg鼠)，另給予低劑量或高劑量EF-005治療的實驗組 (AD-3xTg鼠口服EF-005 60mg/kg、AD-3xTg鼠口服EF-005 120mg/kg)則能持續維持在較低的類澱粉蛋白堆積。
圖8為透過即時聚合酶鏈鎖反應(Real-time PCR)檢測以EF-005治療的實驗組(EF-005 120mg/kg)與未治療組別(Vehicle)的AD-3xTg基因轉殖小鼠比較其腦部海馬迴中的miRNA-29b-2-5p與PSEN-1的基因表現量，相較於未進行治療的AD-3xTg基因轉殖小鼠，給予EF-005治療的AD-3xTg基因轉殖小鼠具有較高的miRNA-2-5p的表現量，且PSEN-1的表現量下降，並均具有顯著性差異。
實施例7：正丁烯基苯酞合併抗氧化劑具有預防及治療阿茲海默症的更佳效果
圖9A至圖9C為使用人類神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y的細胞模式，以分化為神經細胞前及分化為神經細胞後之細胞，測試正丁烯基苯酞(n-Butylidenephthalide 100μM)合併維生素C(Ascorbic acid 200μM)於預防及治療阿茲海默症的效果。測試方法包括將正丁烯基苯酞與維生素C一次性單獨或合併加至人類神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y，並以1μM的乙型類澱粉蛋白(A β 1-42)進行細胞毒殺試驗，時間分別為6小時(6hr)和24小時(24hr)，之後透過細胞存活試驗(MTT(3-(4,5-dimethyltbiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)assay)進行細胞存活率的檢測。
圖9A為使用正丁烯基苯酞(n-Butylidenephthalide 100μM：A-drug)合併維生素C(Ascorbic acid 200μM：B-drug)對細胞存活率影響的實驗結果，其顯示單獨或合併使用正丁烯基苯酞與維生素C均未對細胞存活率有所影響，代表兩者在此濃度下均具有生物安全性。
圖9B為在神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y中使用正丁烯基苯酞(n-Butylidenephthalide 100μM)或維生素C(Ascorbic acid 200μM)預防乙型類澱粉蛋白1-42(A β 1-42)胜肽所造成的神經細胞傷害的保護效果。結果顯示，單獨或合併使用正丁烯基苯酞(n-Butylidenephthalide 100μM)或維生素C(Ascorbic acid 200μM)對細胞存活率均具有提升的效果，然而合併使用正丁烯基苯酞及維生素C具有更佳的保護效果。相較於未進行任何治療的對照組，合併使用正丁烯基苯酞及維生素C的細胞存活率提升至兩倍以上。
圖9C為使用A β 1-42胜肽對神經母細胞瘤細胞株SH-SY5Y進行傷害後6小時或24小時的不同時間點所檢測的細胞存活率，在加入正丁烯基苯酞或維生素C做為治療藥物的實驗結果。結果顯示，合併使用正丁烯基苯酞及維生素C可使細胞存活率顯著提升，具有更佳的治療效果。
下表一顯示以正丁烯基苯酞治療帶有阿茲海默症病徵的神經細胞所導致的基因表現量的變化，結果顯示正丁烯基苯酞可以提高神經細胞的自噬(autophagy)基因表現量，並減少發炎相關基因的表現。例如，ATP6V0D2及IST1為自噬相關基因，其表現量在施予正丁烯基苯酞後分別增加30.07倍及15.72倍，而與發炎相關的基因包括NT5E、STAP1、DEC1、ADAMDEC1，其表現量則分別減少12.6、12.79、28.35及43.55倍。
Figure 109134157-A0101-12-0023-1
Figure 109134157-A0101-12-0024-2
Figure 109134157-A0101-12-0025-3
圖10為針對進行治療的AD-3xTg基因轉殖鼠腦部組織的miRNA表現量進行檢測的結果，發現相較於單獨使用正丁烯基苯酞，合併使用正丁烯基苯酞及維生素C(ascorbate 2-phosphate，A2P)促進miR-29b表現的能力顯著提升，顯示正丁烯基苯酞及維生素C合併使用為可作為更強的miR-29b促進劑。
圖11顯示3xTg基因轉殖鼠單獨或合併使用60mg/kg正丁烯基苯酞或200mg/kg維生素C對腦中的類澱粉蛋白沉積現象的治療效果。結果顯示，單獨使用正丁烯基苯酞(BP)及維生素C(Vitamin C)或合併使用(BP+Vitamin C)相較於服用橄欖油的對照組均具有顯著提升的治療效果(亦即，圖中的紅色區域大幅減少)，其中以合併使用組的表現最為明顯(BP+Vitamin C)。
前述實施例用於例示本揭露。基於本揭露的內容，所屬技術領域中的普通技術人員可想到本揭露的其他優點。本揭露還可如在不同示例中描述的方式實現或應用。另可修飾和/或改變用於執行本揭露的實施例，而不背離其針對不同態樣和應用的精神和範圍。
<110> 佛教慈濟醫療財團法人
<120> 預防、治療及診斷神經退化性疾病的醫藥組成物及方法
<130> 115356
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> 人類
<400> 1
Figure 109134157-A0101-12-0027-7
<210> 2
<211> 7
<212> RNA
<213> 人類
<400> 2
Figure 109134157-A0101-12-0027-6
<210> 3
<211> 7
<212> RNA
<213> 人類
<400> 3
Figure 109134157-A0101-12-0027-5

