KR102645546B1 - 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환 진단용 마커 및 이를 이용한 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법 - Google Patents

간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환 진단용 마커 및 이를 이용한 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102645546B1
KR102645546B1 KR1020210075363A KR20210075363A KR102645546B1 KR 102645546 B1 KR102645546 B1 KR 102645546B1 KR 1020210075363 A KR1020210075363 A KR 1020210075363A KR 20210075363 A KR20210075363 A KR 20210075363A KR 102645546 B1 KR102645546 B1 KR 102645546B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sirna
seq
zfas1
gas5
base sequence
Prior art date
Application number
KR1020210075363A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20220166516A (ko
Inventor
송주현
김영국
조단비
Original Assignee
전남대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 전남대학교 산학협력단 filed Critical 전남대학교 산학협력단
Priority to KR1020210075363A priority Critical patent/KR102645546B1/ko
Publication of KR20220166516A publication Critical patent/KR20220166516A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102645546B1 publication Critical patent/KR102645546B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Abstract

본 발명은 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환 진단용 마커 및 이를 이용한 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 긴 비암호화 RNA의 발현 및 활성을 조절하여 간성뇌증 치료제 개발에 유용하게 사용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환 진단용 마커 및 이를 이용한 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법{Maker for diagnosis of neurological or psychological disorder related diseases caused by hepatic encephalopathy and method for providing information to need to diagnosis of neurological or psychological disorder related diseases caused by hepatic encephalopathy using of}
본 발명은 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환 진단용 마커 및 이를 이용한 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환 모델에서 발현이 증가하는 긴 비암호화 RNA와 특이적으로 결합하는 조성물 및 이를 이용한 질환의 진단 방법에 관한 것이다.
간성뇌증 (Hepatic encephalopathy)은 간 손상으로 인해 간에 의해 제거되어야 할 독성 물질이 뇌에 전달되어 발생하는 뇌 기능 저하이다. 간성뇌증은 신경전달체계를 포함하는 기능적 이상의 결과로 다양한 요인들에 의하여 발생한다. 이러한 간성뇌증은 만성 간질환 환자에서 감염이나 변비, 위장관 출혈, 고단백 식사 또는 수면제 복용 등에 의해 발생하는 경우가 흔하며, 바이러스성 간염이나 약물에 의한 간염이 생겨 급격하게 간 기능이 악화되는 경우도 간성뇌증 발생에 영향을 미친다.
간성뇌증의 정확한 발명 기전은 밝혀지지 않았으나, 장에서 유래한 질소 화합물들 중 암모니아가 가장 중요한 원인으로 간주된다. 장으로부터 혈류로 흡수되는 물질은 간을 통과해 독소가 제거된다. 하지만, 간성뇌증이 발생한 경우에는 간 기능이 손상되어 있어서 독소가 제거되지 않는다.
따라서, 간에서 제거되지 않은 암모니아가 혈류를 통해 뇌에 전달되어 신경독성물질 (neurotoxicity)로서 작용하면, 뇌 기능을 저하시켜 기억력 저하 또는 인지기능 장애와 같은 신경학적 또는 정신학적 증상들이 나타나게 된다.
간성뇌증으로 유도될 수 있는 신경학적 또는 정신학적 관련 질환은 정신 혼란, 우울감, 기억력 감퇴, 인지기능 장애 또는 비정상적인 생활 주기 리듬 등을 예로 들 수 있다. 간성뇌증은 체내의 독성 물질이 발병 원인이 될 수 있기 때문에 장의 독성 물질을 제거하기 위해 항생제, 락툴로오스 (lactulose), 벤조산나트륨 (sodium benzoate), 레보도파 (levodopa), 리팍시민 (rifaxin tab) 등 다양한 약제를 사용하여 치료하고 있지만, 간성뇌증에 의해 유발된 신경학적 또는 정신학적 관련 질환은 치료하는 데에 어려움이 있다.
간성뇌증은 급성 또는 만성 간질환의 합병증이며 다양한 안자들이 발명 기전에 영향을 미친다. 간성뇌증의 정확한 병인은 밝혀지지 않았지만, 암모니아를 포함하여 뇌에 영향을 미치는 신경독소와 신경전달체계의 변화에 의해 신경세포의 형태적, 기능적 변화를 일으킨다. 따라서, 간성뇌증 발생에 기여하는 인자들과 새로운 기전을 찾는 것이 중요하다.
한편, 마이크로 RNA는 약 22개의 염기서열로 이루어진 짧은 non-coding RNA로서 머리핀 (hairpin) 모양의 줄기-잎 (stem-loop) 구조를 이루는 RNA 전구체로부터 생성이 된다. 유전자의 발현 과정에서 전사 후 조절인자 (post-transcriptional regulator)로서 기능을 한다고 알려져 있다. 이들은 상보적인 염기 서열을 가진 표적 (target) 메신저RNA (mRNA)에 상보적으로 결합함으로써 표적 mRNA들을 분해시키거나 단백질로 번역되는 것을 억제한다. 세포 내에는 이러한 마이크로 RNA와 같은 small RNA 뿐만이 아니라, 훨씬 길이가 긴 비암호화 RNA도 많이 발현된다. 긴 비암호화 RNA는 비암호화 RNA (non-coding RNA) 중 큰 비율로 존재하며, 200 뉴클레오티드 이상이면서 단백질을 만들지 않는 RNA의 그룹을 나타낸다. 최근의 연구에서는 단백질을 암호화하지 않는 긴 비암호화 RNA가 사람 세포에서 10000개 이상이 발현된다는 것이 알려졌다. 이들 긴 비암호화 RNA는 세포 핵 내부의 구조 형성이나, 전사 단계 조절, 전사 후 단계 조절 등 다양한 과정에서 중요한 조절 인자로 작용한다. 특히, 이들 긴 비암호화 RNA의 발현 패턴은 단백질 암호화 유전자에 비해 훨씬 조직 특이적인 발현 패턴을 보이고 있는데, 이를 통해 긴 비암호화 RNA는 특정 기관의 발생이나 기능에 있어서 중요한 역할을 하리라 예상할 수 있다.
현재, 간 질환에 관여하는 마이크로 RNA (microRNA, miRNA), 긴 비암호화 RNA (long non-coding RNA, IncRNA)에 대한 연구가 진행되고 있지만, 간성뇌증에 관여하는 긴 비암호화 RNA에 대한 연구는 진행되지 않았다. 긴 비암호화 RNA가 기억력 형성에 중요한 역할을 한다고 보고되어 있으나, 아직까지 간성뇌증에 의한 신경학적 또는 정신학적 장애와 관련된 긴 비암호화 RNA에 대하여 규명한 연구는 전례가 없다.
본 발명자들은 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환의 마커를 찾고, 이를 이용하여 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환의 예후를 정확하게 분석하고, 치료하고자 예의 연구 노력하였다.
그 결과, 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환에서 발현이 증가되는 긴 비암호화 RNA의 발현을 억제함으로써, 관련 질환을 예방 또는 치료하는 우수함을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명의 목적은 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환 진단 또는 예후 분석용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환 치료제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 간성뇌증 (Hepatic encephalopathy)에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환 진단 또는 예후 분석용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 진단 또는 예후 분석용 조성물은 ZFAS1 (ZNFX antisense RNA 1) 긴 비암호화 RNA (long-noncoding RNA, lncRNA)와 특이적으로 결합하는 표적 제제 (Target formulation); 및
GAS5 (Growrh arrest specific 5) 긴 비암호화 RNA와 특이적으로 결합하는 표적 제제;
로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서 상의 용어 "간성뇌증 (Hepatic encephalopathy)"은 급성이나 만성적인 간손상에 의해서 해독기능이 감소하면서 독성 물질 (예를 들어, 암모니아 등)이 체내에 쌓이고, 이 독성 물질들이 뇌에 악영향을 미쳐서 신경학적 증상이 발생하거나 의식장애나 행동의 변화를 일으키는 신경학적 또는 정신학적 증후군이다. 간성뇌증은 기저 간질환에 따라 급성 간부전의 의한 경우, 문맥-전신순환 우회로 (porto-systemic shut)에 의한 경우, 만성 간질환의 문맥압 상승에 의한 경우로 나눈다. 만성 간질환에서의 간성뇌증은 증상의 지속기간에 따라 단편성 (episodic), 반복성 (recurrent), 지속성 (persistent)으로 나뉜다. 간성뇌증을 유발할 수 있는 인자로는 위장관 출혈, 요독증, 약제 (항정신성약, 이뇨제)사용, 단백질 과다섭취, 감염, 변비, 탈수, 전해질 불균형 등이 있는데, 이러한 경우 촉발성 (precipitated) 간성뇌증이라 한다. 유발인자 없이 저절로 발생하는 경우 자발성 (spontaneous) 간성뇌증이라고 한다.
본 명세서 상의 용어 "긴 비암호화 RNA (long non-coding RNA, IncRNA)"는 일반적으로 200 뉴클레오타이드 (nucleotide) 이상이면서 단백질을 만들지 않는 RNA의 그룹을 의미한다. 200 뉴클레오타이드 길이는 절대적인 기준은 아니며, 일반적인 짧은 비암호화 RNA (예를 들어, tRNAs, microRNAs, small nucleolar RNAs 등)과 구분하기 위한 상대적인 기준이다. 긴 비암호화 RNA는 단백질 암호화 유전자와 달리 ORF (Open reading frame)를 포함하지 않으며 형태적, 기능적 특징에 따라 정의하여야 한다. 긴 비암호화 RNA의 합성 및 유전적 구성은 일반적인 mRNA와 유사하지만 mRNA에 비해 일반적으로 상대적으로 낮은 합성 비율을 보인다.
본 발명에 있어서 ZFAS1 긴 비암호화 RNA는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 GAS5 긴 비암호화 RNA는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 표적 제제는 제제는 siRNA (small interfering RNA), 안티센스 올리고뉴클레오티드 (antisense oligonucleotide), shRNA (Short hairpin RNA), microRNA (abbreviated miRNA) 및 리보자임 (Ribozyme)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 상의 용어 "siRNA (small interfering RNA,　siRNA)"는 RNA 간섭(RNAi; RNA interference)에 관여한다. 21 내지 23개의 뉴클레오티드로 구성된 siRNA는 특정 전령 RNA (mRNA)와 상보적으로 이중가닥 RNA (Double-stranded RNA)를 형성하여 세포로부터 mRNA를 제거한다.
본 발명에 있어서 표적 제제는 안티센스 가닥 (antisense strand) 및 상기 안티센스 가닥에 상보적인 센스 가닥(sense strand)으로 구성되는 이중가닥의 siRNA (small interfering RNA) 분자로서, 안티센스 가닥과 상보적인 서열을 갖는 mRNA의 분해를 유도하여 해당 mRNA의 유전자 발현을 억제하는 효과 (Off-target effect)를 갖는다.
본 발명에 있어서 ZFAS1 긴 비암호화 RNA와 특이적으로 결합하는 표적 제제는 서열번호 9의 염기서열 (ZFAS1#1 siRNA sense) 및 서열번호 10의 염기서열 (ZFAS1#1 siRNA antisense)로 이루어진 ZFAS1#1 siRNA; 및
서열번호 11의 염기서열 (ZFAS1#2 siRNA Sense) 및 서열번호 12의 염기서열 (ZFAS1#1 siRNA antisense)로 이루어진 ZFAS1#2 siRNA; 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 siRNA는 sense 및 antisense를 각각 제작하여 두 가지를 함께 사용해야 한다. antisense서열은 상보적 서열을 갖는 타겟 mRNA 서열과 짝을 이루어 분해 (degradation)가 일어나므로, sense서열은 antisense가 RISC (RNA-induced silencing complex)에 남아있을 수 있도록 5'말단에 수소결합 수가 더 많도록 제작한다. RISC에 의해 수소결합 수가 많은 sense가 먼저 파괴되고, antisense는 RISC에 남아있게 된다. 따라서, siRNA를 표적 제제로 사용하기 위해서는 antisense 및 sense를 모두 넣어주어야 siRNA의 기능이 작동하게 된다.
본 발명에 있어서 GAS5 긴 비암호화 RNA와 특이적으로 결합하는 표적 제제는 서열번호 13의 염기서열 (GAS5#1 siRNA sense) 및 서열번호 14의 염기서열 (GAS5#1 siRNA antisense)로 이루어진 GAS5#1 siRNA; 및
서열번호 15의 염기서열 (GAS5#2 siRNA sense) 및 서열번호 16의 염기서열 (GAS5#1 siRNA antisense)로 이루어진 GAS5#2 siRNA; 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환은 고암모니아혈증 (Hyperammonemia), 신경세포 사멸, 산화적 스트레스 및 기억력 감퇴로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 신경학적 장애 관련 질환은 알츠하이머병, 신경성 염증, 운동실조, 파킨슨씨병, 뇌졸증, 다발성 경화증, 측두엽 간질 및 근위축성 측색경화로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 정신학적 장애 관련 질환은 자폐증, 정신분열증, 아스퍼거신드롬, 거식증, 주의력 결함, 양극성 정동장애, 강박장애 및 공황장애로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 일 양태는 다음 단계를 포함하는 간성뇌증 (Hepatic encephalopathy)에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다:
분리된 생물학적 시료로부터 ZFAS1 (ZNFX antisense RNA 1) 긴 비암호화 RNA;및
GAS5 (Growrh arrest specific 5) 긴 비암호화 RNA;
로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 발현수준을 측정하는 단계.
본 발명에 있어서 생물학적 시료는 질환 의심 또는 질환 진단 대상 개체 유래의 세포, 조직, 생검, 체액, 혈액, 혈청, 혈장 및 소변으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 생물학적 시료는 질병의 치료를 필요로 하는 대상으로 부터 분리된 것을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 토끼, 말, 또는 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명에 있어서 질환 의심 또는 질환 진단 대상 개체 유래의 세포는 신경 유래 세포, 예를 들어, 신경 세포인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 ZFAS1 긴 비암호화 RNA는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 GAS5 긴 비암호화 RNA는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 ZFAS1 긴 비암호화 RNA 발현수준을 측정하는 단계는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머 세트를 이용하여 측정하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 GAS5 긴 비암호화 RNA 발현수준을 측정하는 단계는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머 세트를 이용하여 측정하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 긴 비암호화 RNA 발현수준을 측정하는 단계는 마이크로어레이 (Microarray), 압타머 칩 키트 (Aptamer chip kit), 블랏팅 (Blotting), 중합효소연쇄반응 (PCR), 차세대 염기서열 분석 (Next generation sequencing; NGS), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응 (Real-time PCR) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상에 의해 수행되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 다음 단계를 포함하는 간성뇌증 (Hepatic encephalopathy)에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다:
후보 물질을 ZFAS1 (ZNFX antisense RNA 1) 긴 비암호화 RNA; 및
GAS5 (Growrh arrest specific 5) 긴 비암호화 RNA;
로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 과발현하는 세포에 처리하는 처리 단계; 및
세포의 긴 비암호화 RNA의 발현량을 측정하는 측정 단계.