Claims (11)

  1. 一種預防或治療類澱粉蛋白堆積之神經退化性疾病的醫藥組成物，係包含miRNA-29b-2-5p的促進劑。
  2. 如請求項1所述的醫藥組成物，其中，該促進劑包含與人類PSEN-1基因序列的3'UTR互補的核苷酸。
  3. 如請求項2所述的醫藥組成物，其中，該核苷酸係經包覆之核苷酸。
  4. 如請求項1所述的醫藥組成物，其中，該促進劑包含苯酞化合物、其代謝前驅物、其代謝前驅物之醫藥可接受的鹽、其代謝前驅物之醫藥可接受的酯及其組合。
  5. 如請求項3所述的醫藥組成物，其中，該苯酞化合物為正丁烯基苯酞。
  6. 如請求項4所述的醫藥組成物，其中，該苯酞化合物未進行任何形式的包覆。
  7. 如請求項5所述的醫藥組成物，其中，該正丁烯基苯酞在人體的有效劑量為每日30mg至1500mg。
  8. 如請求項6所述的醫藥組成物，進一步包括抗氧化劑或可共同促進miR-29b表現之藥物。
  9. 如請求項7所述的醫藥組成物，其中，該抗氧化劑包括水溶性或脂溶性維生素C或酯化維生素C。
  10. 一種如請求項1至9中任一項所述的醫藥組成物用於預防或治療類澱粉蛋白堆積導致神經退化性疾病的藥物的用途。
  11. 一種偵測神經退化性疾病的套組，包含具有miR-29b-2-5p序列或其互補序列的核苷酸，或該等序列之片段的核苷酸，或其組合，以及其溶劑。
TW109134157A 2020-09-30 2020-09-30 預防、治療及診斷神經退化性疾病的醫藥組成物及方法 TW202214265A (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW109134157A TW202214265A (zh) 2020-09-30 2020-09-30 預防、治療及診斷神經退化性疾病的醫藥組成物及方法
CN202011428086.XA CN114306603A (zh) 2020-09-30 2020-12-07 预防、治疗及诊断神经退行性疾病的医药组合物及方法
US17/491,064 US20220096431A1 (en) 2020-09-30 2021-09-30 Pharmaceutical composition and method for preventing, treating and diagnosing a neurodegenerative disease

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
TW109134157A TW202214265A (zh) 2020-09-30 2020-09-30 預防、治療及診斷神經退化性疾病的醫藥組成物及方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW202214265A true TW202214265A (zh) 2022-04-16

Family

ID=80823509

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW109134157A TW202214265A (zh) 2020-09-30 2020-09-30 預防、治療及診斷神經退化性疾病的醫藥組成物及方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20220096431A1 (zh)
CN (1) CN114306603A (zh)
TW (1) TW202214265A (zh)