본 발명에 있어서 후보 물질은 서열번호 9의 염기서열 (ZFAS1#1 siRNA sense) 및 서열번호 10의 염기서열 (ZFAS1#1 siRNA antisense)로 이루어진 ZFAS1#1 siRNA; 및
서열번호 11의 염기서열 (ZFAS1#2 siRNA Sense) 및 서열번호 12의 염기서열 (ZFAS1#1 siRNA antisense)로 이루어진 ZFAS1#2 siRNA; 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 후보 물질은 서열번호 13의 염기서열 (GAS5#1 siRNA sense) 및 서열번호 14의 염기서열 (GAS5#1 siRNA antisense)로 이루어진 GAS5#1 siRNA; 및
서열번호 15의 염기서열 (GAS5#2 siRNA sense) 및 서열번호 16의 염기서열 (GAS5#1 siRNA antisense)로 이루어진 GAS5#2 siRNA; 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 ZFAS1 긴 비암호화 RNA는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 GAS5 긴 비암호화 RNA는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 긴 비암호화 RNA를 과발현하는 세포는 세포주의 분화 기간 동안 염화암모늄을 처리하여 고암모니아 혈증을 유도하는 방법으로 긴 비암호화 RNA의 과발현을 유도할 수 있는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 긴 비암호화 RNA의 발현량을 측정하는 측정 단계는 네가티브 siRNA를 처리한 세포군과 후보 물질을 처리한 세포군을 비교하는 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 ZFAS1 (ZNFX antisense RNA 1) 긴 비암호화 RNA (long-noncoding RNA, lncRNA) 발현 억제제; 및
GAS5 (Growrh arrest specific 5) 긴 비암호화 RNA 발현 억제제;
를 포함하는, 간성뇌증 (Hepatic encephalopathy)에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 ZFAS1 긴 비암호화 RNA는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 GAS5 긴 비암호화 RNA는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 ZFAS1 긴 비암호화 RNA 발현 억제제는 서열번호 9의 염기서열 (ZFAS1#1 siRNA sense) 및 서열번호 10의 염기서열 (ZFAS1#1 siRNA antisense)로 이루어진 ZFAS1#1 siRNA; 및
서열번호 11의 염기서열 (ZFAS1#2 siRNA Sense) 및 서열번호 12의 염기서열 (ZFAS1#1 siRNA antisense)로 이루어진 ZFAS1#2 siRNA; 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 GAS5 긴 비암호화 RNA와 특이적으로 결합하는 표적 제제는 서열번호 13의 염기서열 (GAS5#1 siRNA sense) 및 서열번호 14의 염기서열 (GAS5#1 siRNA antisense)로 이루어진 GAS5#1 siRNA; 및
서열번호 15의 염기서열 (GAS5#2 siRNA sense) 및 서열번호 16의 염기서열 (GAS5#1 siRNA antisense)로 이루어진 GAS5#2 siRNA; 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환은 고암모니아혈증 (Hyperammonemia), 신경세포 사멸, 산화적 스트레스 및 기억력 감퇴로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 신경학적 장애 관련 질환은 알츠하이머병, 신경성 염증, 운동실조, 파킨슨씨병, 뇌졸증, 다발성 경화증, 측두엽 간질 및 근위축성 측색경화로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 정신학적 장애 관련 질환은 자폐증, 정신분열증, 아스퍼거신드롬, 거식증, 주의력 결함, 양극성 정동장애, 강박장애 및 공황장애로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 상 용어 "예방"은 본 발명에 있어서 약학적 조성물의 투여에 의한 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환의 발생, 확산 및 재발을 억제 또는 지연시킬 수 있는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서 상 용어 "치료"는 본 발명에 있어서 약학적 조성물의 투여에 의한 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환이 의심되거나 발명된 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서 약학적 조성물은 비경구 또는 경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 약학적 조성물은 비경구 투여시에는 피하, 근육내, 정맥, 경피, 복강내, 근육내, 골수내, 경막내, 장관, 설하, 흡입 및 국소 투여로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 투여되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 비경구 투여를 위한 약학적 조성물은 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 제제로 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 비수성용제 또는 현탁용제는 프로필렌글리콜, 폴리에텔렌 글리콜, 올리브 오일 및 에틸올레이트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 좌제는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 61 (Tween 61), 카카오지, 라우린지, 글리세롤 및 젤라틴으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 비경구 투여를 위한 약학적 조성물은 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다중 투약형태로 제조할 수 있으며, 기타 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 서방형 제제 등으로 제형화 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 약학적 조성물의 제형은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다.
본 발명에 있어서 약학적 조성물은 경구 투여시에는 정제, 연질 또는 경질 캡슐, 트로키, 로렌지, 수성 또는 유성 혼탁액, 분산성 분말 또는 과립, 에멀젼, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서 약학적 조성물의 제제화에 적합한 담체, 부형제 또는 희석제는 물, 덱스트로오즈, 락토오즈, 솔비톨, 수크로오즈, 자일리톨, 만니톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 셀룰로오즈, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트 등이 사용될 수 있다. 이와 같은 조성물은 하나 이상의 감미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제 또는 방부제를 함유할 수 있다.
본 발명에 있어서 약학적 조성물의 인체에 대한 효과적인 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 투여량의 조절은 당업계의 통상의 기술자에게 자명한 것이며, 의사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수 있다.
본 발명에 있어서 약학적 조성물은 ZFAS1 긴 비암호화 RNA 또는 GAS5 긴 비암호화 RNA 발현 억제제 이외의 공지된 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환 치료제를 추가로 포함할 수 있으며, 이들 질환의 치료를 위해 공지된 다른 치료와 병용할 수 있다.
본 발명은 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환 진단용 마커 및 이를 이용한 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 긴 비암호화 RNA의 발현 및 활성을 조절하여 간성뇌증 치료제 개발에 유용하게 사용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 긴 비암호화 RNA ZFAS1 발현 억제에 따른 신경세포 내 암모니아 레벨을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 긴 비암호화 RNA GAS5 발현 억제에 따른 신경세포 내 암모니아 레벨을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 긴 비암호화 RNA ZFAS1 발현 억제 시 신경세포 사멸의 억제 여부를 확인하기 위한 단백질 발현 결과를 보여주는 사진이다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따른 긴 비암호화 RNA ZFAS1 발현 억제 시 신경세포 사멸의 억제 여부를 확인하기 위한 단백질 발현 결과를 보여주는 그래프이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 긴 비암호화 RNA GAS5 발현 억제 시 신경세포 사멸의 억제 여부를 확인하기 위한 단백질 발현 결과를 보여주는 사진이다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 긴 비암호화 RNA GAS5 발현 억제 시 신경세포 사멸의 억제 여부를 확인하기 위한 단백질 발현 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 긴 비암호화 RNA ZFAS1 발현 조절에 따른 신경세포 구조적 변화를 확인하기 위한 신경세포 구조에 미치는 영향을 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따른 긴 비암호화 RNA ZFAS1 발현 조절에 따른 신경세포 구조적 변화를 확인하기 위한 신경세포 구조에 미치는 영향을 분석한 결과를 보여주는 형광 현미경 사진이다.
도 6a는 본 발명의 일 실시예에 따른 긴 비암호화 RNA GAS5 발현 조절에 따른 신경세포 구조적 변화를 확인하기 위한 신경세포 구조에 미치는 영향을 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따른 긴 비암호화 RNA GAS5 발현 조절에 따른 신경세포 구조적 변화를 확인하기 위한 신경세포 구조에 미치는 영향을 분석한 결과를 보여주는 형광 현미경 사진이다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따른 본 발명의 일 실시예에 따른 긴 비암호화 RNA ZFAS1 발현 조절에 따른 신경세포 구조적 변화를 확인하기 위한 신경세포 신경가지 길이신장을 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따른 본 발명의 일 실시예에 따른 긴 비암호화 RNA ZFAS1 발현 조절에 따른 신경세포 구조적 변화를 확인하기 위한 신경세포 소마로부터 나오는 신경가지의 수를 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따른 본 발명의 일 실시예에 따른 긴 비암호화 RNA GAS5 발현 조절에 따른 신경세포 구조적 변화를 확인하기 위한 신경세포 신경가지 길이신장을 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따른 본 발명의 일 실시예에 따른 긴 비암호화 RNA GAS5 발현 조절에 따른 신경세포 구조적 변화를 확인하기 위한 신경세포 소마로부터 나오는 신경가지의 수를 분석한 결과를 보여주는 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 세포 배양 및 간성뇌증 유도
1-1. 세포 배양
인간 신경아세포종의 세포주 (Human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y)를 10% 소태아혈청 (Fetal bovine serum, FBS), 1% 페니실린/스트렙토마이신 (penicillin/streptomycin)을 포함한 최소필수배지이글 (Minimum Essential Medium Egle, MEM)에서 37 ℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 신경아세포종의 세포주를 신경세포로 분화 시키기 위해 2% 소태아혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신을 포함한 최소필수배지이글로 교체하고, 20 uM 레티노익산 (Retinoic acid, RA)를 신경아세포에 4일간 처리하여 분화를 유도하였다.
1-2. 간성뇌증 유도
세포주의 분화 기간 동안 간성뇌증 신경세포주 모델을 확립하기 위해 30 mM 염화암모늄 (Ammonium chloride, NH4Cl)을 24시간 처리하여 간성뇌증이 유도된 것과 유사한 고암모니아 혈증을 유도하였다.
실시예 2. RNA 및 단백질 추출
2-1. RNA 추출
실시예 1에서 배양된 세포로부터 TRIzol (Thermo Fisher Scientific, 미국)시약으로 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA에 DNase1 (Deoxyribonuclease I, Thermo Fisher Scientific, 미국)을 처리하여 추출된 RNA에 잔존하는 DNA를 제거하였다. 그 다음, 상보적 DNA (complementary　DNA, cDNA) 합성을 위해 추출된 RNA의 양을 측정하였다.
2-2. 단백질 추출
또한, 실시예 1에서 배양된 세포로부터 단백질 분해 효소 억제제 (Protease inhibitor), 인산분해효소 억제제 (Phosoahtase inhibitor)를 포함하는 RIPA buffer (Radioimmunoprecipitation assay buffer) 시약으로 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질은 BCA kit (Bicinchoninic acid)로 양을 측정하였다.
실시예 3. 상보적 DNA 합성
2-1에서 수득한 RNA를 랜덤 핵사머 (Random hexamer) 및 리벌트에이드 역전사효소 (RevertAid reverse transcriptase)로 역전사 시켜 상보적 DNA를 합성하였다. 이 중, 하기 표 1 및 2와 같이 서열번호 1 및 2로 표기한 인간의 긴 비암호화 RNA의 발현을 확인할 수 있는 프라이머를 제조하여 정략적인 (quantitative) RT-PCR을 수행하였다.
서열번호 명칭 서열 (5'---> 3') bp
1 Human lncRNA ZFAS1 (hg19) cgggggcccagggtggagagcacgagggcctggcccaggcacggcc
ggcgcctccgccctcgaggagggcgtcacctcagctccccccggcg
gcggagccggcgggctcaggcgggcgcggctgaggggagcggaccg
cggggggcgggagatgactgcgcccaaggcctttgcgggcctcagc
cggccccagaggaaggggaacccgtcgagcggtttggtgcgtgtga
agcgcgacatggcgaggaagcggacaagcccgggtggcccggcgtg
tagagggaagggggcggggctagacgcggcctggacaactactaga
gcgcctcgggctgtgctgctcgagactacatttcccagagcgacgc
gcgcggagcgggcgggaaagagagcgtttcgggtccagtgcgcgtt
aggtgcgaaagccatctttggttatataagggagcaggaagccatt
cgttctttcgcgtctgcggtgcccggagtgtggtacttctcctagt
tgcagtcaggcttcatacgctattgtcctgcccgttagagcagcca
gcgggtacagaatggattttggaagagggagtcaccactggacctc
caaggaagccacgtgcagacatctacaaccttcgatctcctgacga
gtttattgttggccaaaaccaggctttgattgaaccaggatgaatg
cgggtgttggaagtagaatatatatatacatataaaattggttggg
agccacgtgtaccagtgtgtgttgatcttggcttgattcagtctgc
cttgtaacagaaactggcgatggaatatgagaggagccctctggaa
agaaaaggacagaccctgtgctttcatgaaagtgaagatctggctg
aaccagttccacaaggttactgtatacatagcctgagtttaaaagg
ctgtgcccacttcaagaatgtcattgttagactttgaaatttctaa
ctgcctacctgcataaagaaaataaaatcttttaaatcaa		 1006
2 Human lncRNA GAS5 (hg19) tttcgaggtaggagtcgactcctgtgaggtatggtgctgggtgcag
atgcagtgtggctctggatagcaccttatggacagttgtgtcccca
aggaaggatgagaatagctactgaagtcctaaagagcaagcctaac
tcaagccattggcacacaggcattagacagaaagctggaagttgaa
atggtggagtccaacttgcctggaccagcttaatggttctgctcct
ggtaacgtttttatccatggatgacttgcttgggtaaggacatgaa
gacagttcctgtcataccttttaaaggtatggagagtcggcttgac
tacactgtgtggagcaagttttaaagaagcaaaggactcagaattc
atgattgaagaaatgcaggcagacctgttatcctaaactagggttt
ttaatgaccacaacaagcaagcatgcagcttactgcttgaaagggt
cttgcctcacccaagctagagtgcagtggcctttgaagcttactac
agcctcaaacttctgggctcaagtgatcctcagcctcccagtggtc
tttgtagactgcctgatggagtctcatggcacaagaagattaaaac
agtgtctccaattttaataaatttttgcaatcca		 632
서열번호 명칭 서열 (5'---> 3') bp
3 ZFAS1_human_Fw1 ATTTTGGAAGAGGGAGTCACC 21
4 ZFAS1_human_Rev1 ATTCTACTTCCAACACCCGC 20
5 GAS5_human_Fw1 GGCAGACCTGTTATCCTAAACTAG 24
6 GAS5_human_Rev1 CTCCATCAGGCAGTCTACAAAG 22
RT-PCR 결과, 하기 표 3과 같이 ZFAS1 142 bp 및 GAS5 188 bp의 상보적 DNA 산물이 증폭되었다.
서열번호 명칭 서열 (5'---> 3') bp
7 ZFAS1 DNA product attttggaagagggagtcaccactggacctccaaggaagccacgtgcagacat
ctacaaccttcgatctcctgacgagtttattgttggccaaaaccaggctttga
ttgaaccaggatgaatgcgggtgttggaagtagaat		 142
8 GAS5 DNA product ggcagacctgttatcctaaactagggtttttaatgaccacaacaagcaagcat
gcagcttactgcttgaaagggtcttgcctcacccaagctagagtgcagtggcc
tttgaagcttactacagcctcaaacttctgggctcaagtgatcctcagcctcc
cagtggtctttgtagactgcctgatggag		 188
실시예 4. siRNA의 제작
긴 비암호화 RNA의 기능을 확인하기 위해, 하기 표 4 및 5와 같은 긴 비암호화 RNA ZFAS1 및 GAS5를 녹다운 시키기 위한 siRNA (작은간섭 RNA, 이하, siRNA)를 제작하였다. siRNA의 제작을 위해 Dharmacon sidesign center를 활용하였고, siRNA 서열이 내부에 2차 구조를 형성하지 않는 것을 확인한 뒤 제작을 완료하였다.