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2008011782A (es) * 2006-03-16 2008-12-10 Moleac Pte Ltd Terapia combinada para tratamiento de pacientes con alteraciones neurologicas e infarto cerebral.
US9096850B2 (en) * 2009-08-24 2015-08-04 Sirna Therapeutics, Inc. Segmented micro RNA mimetics
CN105431153A (zh) * 2013-07-11 2016-03-23 纽约市哥伦比亚大学理事会 使tau表达沉默的微RNA
TWI511727B (zh) * 2014-07-02 2015-12-11 Everfront Biotech Inc 苯酞化合物之應用
TWI554270B (zh) * 2014-07-17 2016-10-21 Nat Univ Chung Hsing Butenyl phthalide and a process for preparing it as a pharmaceutical composition
CN105311014A (zh) * 2014-07-28 2016-02-10 李德财 丁烯基苯酞的用途及将其制备为医药组合物的方法
CN106265634A (zh) * 2016-08-10 2017-01-04 上海张江中药现代制剂技术工程研究中心 洋川芎内酯i在制备治疗中枢神经系统神经退行性疾病药物中的应用
CN109053546B (zh) * 2018-07-05 2021-04-27 中国科学院兰州化学物理研究所 一种苯酞类衍生物及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
US20220096431A1 (en) 2022-03-31
CN114306603A (zh) 2022-04-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105861712B (zh) 使用来自体液的miRNA来早期检测和监控轻度认知障碍(MCI)和阿尔茨海默病(AD)的方法
WO2015006705A2 (en) Micrornas that silence tau expression
US20210123051A1 (en) Uses for prevention or treatment of brain diseases using microrna
US11198908B2 (en) Method for diagnosis of Alzheimer&#39;s disease using microRNA
US11225663B2 (en) Methods to detect motor neuron disease comprising micro-RNAs
CN111956658B (zh) miRNA 148簇作为诊断和/或治疗认知障碍相关疾病标志物的应用
KR102105016B1 (ko) miR-485-3p를 이용한 알츠하이머병 진단 방법
WO2013134403A1 (en) Method of treating neurodegenerative diseases with microrna regulators
TW202214265A (zh) 預防、治療及診斷神經退化性疾病的醫藥組成物及方法
Liu et al. Role of miR‐211 in a PC12 cell model of Alzheimer's disease via regulation of neurogenin 2
CA3079524A1 (en) Mirna molecule, equivalent, antagomir, or source thereof for treating and/or diagnosing a condition and/or a disease associated with neuronal deficiency or for neuronal (re)generation
Guan et al. Dexmedetomidine alleviates hypoxic-ischemic brain damage in neonatal rats through reducing microRNA-134-5p-mediated NLRX1 downregulation
KR102304878B1 (ko) miR-485-3p 활성 억제제를 이용한 알츠하이머병 치료 방법
KR102074407B1 (ko) miR-485-3p를 이용한 알츠하이머병 진단 방법
CA3046766A1 (en) Method for diagnosis of alzheimer&#39;s disease using microrna
CN116763809B (zh) miR-376b-3p的抑制物在制备治疗癫痫药物中的应用
KR102645546B1 (ko) 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환 진단용 마커 및 이를 이용한 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법
US20240117432A1 (en) Methods and kits for detecting a risk for developing neurological or neurophysiological disorders
US20220348916A1 (en) Composition for diagnosis or treatment of a condition associated with increased activity of eif4e comprising an eif4e inhibitor
Zhang Effects of microRNA-129 and its target gene c-Fos on proliferation and apoptosis of hippocampal neurons in rats with epilepsy via the MAPK signaling pathway
AU2019204231A1 (en) Method for diagnosis of Alzheimer&#39;s disease using microRNA
CN117265103A (zh) PiRd9的应用、诊断动脉粥样硬化的试剂盒及治疗动脉粥样硬化的药物
AU2019204230A1 (en) Uses for prevention or treatment of brain diseases using microRNA
Pastuszak et al. MP47-04 NELL1: A NOVEL GENETIC FACTOR PREDISPOSING TO PEYRONIE’S DISEASE
Patel microRNA mediated regulation of APP gene expression