서열번호 명칭 서열 (5'---> 3') bp
9 ZFAS1#1_siRNA_sense AUACAUAGCCUGAGUUUAU 19
10 ZFAS1#1_siRNA_antisense UUAAACUCAGGCUAUGUAUAC 21
11 ZFAS1#2_siRNA_sense CAGAAUGGAUUUUGGAAGU 19
12 ZFAS1#2_siRNA_antisense UCUUCCAAAAUCCAUUCUGUA 21
서열번호 명칭 서열 (5'---> 3') bp
13 GAS5#1_siRNA_sense ACUCAGAAUUCAUGAUUGU 19
14 GAS5#1_siRNA_antisense UCAAUCAUGAAUUCUGAGUCC 21
15 GAS5#2_siRNA_sense GAAGGAUGAGAAUAGCUA 19
16 GAS5#2_siRNA_antisense UAGCUAUUCUCAUCCUUCCUU 21
실시예 5. 암모니아 레벨 측정
긴 비암호화 RNA ZFAS1 또는 GAS5의 발현 조절이 세포 내 암모니아 대사에 주는 영향을 확인하기 위해 siRNA 트랜스펙션 (transfection)을 수행하였다. 긴 비암호화 ZFAS1 또는 긴 비암호화 RNA GAS5의 녹다운 (knockdown)을 위해 6-웰 플레이트에 각 웰 당 3.8 X 105의 세포를 접종하고, 1일 후에 신경세포 분화를 위해 20 uM 레티노익산 (Retinoic acid, RA)을 처리하였다. 그 다음, 2일 후에 긴 비암호화 RNA ZFAS1 또는 긴 비암호화 RNA GAS5를 녹다운 시키기 위하여 실시예 4에서 제작한 ZFAS1#1_siRNA, ZFAS1#2_siRNA, GAS5#1_siRNA, GAS5#2_siRNA를 각 웰 당 siRNA 30 ng을 처리하여 트랜스펙션을 하였다. 이때, 긴 비암호화 RNA ZFAS1 또는 긴 비암호화 RNA GAS5의 녹다운에 따른 암모니아 레벨을 비교하기 위해 대조군으로 네거티브 컨트롤 siRNA를 사용하였다. 암모니아 레벨 측정은 리포펙타민TM 3000을 트랜스펙션 제제로 사용하였다. 트랜스펙션 1일 후에 30 mM의 염화암모늄을 처리하여 간성뇌증을 유도하였고, 1일 후 세포 내 암모니아 레벨을 측정하기 위해 신경세포 용해물, 신경세포 배양 배지를 수득하였다. 세포 내 암모니아 레벨 측정은 PocketChemTMBA를 사용하여 측정하였고, 측정 결과를 표 6, 7 및 도 1, 2에 나타내었다.
Cell lysis
NH₄Cl (30mM)		 siCtr siZFAS#1 siZFAS#2
- + - + - +
1 300 4980 420 2295 490 2010
2 310 4050 550 1965 480 1965
3 440 4650 480 1698 490 1905
Cell supernatant
NH₄Cl (30mM)		 siCtr siZFAS#1 siZFAS#2
- + - + - +
1 772 14222 1452 9782 1522 9622
2 642 12742 1392 7942 1422 9462
3 792 11862 1282 7742 1272 7542
표 6 및 도 1에서 확인할 수 있듯이, ZFAS1#1_siRNA 및 ZFAS1#2_siRNA를 주입하여 긴 비암호화 RNA ZFAS1을 녹다운 시킨 경우, 네거티브 컨트롤 siRNA를 트랜스펙션 시킨 경우보다 세포 내 암모니아 농도가 약 60 % 가 감소하는 것을 확인하였다.
Cell lysis
NH₄Cl (30mM)		 siCtr siGAS5#1 siGAS5#2
- + - + - +
1 300 4980 490 1950 490 2010
2 310 4050 600 1695 550 1845
3 440 4650 460 1785 550 1755
Cell supernatant
NH₄Cl (30mM)		 siCtr sGAS5#1 siGAS5#2
- + - + - +
1 772 14222 2042 10382 2092 10742
2 642 12742 1922 8622 1942 9342
3 792 11862 1742 8582 1902 8062
또한, 표 7 및 도 2에서 확인할 수 있듯이, GAS5#1_siRNA 및 GAS5#2_siRNA를 주입하여 긴 비암호화 RNA GAS5를 각각 녹다운 시킨 경우, 네거티브 컨트롤 siRNA를 트랜스펙션 시킨 경우보다 암모니아 농도가 약 60 %가 감소하는 것을 확인하였다.
간성뇌증 환경과 같이 신경세포에 암모니아가 노출을 유도했을 때, 세포 내 암모니아 농도가 증가하는 것을 확인하였다. 반면, 긴 비암호화 RNA ZFAS1 또는 긴 비암호화 RNA GAS5의 발현을 억제하면 세포 내 암모니아 농도를 약 60 % 억제할 수 있음을 확인하였다.
즉, 긴 비암호화 RNA ZFAS1 또는 긴 비암호화 RNA GAS5의 발현 억제를 통하여 증가된 세포 내 암모니아 농도를 감소시킬 수 있는 것을 확인하였다. 또한, 신경세포의 배양 배지로의 암모니아 방출 또한 감소하는 것으로 보아 긴 비암호화 RNA ZFAS1 또는 긴 비암호화 RNA GAS5는 신경세포의 암모니아 대사를 조절하는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6. 단백질 발현 측정
긴 비암호화 RNA ZFAS1 또는 긴 비암호화 RNA GAS5의 발현 억제가 신경세포 사멸에 주는 영향을 확인하기 위해 siRNA 트랜스펙션을 수행하였다. 세포 접종과 siRNA를 이용한 긴 비암호화 RNA ZFAS1 또는 긴 비암호화 RNA GAS5의 녹다운은 실시예 4와 동일하게 수행하였다.
단백질 발현을 측정하기 위해 실시예 2에서 수득한 단백질에 세포 사멸 관련 마커인 Caspase 3 및 Parp1의 발현을 확인하여 그 결과를 하기 표 8, 9 및 도 3a 내지 4b에 나타내었다.
Clevaed-Caspae3
NH₄Cl (30mM)		 siCtr siZFAS#1 siZFAS#2
- + - + - +
1 0.91824 1.399792 0.899162 0.744688 0.80992 0.774891
2 1.082169 1.603982 0.979834 1.103724 0.907075 1.083454
3 0.999591 1.493098 1.002371 1.106739 1.010686 0.835297
Clevaed-Parp1
NH₄Cl (30mM)		 siCtr siZFAS#1 siZFAS#2
- + - + - +
1 0.903784 0.992511 0.758136 0.8129 0.782958 0.851988
2 0.892474 1.195483 0.739522 0.926655 0.690123 0.765362
3 0.889778 1.12597 0.557782 0.81915 0.534234 0.613269
표 8 및 도 3a, 3b에서 확인할 수 있듯이, ZFAS1#1_siRNA 및 ZFAS1#2_siRNA를 주입하여 긴 비암호화 RNA ZFAS1를 녹다운 시킨 경우, 네거티브 컨트롤 siRNA를 트랜스펙션 시킨 경우보다 암모니아에 의한 세포사멸이 약 30 % 억제된 것을 나타내었다.
Clevaed-Caspae3
NH₄Cl (30mM)		 siCtr siGAS5#1 siGAS5#2
- + - + - +
1 0.962081 1.411068 0.766038 0.784666 1.004432 1.049825
2 1.049015 1.529051 0.935582 1.08256 0.670286 0.942275
3 0.988904 1.397984 1.076614 1.085273 0.945695 0.658
Clevaed-Parp1
NH₄Cl (30mM)		 siCtr siGAS5#1 siGAS5#2
- + - + - +
1 0.957815 1.344763 1.071172 1.047333 1.112287 1.168972
2 0.929298 1.249668 0.746837 0.970434 0.911244 0.924655
3 1.112887 1.365689 0.676466 0.898611 0.903078 0.914918
삭제
표 9 및 도 4a, 4b에서 확인할 수 있듯이, GAS5#1_siRNA 및 GAS5#2_siRNA를 주입하여 긴 비암호화 GAS5를 녹다운시킨 경우, 네거티브 컨트롤 siRNA를 트랜스펙션 시킨 경우보다 암모니아에 의한 세포사멸이 약 30 % 억제된 것을 확인하였다.
실시예 7. 신경가지 성장 염색 및 정량
간성뇌증이 유도된 신경세포 내의 긴 비암호화 RNA ZFAS1 또는 긴 비암호화 RNA GAS5를 siRNA로 억제할 때 신경세포 구조에 미치는 영향을 확인하였다. 6-웰 플레이트에 신경아세포종 세포주를 접종하고, 1일 후 20 uM 레티노익산을 처리하여 신경아세포를 신경세포로 분화 시켰다. 그 다음, 2일 후, 분화된 신경세포에 siRNA를 처리하였다. 1일 후 30 mM의 염화암모늄을 처리하였다. 그 다음, 신경가지 성장 염색을 위하여 세포에 생존 염색 시약과 세포막 염색 시약이 담긴 4% 포르말린을 처리하여 20분간 인큐베이션 하였다. 그 다음, 포르말린을 제거하고 백그라운드 억제 시약이 담긴 PBS를 넣고 형광 현미경으로 이미지화 시킨 뒤 Image J 프로그램으로 형광 신호를 정량하여 그 결과를 표 10, 11 및 도 5a 내지 6b에 나타내었다.
Intensity siCtr siZFAS#1 siZFAS#2
NH₄Cl (30mM) - + - + - +
1 0.91408 0.630162 0.88233 0.729737 0.862822 0.769011
2 1.028372 0.688664 0.924989 0.850386 1.012318 0.754876
3 0.926417 0.729032 0.871225 0.792226 0.978738 0.783495
4 1.119841 0.717952 1.015788 0.941973 0.924992 0.809928
5 1.01129 0.613602 0.969761 0.853698 0.951154 0.866967
표 10 및 도 5a, 5b에서 확인할 수 있듯이, ZFAS1#1_siRNA 및 ZFAS1#2_siRNA를 트랜스팩션 하여 긴 비암호화 RNA ZFAS1을 녹다운 시킨 경우, 네거티브 컨트롤 siRNA를 트랜스펙션 시킨 경우보다 신경세포 가지에서의 형광 신호가 약 12 % 증가한 것을 확인하였다.
Intensity siCtr siGAS5#1 siGAS5#2
NH₄Cl (30mM) - + - + - +
1 0.91408 0.630162 0.863799 0.773271 0.944316 0.881893
2 1.028372 0.688664 0.851743 0.851743 0.960613 0.86058
3 0.926417 0.729032 0.77592 0.77592 0.885992 0.843631
4 1.119841 0.717952 0.785134 0.785134 0.796122 0.883218
5 1.01129 0.613602 0.847803 0.847803 1.012139 0.884785
또한, 표 11 및 도 6a, 6b에서 확인할 수 있듯이, GAS5#1_siRNA 및 GAS5#2_siRNA를 트랜스펙션 하여 긴 비암호화 RNA GAS5를 녹다운 시킨 경우, 네거티브 컨트롤 siRNA를 트랜스펙션 시킨 경우보다 신경세포 가지에서의 형광 신호가 약 12 % 증가한 것을 확인하였다.
이를 통해, 암모니아에 의해 손상된 신경세포가 긴 비암호화 RNA ZFAS1 또는 긴 비암호화 RNA GAS5의 녹다운으로 인해 기능을 회복한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 8. 신경세포 구조적 복잡성 분석
안정한 환경에서 신경가지의 분화가 진행될수록 신경 가지 길이가 증가하는 것과 하나의 소마로부터 나오는 신경 가지의 수가 증가하는 것은 신경이 형성되었음을 의미한다. 무작위로 200개의 신경가지의 길이신장 및 한 개의 소마로부터 나오는 신경가지의 수를 측정하여 긴 비암호화 RNA ZFAS1 또는 GAS5의 발현 억제가 신경세포 구조적 복잡성에 미치는 영향을 확인하였다.
구체적으로, 6-웰 플레이트에 신경아세포종 세포주를 접종하였다. 1일 후, 20 uM 레티노익산을 처리하여 신경세포로 분화 시키고, 2일 후에 ZFAS1#1_siRNA, ZFAS1#2_siRNA, GAS5#1_siRNA 및 GAS5#2_siRNA로 트랜스펙션하여 긴 비암호화 RNA ZFAS1 또는 긴 비암호화 GAS5를 녹다운 시켰다. 1일 후, 30 mM 염화암모늄을 처리하였다. 그 다음, 염화암모늄 처리 다음날 각 실험군의 세포 이미지를 촬영하였다. 신경가지 길이신장, 소마로부터 나오는 신경가지의 수는 Image J 프로그램을 이용하여 측정하였고, 그 결과를 도 7a 내지 8b에 나타내었다.
도 7a 및 7b에서 확인할 수 있듯이, ZFAS1#1_siRNA 및 ZFAS1#2_siRNA로 트랜스펙션하여 ZFAS1를 녹다운 시킨 경우, 네거티브 컨트롤 siRNA를 트랜스펙션 시킨 경우보다 신경가지 길이신장, 소마로부터 나오는 신경가지의 수가 증가한 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 8a 및 8b에서 확인할 수 있듯이, GAS5#1_siRNA 및 GAS5#2_siRNA로 트랜스펙션하여 GAS5를 녹다운 시킨 경우, 네거티브 컨트롤 siRNA를 트랜스펙션 시킨 경우보다 신경가지 길이신장, 소마로부터 나오는 신경가지의 수가 증가한 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해, 암모니아에 의해 약화된 신경세포 구조적 복잡성이 긴 비암호화 RNA ZFAS1 또는 긴 비암호화 RNA GAS5의 녹다운으로 인해 회복되었음을 확인하였다.
<110> University Cooperation Foundation Chonnam University <120> Maker for diagnosis of neurological or psychological disorder related diseases caused by hepatic encephalopathy and method for providing information to need to diagnosis of neurological or psychological disorder related diseases caused by hepatic encephalopathy using of <130> PN210207 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1006 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Human lncRNA ZFAS1 (hg19) <400> 1 cgggggccca gggtggagag cacgagggcc tggcccaggc acggccggcg cctccgccct 60 cgaggagggc gtcacctcag ctccccccgg cggcggagcc ggcgggctca ggcgggcgcg 120 gctgagggga gcggaccgcg gggggcggga gatgactgcg cccaaggcct ttgcgggcct 180 cagccggccc cagaggaagg ggaacccgtc gagcggtttg gtgcgtgtga agcgcgacat 240 ggcgaggaag cggacaagcc cgggtggccc ggcgtgtaga gggaaggggg cggggctaga 300 cgcggcctgg acaactacta gagcgcctcg ggctgtgctg ctcgagacta catttcccag 360 agcgacgcgc gcggagcggg cgggaaagag agcgtttcgg gtccagtgcg caggtgcgaa 420 agccatcttt ggttatataa gggaggttca ggaagccatt cgttctttcg cgtctgcggt 480 gcccggagtg tggtacttct cctagttgca gtcaggcttc atacgctatt gtcctgcccg 540 ttagagcagc cagcgggtac agaatggatt ttggaagagg gagtcaccac tggacctcca 600 aggaagccac gtgcagacat ctacaacctt cgatctcctg acgagtttat tgttggccaa 660 aaccaggctt tgattgaacc aggatgaatg cgggtgttgg aagtagaata tatatataca 720 tataaaattg gttgggagcc acgtgtacca gtgtgtgttg atcttggctt gattcagtct 780 gccttgtaac agaaactggc gatggaatat gagaggagcc ctctggaaag aaaaggacag 840 accctgtgct ttcatgaaag tgaagatctg gctgaaccag ttccacaagg ttactgtata 900 catagcctga gtttaaaagg ctgtgcccac ttcaagaatg tcattgttag actttgaaat 960 ttctaactgc ctacctgcat aaagaaaata aaatctttta aatcaa 1006 <210> 2 <211> 632 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Human lncRNA GAS5 (hg19) <400> 2 tttcgaggta ggagtcgact cctgtgaggt atggtgctgg gtgcagatgc agtgtggctc 60 tggatagcac cttatggaca gttgtgtccc caaggaagga tgagaatagc tactgaagtc 120 ctaaagagca agcctaactc aagccattgg cacacaggca ttagacagaa agctggaagt 180 tgaaatggtg gagtccaact tgcctggacc agcttaatgg ttctgctcct ggtaacgttt 240 ttatccatgg atgacttgct tgggtaagga catgaagaca gttcctgtca taccttttaa 300 aggtatggag agtcggcttg actacactgt gtggagcaag ttttaaagaa gcaaaggact 360 cagaattcat gattgaagaa atgcaggcag acctgttatc ctaaactagg gtttttaatg 420 accacaacaa gcaagcatgc agcttactgc ttgaaagggt cttgcctcac ccaagctaga 480 gtgcagtggc ctttgaagct tactacagcc tcaaacttct gggctcaagt gatcctcagc 540 ctcccagtgg tctttgtaga ctgcctgatg gagtctcatg gcacaagaag attaaaacag 600 tgtctccaat tttaataaat ttttgcaatc ca 632 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZFAS1_human_Fw1 <400> 3 attttggaag agggagtcac c 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZFAS1_human_Rev1 <400> 4 attctacttc caacacccgc 20 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAS5_human_Fw1 <400> 5 ggcagacctg ttatcctaaa ctag 24 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAS5_human_Rev1 <400> 6 ctccatcagg cagtctacaa ag 22 <210> 7 <211> 142 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> ZFAS1 DNA product <400> 7 attttggaag agggagtcac cactggacct ccaaggaagc cacgtgcaga catctacaac 60 cttcgatctc ctgacgagtt tattgttggc caaaaccagg ctttgattga accaggatga 120 atgcgggtgt tggaagtaga at 142 <210> 8 <211> 188 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> GAS5 DNA product <400> 8 ggcagacctg ttatcctaaa ctagggtttt taatgaccac aacaagcaag catgcagctt 60 actgcttgaa agggtcttgc ctcacccaag ctagagtgca gtggcctttg aagcttacta 120 cagcctcaaa cttctgggct caagtgatcc tcagcctccc agtggtcttt gtagactgcc 180 tgatggag 188 <210> 9 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZFAS1#1_siRNA_sense <400> 9 auacauagcc ugaguuuau 19 <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZFAS1#1_siRNA_antisense <400> 10 uuaaacucag gcuauguaua c 21 <210> 11 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZFAS1#2_siRNA_sense <400> 11 cagaauggau uuuggaagu 19 <210> 12 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZFAS1#2_siRNA_antisense <400> 12 ucuuccaaaa uccauucugu a 21 <210> 13 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAS5#1_siRNA_sense <400> 13 acucagaauu caugauugu 19 <210> 14 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAS5#1_siRNA_antisense <400> 14 ucaaucauga auucugaguc c 21 <210> 15 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAS5#2_siRNA_sense <400> 15 gaaggaugag aauagcua 18 <210> 16 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAS5#2_siRNA_antisense <400> 16 uagcuauucu cauccuuccu u 21

Claims (23)

  1. ZFAS1 (ZNFX antisense RNA 1) 긴 비암호화 RNA (long-noncoding RNA, lncRNA)와 특이적으로 결합하는 표적 제제 (Target formulation); 및
    GAS5 (Growrh arrest specific 5) 긴 비암호화 RNA와 특이적으로 결합하는 표적 제제;
    로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 고암모니아혈증 (Hyperammonemia)에 의해 유발되는 신경학적 장애 관련 질환 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 ZFAS1 긴 비암호화 RNA는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것인, 진단용 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 GAS5 긴 비암호화 RNA는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것인, 진단용 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 ZFAS1 긴 비암호화 RNA와 특이적으로 결합하는 표적 제제는 서열번호 9의 염기서열 (ZFAS1#1 siRNA sense) 및 서열번호 10의 염기서열 (ZFAS1#1 siRNA antisense)로 이루어진 ZFAS1#1 siRNA; 및
    서열번호 11의 염기서열 (ZFAS1#2 siRNA Sense) 및 서열번호 12의 염기서열 (ZFAS1#1 siRNA antisense)로 이루어진 ZFAS1#2 siRNA; 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 진단용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 GAS5 긴 비암호화 RNA와 특이적으로 결합하는 표적 제제는 서열번호 13의 염기서열 (GAS5#1 siRNA sense) 및 서열번호 14의 염기서열 (GAS5#1 siRNA antisense)로 이루어진 GAS5#1 siRNA; 및
    서열번호 15의 염기서열 (GAS5#2 siRNA sense) 및 서열번호 16의 염기서열 (GAS5#1 siRNA antisense)로 이루어진 GAS5#2 siRNA; 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 진단용 조성물.
  6. 삭제
  7. 다음 단계를 포함하는 고암모니아혈증 (Hyperammonemia)에 의해 유발되는 신경학적 장애 관련 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법:
    분리된 생물학적 시료로부터 ZFAS1 (ZNFX antisense RNA 1) 긴 비암호화 RNA;및
    GAS5 (Growrh arrest specific 5) 긴 비암호화 RNA;
    로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 발현수준을 측정하는 단계.
  8. 제7항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 질환 의심 또는 질환 진단 대상 개체 유래의 세포, 조직, 생검, 체액, 혈액, 혈청, 혈장 및 소변으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 ZFAS1 긴 비암호화 RNA는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것인, 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 GAS5 긴 비암호화 RNA는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것인, 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 ZFAS1 긴 비암호화 RNA 발현수준을 측정하는 단계는 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머 세트를 이용하여 측정하는 단계를 포함하는 것인, 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  12. 제7항에 있어서, 상기 GAS5 긴 비암호화 RNA 발현수준을 측정하는 단계는 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머 세트를 이용하여 측정하는 단계를 포함하는 것인, 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  13. 다음 단계를 포함하는 고암모니아혈증 (Hyperammonemia)에 의해 유발되는 신경학적 장애 관련 질환 치료제 스크리닝 방법:
    후보 물질을 ZFAS1 (ZNFX antisense RNA 1) 긴 비암호화 RNA; 및
    GAS5 (Growrh arrest specific 5) 긴 비암호화 RNA;
    로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 과발현하는 세포에 처리하는 처리 단계; 및
    세포의 긴 비암호화 RNA의 발현량을 측정하는 측정 단계.
  14. 제13항에 있어서, 상기 후보 물질은 서열번호 9의 염기서열 (ZFAS1#1 siRNA sense) 및 서열번호 10의 염기서열 (ZFAS1#1 siRNA antisense)로 이루어진 ZFAS1#1 siRNA; 및
    서열번호 11의 염기서열 (ZFAS1#2 siRNA Sense) 및 서열번호 12의 염기서열 (ZFAS1#1 siRNA antisense)로 이루어진 ZFAS1#2 siRNA; 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 치료제 스크리닝 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 후보 물질은 서열번호 13의 염기서열 (GAS5#1 siRNA sense) 및 서열번호 14의 염기서열 (GAS5#1 siRNA antisense)로 이루어진 GAS5#1 siRNA; 및
    서열번호 15의 염기서열 (GAS5#2 siRNA sense) 및 서열번호 16의 염기서열 (GAS5#1 siRNA antisense)로 이루어진 GAS5#2 siRNA; 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 치료제 스크리닝 방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 ZFAS1 긴 비암호화 RNA는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것인, 치료제 스크리닝 방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 GAS5 긴 비암호화 RNA는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것인, 치료제 스크리닝 방법.
  18. ZFAS1 (ZNFX antisense RNA 1) 긴 비암호화 RNA (long-noncoding RNA, lncRNA) 발현 억제제; 및
    GAS5 (Growrh arrest specific 5) 긴 비암호화 RNA 발현 억제제;
    를 포함하는, 고암모니아혈증 (Hyperammonemia)에 의해 유발되는 신경학적 장애 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 ZFAS1 긴 비암호화 RNA는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것인, 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  20. 제18항에 있어서, 상기 GAS5 긴 비암호화 RNA는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것인, 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  21. 제18항에 있어서, 상기 ZFAS1 긴 비암호화 RNA 발현 억제제는 서열번호 9의 염기서열 (ZFAS1#1 siRNA sense) 및 서열번호 10의 염기서열 (ZFAS1#1 siRNA antisense)로 이루어진 ZFAS1#1 siRNA; 및
    서열번호 11의 염기서열 (ZFAS1#2 siRNA Sense) 및 서열번호 12의 염기서열 (ZFAS1#1 siRNA antisense)로 이루어진 ZFAS1#2 siRNA; 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  22. 제18항에 있어서, 상기 GAS5 긴 비암호화 RNA와 특이적으로 결합하는 표적 제제는 서열번호 13의 염기서열 (GAS5#1 siRNA sense) 및 서열번호 14의 염기서열 (GAS5#1 siRNA antisense)로 이루어진 GAS5#1 siRNA; 및
    서열번호 15의 염기서열 (GAS5#2 siRNA sense) 및 서열번호 16의 염기서열 (GAS5#1 siRNA antisense)로 이루어진 GAS5#2 siRNA; 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  23. 삭제
KR1020210075363A 2021-06-10 2021-06-10 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환 진단용 마커 및 이를 이용한 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법 KR102645546B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210075363A KR102645546B1 (ko) 2021-06-10 2021-06-10 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환 진단용 마커 및 이를 이용한 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210075363A KR102645546B1 (ko) 2021-06-10 2021-06-10 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환 진단용 마커 및 이를 이용한 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20220166516A KR20220166516A (ko) 2022-12-19
KR102645546B1 true KR102645546B1 (ko) 2024-03-08

Family

ID=84535513

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210075363A KR102645546B1 (ko) 2021-06-10 2021-06-10 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환 진단용 마커 및 이를 이용한 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102645546B1 (ko)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007529423A (ja) 2004-03-11 2007-10-25 メルク　パテント　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフトング 血清・グルココルチコイド誘導性キナーゼのモジュレータの使用を含む、神経精神疾患を治療するためのグルタミン酸受容体の調節方法
CN111035648B (zh) 2019-12-02 2020-11-24 南通大学 长链非编码rnagas5在制备促进神经再生和修复神经损伤药物中的应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007529423A (ja) 2004-03-11 2007-10-25 メルク　パテント　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフトング 血清・グルココルチコイド誘導性キナーゼのモジュレータの使用を含む、神経精神疾患を治療するためのグルタミン酸受容体の調節方法
CN111035648B (zh) 2019-12-02 2020-11-24 南通大学 长链非编码rnagas5在制备促进神经再生和修复神经损伤药物中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220166516A (ko) 2022-12-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE102007052114B4 (de) Verfahren zur Modulation der Funktion, des Wachstums oder der Differenzierung einer Zelle
EP2476762B1 (de) MicroRNA (miRNA) zur Diagnose und Therapie von Herzerkrankungen
JP6157852B2 (ja) 多繊毛上皮細胞における繊毛の機能不全に関連する疾患を治療するためのマイクロｒｎａの使用
EP2820131A2 (de) Verwendung von micrornas oder genen als marker zur identifizierung, diagnose und therapie einzelner formen nicht-ischämischer kardiomyopathien oder speichererkrankungen des herzens
KR20120041168A (ko) 심부전 또는 심부전 위험성을 방지, 예방 및/또는 측정하기 위한 수단 및 방법
US10612020B2 (en) Artificial mimic miRNA for controlling gene expression, and use of same
US20100151470A1 (en) Methods and compositions for locating snp heterozygosity for allele specific diagnosis and therapy
EP2463372B1 (en) Methods for modulating the expression and aggregation of CAG-expanded gene product in cells and methods for identifying agents useful for doing the same
Quan et al. Expression level of lncRNA PVT1 in serum of patients with coronary atherosclerosis disease and its clinical significance
Qiu et al. Alternative splicing transitions associate with emerging atrophy phenotype during denervation‐induced skeletal muscle atrophy
KR102645546B1 (ko) 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환 진단용 마커 및 이를 이용한 간성뇌증에 의해 유발되는 신경학적 또는 정신학적 장애 관련 질환 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법
KR102105016B1 (ko) miR-485-3p를 이용한 알츠하이머병 진단 방법
CN111603561A (zh) microRNA-425及其类似物作为阿尔茨海默病治疗的核苷酸药物的应用
KR20220099195A (ko) 휴면기 신경줄기세포의 활성 조절 기전에 기반한 자폐 스펙트럼 장애 진단 및 치료방법
KR102074407B1 (ko) miR-485-3p를 이용한 알츠하이머병 진단 방법
KR20200043322A (ko) miR-485-3p를 이용한 알츠하이머병 진단 방법
US20240117432A1 (en) Methods and kits for detecting a risk for developing neurological or neurophysiological disorders
US20220348916A1 (en) Composition for diagnosis or treatment of a condition associated with increased activity of eif4e comprising an eif4e inhibitor
US20240011034A1 (en) INHIBITION OF miR-29b-3p TO ENHANCE NEURONAL SURVIVAL IN HUNTINGTON&#39;S DISEASE
EP4279091A1 (en) Composition comprising mir 145 inhibitor as active ingredient for treatment of myocardial infarction
WO2018121743A1 (zh) miR-96用于保护肝、肌肉、肺和肾及调控血液总蛋白和白蛋白含量及胰岛素抵抗
TW202214265A (zh) 預防、治療及診斷神經退化性疾病的醫藥組成物及方法
US20210145859A1 (en) Mir-17˜92 as therapeutic or diagnostic target of motor neuron (mn) degeneration diseases
CN116115762A (zh) 基于sh3bgr预测患有唐氏综合征风险的方法及应用
WO2019129029A1 (zh) 作为帕金森症诊治标志物的基因及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant