JP6613380B2 - クロモン誘導体の上皮間葉移行抑制活性を利用した線維症予防及び治療用医薬組成物としての新規用途 - Google Patents

クロモン誘導体の上皮間葉移行抑制活性を利用した線維症予防及び治療用医薬組成物としての新規用途 Download PDF

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Description

本発明は、クロモン誘導体の上皮間葉移行抑制活性を利用した線維症予防及び治療用医薬組成物としての新規用途に係り、具体的には、クロモン誘導体が上皮間葉移行(Epithelial Mesenchymal Transition、ＥＭＴ)を抑制することができることを新たに見出すことにより、このような活性を利用して線維症の予防及び治療剤として使用する新規用途に関する。
線維症(fibrosis)は、再生または発生過程で器官または組織に過度な線維性結合組織が形成される疾患である。このような線維性結合組織は、正常な線維組織の形成とは対照的である。器官または組織に線維性結合組織が過剰に形成されると、組織が硬くなり、体液の流入が減少するなど、生体内で本来の機能を十分に行うことができなくなる。その原因としては、傷害、炎症、火傷、放射線、化学療法、リンパ浮腫などが知られている。このような線維症に起因する問題は、線維性結合組織が形成される位置によって異なるが、主に肝、分泌器官、肺などが損傷を受ける。線維症には、代表的に、特発性肺線維症(idiopathic pulmonary fibrosis、ＩＰＦ)、骨髄線維症(myelofibrosis)、肝線維症(liver fibrosis)及び腎臓線維症(kidney fibrosis)がある。
特発性肺線維症は、慢性的に進行する間質性肺疾患の一つであって、病気の経過が良くなく、未だ証明された治療方法がない疾患である。肺の組織検査の結果、ハニカム形状や不定な形状などが確認されるときに診断する。徐々に呼吸困難を誘発し、低酸素症または心筋梗塞により死亡にまで至るなど、経過が良くない。今まで原因として解明されたものはないが、環境、ウイルス、遺伝、毒性化合物などの様々な因子により肺に炎症が誘発され、その炎症が治癒される過程で線維細胞が過剰に増殖して肺に線維化が生じるものと考えられている。
骨髄線維症は、骨髄組織の線維が過剰発育する疾患であって、血を作る機能が低下し、赤血球及び白血球の数、これらの作用に変化が起こるようになる。特発性と続発性に区分される。これらの中でも、特発性の骨髄線維症は、全身骨髄の深刻な線維増殖、肥大症状を示し、末梢血中に有核赤血球や幼若顆粒球が現れる。その原因は確かではなく、骨髄の中毒や炎症などがその原因として考えられている。続発性の骨髄線維症は、白血病、悪性リンパ腫、癌の骨髄転移、化学薬品の中毒などの経過中に生じる。効果的な治療剤は未だ開発されていない。
肝線維症は、肝硬変症とも呼ばれる。肝線維症は、慢性的な炎症により正常な肝組織が再生結節などの線維化組織に変わって肝の機能が低下する疾患である。慢性Ｂ型肝炎やＣ型肝炎、飲み過ぎ、肝毒性物質などにより肝の炎症状態が持続する場合に主に発生する。治療は、症状の進行を最大限遅らせることを目当てに行われており、その原因に応じて抗ウイルス剤などが使われているが、原因が異なる場合、その効果は未知数である。
腎臓線維症は、細胞外基質が蓄積されて腎臓に線維化が生じる進行性疾患であり、糸球体硬化症と尿細管間質性線維症が特徴である。腎臓の線維化により腎臓の機能に副作用がもたらされる。その原因には外傷、感染、手術、環境的な要因、化学物質、放射線被ばくなどがあり、疼痛、排尿関連問題、吐き気、嘔吐などの症状が生じることがある。薬物や腎移植によって症状を管理するが、やはり効果的な治療剤の開発が求められる。
一方、Ｇｒａｎｄｅ等は、最近、上皮間葉移行(Epithelial Mesenchymal Transition、ＥＭＴ)（以下、「ＥＭＴ」という。）の主要調節因子であるＴｗｉｓｔあるいはＳｎａｉｌが腎臓の線維化で重要な役割を担うという研究結果を提示しており、Ｌｏｖｉｓａ等も、ＥＭＴが腎臓線維症で重要な役割を果たすと提示している。ＥＭＴは、正常細胞が腫瘍細胞に変わりながら中間段階である細胞骨格の変化により、細胞が移動しやすい間葉細胞(mesenchymal cell)の形状に遺伝的に再プログラミング(genetic reprogramming)される現象をいう。したがって、ＥＭＴ関与タンパク質の発現を抑制すると、腫瘍の転移及び増殖を抑制することができると考え、様々な研究者が、腫瘍治療剤を開発するために、このようなＥＭＴに関する研究を行っている。このＥＭＴの調節因子としては、Ｔｗｉｓｔ、Ｓｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ、ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ｃｏｌｌａｇｅｎ１ α１など、約数百個のものが知られている。
Ｓｕｚｕｋｉ等は、ＤＥＣ２（ＢＨＬＨＥ４１）が、このようなＥＭＴ調節因子であるＴｗｉｓｔの転写抑制因子であり、その発現を阻害すると、ＥＭＴが活性化されて悪性腫瘍に転換されることを報告した。また、Ｓａｔｏ等は、ＤＥＣ２が、ＥＭＴ調節因子であるＳｌｕｇの発現を抑制し、これにより、ＴＧＦ−βで誘導される悪性腫瘍化を抑制することを報告した。この他にも、様々な研究者等が、ＤＥＣ２などのＥＭＴ調節因子ががん転移などに関連することを報告している。
このようにＥＭＴ及び該ＥＭＴの調節因子に関する研究は、ほとんど、がんまたは腫瘍についてのみ行われてきた。しかし、本発明者は、従来の一部の研究結果に基づいてＥＭＴと線維症との連関性に着目し、ＥＭＴを調節することができれば線維症を予防及び治療することもできるものと期待している。
一方、クロモン（クロモン(chromone)、クロメン−４−オン(chromen-4-one)、４Ｈ−クロメン−４−オン(4H-chromen-4-one)）構造を持つ自然化合物には、代表的に、オイパチリン(eupatilin)、オウゴニン(wogonin)、ミリセチン(myricetin)などがあり、これらの中でも、オイパチリンは、ニシヨモギ（ヨモギ、Artemisia asiatica）に含まれる成分として知られており、従来から主に抗がん効果についての研究が行われてきた。本発明者は、ＥＭＴと線維症との連関性、及びＤＥＣ２とＥＭＴとの連関性に着目し、オイパチリンが、骨髄細胞から分化されたマクロファージのＤＥＣ２ ｍＲＮＡを上方調節するという観察から、オイパチリンを含むクロモン誘導体の線維症治療剤としての可能性を研究するようになった。その結果、このようなクロモン誘導体がＥＭＴを抑制することができることを、細胞モデル及び動物モデルを用いて新たに明らかにし、これにより、ＥＭＴの活性化による器官または組織の線維化をこれらの化合物が効果的に抑制することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
Grande MT, Sanchez-Laorden B, Lopez-Blau C, De Frutos CA, Boutet A, Arevalo M, Rowe RG, Weiss SJ, Lopez-Novoa JM, Nieto MA. Snail1-induced partial epithelial-to-mesenchymal transition drives renal fibrosis in mice and can be targeted to reverse established disease. Nat Med. 2015 Sep;21(9):989-97. Lovisa S, LeBleu VS, Tampe B, Sugimoto H, Vadnagara K, Carstens JL, Wu CC, Hagos Y, Burckhardt BC, Pentcheva-Hoang T, Nischal H, Allison JP, Zeisberg M, Kalluri R. Epithelial-to-mesenchymal transition induces cell cycle arrest and parenchymal damage in renal fibrosis. Nat Med. 2015 Sep;21(9):998-1009. Suzuki M, Sato F, Bhawal UK. The basic helix-loop-helix(bHLH) transcription factor DEC2 negatively regulates Twist1 through an E-box element. Biochem Biophys Res Commun. 2014 Dec 12;455(3-4):390-5. Sato F, Kawamura H, Wu Y, Sato H, Jin D, Bhawal UK, Kawamoto T, Fujimoto K, Noshiro M, Seino H, Morohashi S, Kato Y, Kijima H. The basic helix-loop-helix transcription factor DEC2 inhibits TGF-β-induced tumor progression in human pancreatic cancer BxPC-3 cells. Int J Mol Med. 2012 Sep;30(3):495-501. Dong Y, Geng Y, Li L, Li X, Yan X, Fang Y, Li X, Dong S, Liu X, Li X, Yang X, Zheng X, Xie T, Liang J, Dai H, Liu X, Yin Z, Noble PW, Jiang D, Ning W. Blocking follistatin-like 1 attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice. J Exp Med. 2015 Feb 9;212(2):235-52.
本発明の主な目的は、クロモン誘導体を線維症の予防及び治療剤として使用する新規用途を提供することにある。
本発明の他の目的は、線維症の予防及び治療のための新規な医薬組成物を提供することにある。本発明の別の目的は、線維症を効果的に予防及び治療する方法を提供することにある。
本発明の一態様によれば、本発明は、下記化学式１で表されるクロモン誘導体及びその製薬学的に許容される塩から選択された化合物を有効成分として含有する、生体の器官または組織の線維化による疾患の予防及び治療用医薬組成物を提供する。
（式中、Ｒ１は水素、ヒドロキシル基、メトキシ基、トリフルオロメチル基またはアセトキシ基であり、Ｒ２はメチル基、エチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、フェニル基またはベンジル基であり、Ｒ３は水素、エチル基、アセチル基、アセトキシ基、カルボキシル基、ベンゾイルオキシ基または３，４，５−トリヒドロキシベンゾイルオキシ基であり、Ｒ４乃至Ｒ６はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシル基、メチル基、メトキシ基、アセトキシ基、カルボキシル基またはベンゾイルオキシ基である。）
本発明の医薬組成物は、生体の器官または組織の線維化による疾患の中でも、特発性肺線維症(idiopathic pulmonary fibrosis)、骨髄線維症(myelofibrosis)、肝線維症(liver fibrosis)及び腎臓線維症(kidney fibrosis)よりなる群から選択された疾患の予防及び治療に特に効果的であり得る。
本発明の医薬組成物において、前記Ｒ１はヒドロキシル基またはメトキシ基であり、前記Ｒ２はメチル基であり、前記Ｒ３は水素であり、前記Ｒ５はヒドロキシル基またはメトキシ基であり、前記Ｒ４及びＲ６はそれぞれ独立して水素、ヒドロキシル基またはメトキシ基であることが好ましい。
本発明の医薬組成物において、前記クロモン誘導体は、２−（３，４−ジメトキシフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−６−メトキシ−クロモン（オイパチリン、化学式２）、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−６−メトキシ−クロモン（化学式３）、５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−６−メトキシ−クロモン（化学式４）、５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシフェニル）−６−メトキシ−クロモン（化学式５）、５−ヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシフェニル）−６，７−ジメトキシ−クロモン（化学式６）、及び２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−５−ヒドロキシ−６，７−ジメトキシ−クロモン（化学式７）の中から選択されたいずれかであり得る。
本発明の医薬組成物は、化学式１のクロモン誘導体を有効成分として含有することにより、ＥＭＴの活性化を効果的に抑制することができ、これにより、ＥＭＴの活性化により誘導される器官または組織の線維化を効果的に抑制することができる。特に、既に線維化してしまった細胞を本来の正常な形態に戻すことができるため、線維症を予防または初期対応することに止まらず、線維症が進行している中期または末期の症状も治療することができる。
本発明のクロモン誘導体の一つであるオイパチリンの合成過程を示す図である。 骨髄細胞から分化したマクロファージにおけるオイパチリンのＤＥＣ２ ｍＲＮＡ発現増加効果を示すグラフである。 オイパチリンの線維化阻害効果を示すもので、各実験群のマウス１匹から３部分の肺組織を回収した後、マッソントリクローム染色(masson's trichrome staining)して顕微鏡で撮影した写真である。正常対照群：ブレオマイシン及びオイパチリン(Eupatilin)を投与せず、ビヒクル(Vehicle)だけを投与して飼育した正常マウス、ブレオマイシン投与群：ブレオマイシンを投与して肺線維化を誘導したマウス、ブレオマイシン＋オイパチリン投与群：ブレオマイシンを投与して肺線維化を誘導し、オイパチリン（４０μｇ）を投与したマウス。 線維化細胞モデルで製造したＯＮＧＨＥＰＡ１細胞株のＩＨＣ分析結果を示すもので、この細胞株が中胚葉由来の細胞であって肝細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）ではないので、肝星状細胞(Hepatic Stellate Cells、ＨＳＣ)（以下、「ＨＳＣ」という。）系統の細胞であることが分かる。左：ａｎｔｉ−ＧＡＴＡ４抗体反応陽性化を用いたＩＨＣの結果、右：ａｎｔｉ−ＣＫ−１８抗体反応陰性化を用いたＩＨＣの結果。 ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞株のＦＡＣＳ分析結果を示すもので、ＯＮＧＨＥＰＡ１は、肝の間葉幹細胞であって、生体膜タンパク質であるＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７１及びＣＤ１０６を発現する。 オイパチリン（以下、図面における「パイパチリン（Ｅｕｐａｔｉｌｉｎ）」の略字である「Ｅｕｐ」を使用）処理下の線維化阻害効果の実験結果を示すもので、ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞の培養時間（６時間、１２時間、２４時間、４８時間経過時点）及び薬物処理による顕微鏡写真を示すものである。対照群：別の処理なしにＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、６ｈ〜４８ｈ ＴＧＦβ：培養液にＴＧＦ−β（５ｎｇ／ｍＬ、以下の他の図面においても、ＴＧＦ−βは５ｎｇ／ｍＬの濃度で処理したものである。）を添加し、６〜４８時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、６ｈ〜４８ｈ ＴＧＦβ Ｅｕｐ（５０μＭ）：培養液にＴＧＦ−β及びオイパチリン（５０μＭ、以下の他の図面においても、オイパチリン及びクロモン誘導体は５０μＭの濃度で処理したものである。）を添加し、６〜４８時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群。 オイパチリンの線維化阻害効果の実験結果を示すもので、オイパチリンをまずＯＮＧＨＥＰＡ１細胞に処理した後、洗浄してオイパチリンを除去し、ＴＧＦ−βを処理して線維化を誘導したときの顕微鏡写真を示すものである。ＤＭＳＯ：培養液にＤＭＳＯ（オイパチリンの溶媒）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、Ｅｕｐ：培養液にオイパチリンを添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、ＴＧＦβ：培養液にＴＧＦ−βを添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、ＴＧＦβ＋ＤＭＳＯ：培養液にＴＧＦ−β及びＤＭＳＯを添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、ＴＧＦβ＋Ｅｕｐ：培養液にＴＧＦ−β及びオイパチリンを添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、Ｅｕｐ−２ｈｒ〜６ｈｒＴＧＦβ：培養液にオイパチリンを添加し、２〜６時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した後、洗浄してオイパチリンを除去し、ＴＧＦ−βを添加して２４時間培養した実験群。 オイパチリンの線維化阻害効果の実験結果を示すもので、ＴＧＦ−βをまずＯＮＧＨＥＰＡ１細胞に処理して線維化を誘導した後、洗浄してＴＧＦ−βを除去し、オイパチリンを処理したときの顕微鏡写真を示すものである。ＤＭＳＯ：培養液にＤＭＳＯ（オイパチリンの溶媒）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、Ｅｕｐ：培養液にオイパチリンを添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、ＴＧＦβ：培養液にＴＧＦ−βを添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、ＴＧＦβ＋ＤＭＳＯ：培養液にＴＧＦ−β及びＤＭＳＯを添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、ＴＧＦβ＋Ｅｕｐ：培養液にＴＧＦ−β及びオイパチリンを添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、ＴＧＦβ−１ｈｒ〜１２ｈｒＥｕｐ：培養液にＴＧＦ−βを添加し、１〜１２時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した後、洗浄してＴＧＦ−βを除去し、オイパチリンを添加して２４時間培養した実験群。 オイパチリンの線維化逆転効果の実験結果を示すもので、ＴＧＦ−βをまずＯＮＧＨＥＰＡ１細胞に処理して線維化を誘導した後、洗浄してＴＧＦ−βを除去し、オイパチリンまたはＴＧＦ−βを処理したときの顕微鏡写真を示すものである。ＴＧＦβ ２４ｈｒ ＆ ｗａｓｈ：培養液にＴＧＦ−βを添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した後、洗浄してＴＧＦ−βを除去し、２４時間培養した対照群、ＴＧＦβ＋ＴＧＦβ：培養液にＴＧＦ−βを添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した後、洗浄してＴＧＦ−βを除去し、さらにＴＧＦ−βを添加して２４時間培養した対照群、ＴＧＦβ＋Ｅｕｐ：培養液にＴＧＦ−βを添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した後、洗浄してＴＧＦ−βを除去し、オイパチリン（５０μＭ）及びＴＧＦ−βを添加して２４時間培養した実験群。 オイパチリンのＥＭＴ阻害効果の実験結果を示すもので、ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞の処理によるＣｏｌ１、Ｖｉｍ及びＴｗｉｓｔの発現様相を分析した実時間ＲＴ−ＰＣＲの結果を示すグラフである。Ｃｏｎｔ：別の処理なしにＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を２４時間培養した対照群、Ｅｕｐ：培養液にオイパチリンを添加してＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を２４時間培養した対照群、ＴＧＦβ：培養液にＴＧＦ−βを添加してＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を２４時間培養した対照群、ＴＧＦβ＋Ｅｕｐ：培養液にＴＧＦ−β及びオイパチリンを添加してＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を２４時間培養した実験群。 クロモン誘導体の線維化阻害効果の実験結果を示すもので、ＴＧＦ−βを処理して線維化を誘導し、各５０μＭのクロモン誘導体を処理したときの顕微鏡写真を示すものである。ＤＭＥＭ：別の処理なしにＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、ＴＧＦβ：培養液にＴＧＦ−βを添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、ＴＧＦβ＋Ｅｕｐ：培養液にＴＧＦ−β及びオイパチリンを添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＡ１００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＡ１００（化学式８）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＩ３００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＩ３００（化学式３）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＣ２００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＣ２００（化学式５）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＥ２００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＥ２００（化学式６）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＨ２００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＨ２００（化学式７）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ｗｏｇｏｎｉｎ：培養液にＴＧＦ−β及びオウゴニン（ｗｏｇｏｎｉｎ）（化学式９）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＢ２００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＢ２００（化学式１０）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＥ３００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＥ３００（化学式１１）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＤ２００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＤ２００（化学式１２）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＨ３００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＨ３００（化学式１３）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＤ４００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＤ４００（化学式１４）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群。 クロモン誘導体の線維化阻害効果の実験結果を示すもので、ＴＧＦ−βを処理して線維化を誘導し、各５０μＭのクロモン誘導体を処理したときの顕微鏡写真を示すものである。ＤＭＥＭ：別の処理なしにＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、ＴＧＦβ：培養液にＴＧＦ−βを添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、ＴＧＦβ＋Ｅｕｐ：培養液にＴＧＦ−β及びオイパチリンを添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＡ１００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＡ１００（化学式８）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＩ３００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＩ３００（化学式３）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＣ２００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＣ２００（化学式５）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＥ２００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＥ２００（化学式６）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＨ２００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＨ２００（化学式７）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ｗｏｇｏｎｉｎ：培養液にＴＧＦ−β及びオウゴニン（ｗｏｇｏｎｉｎ）（化学式９）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＢ２００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＢ２００（化学式１０）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＥ３００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＥ３００（化学式１１）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＤ２００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＤ２００（化学式１２）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＨ３００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＨ３００（化学式１３）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群、ＴＧＦβ＋ＯＮＧＤ４００：培養液にＴＧＦ−β及びＯＮＧＤ４００（化学式１４）を添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群。 対照群ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞、線維化を誘導したＯＮＧＨＥＰＡ１細胞、及び線維化を誘導しオイパチリンを処理したＯＮＧＨＥＰＡ１細胞のトランスクリプトーム(transcriptome)を分析した結果を示すものである。対照群：ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞、ＴＧＦβ：培養液にＴＧＦ−βを添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した対照群、ＴＧＦβ＋Ｅｕｐ：培養液にＴＧＦ−β及びオイパチリンを添加し、２４時間ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養した実験群。 正常なＯＮＧＨＥＰＡ１細胞、線維化を誘導したＯＮＧＨＥＰＡ１細胞、及び線維化を誘導しオイパチリンを処理したＯＮＧＨＥＰＡ１細胞で発現が変化する遺伝子の遺伝子誘導倍率(induction fold)及びｐ値(p-value)を比較して示すボルケーノプロット(volcano plot)である。 正常なＯＮＧＨＥＰＡ１細胞、線維化を誘導したＯＮＧＨＥＰＡ１細胞、及び線維化を誘導しオイパチリンを処理したＯＮＧＨＥＰＡ１細胞で発現が有意に変化する遺伝子のインタラクトーム(interactome)を偏りなく(unbiased manner)分析して示すものである。
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものと解釈されてならない。
クロモン誘導体
本実施例では、２−（３，４−ジメトキシフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−６−メトキシ−クロモン（化学式２）（オイパチリン）、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−６−メトキシ−クロモン（化学式３）（以下、「ＯＮＧＩ３００」という。）、５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシフェニル）−６−メトキシ−クロモン（化学式５）（以下、「ＯＮＧＥ２００」という。）、５−ヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシフェニル）−６，７−ジメトキシ−クロモン（化学式６）（以下、「ＯＮＧＣ２００」という。）、及び２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−５−ヒドロキシ−６，７−ジメトキシ−クロモン（化学式７）（以下、「ＯＮＧＨ２００」という。）を含んで、オウゴニンなど、化学式８乃至１４のクロモン誘導体を使用した。
本実施例でのオイパチリンは、図１の過程を経て合成して使用した。
実施例１．ＤＥＣ２発現増加効果の確認
ＤＥＣ２は、ＥＭＴの調節因子であるＴｗｉｓｔ及びＳｌｕｇの転写抑制因子として知られている。本発明者は、ＤＥＣ２の発現が増加すると、Ｔｗｉｓｔ及びＳｌｕｇなどのＥＭＴ調節因子の転写が抑制され、これによりＥＭＴが抑制されるので、組織の線維化が抑制されるものと判断した。
よって、本発明のクロモン誘導体によりＤＥＣ２の発現が増加するかを確認した。このとき、クロモン誘導体としてはオイパチリンを使用した。
マウス骨髄細胞(mouse bone marrow cells、ＭＢＭＣ)にＭ−ＣＳＦ(macrophage-colony stimulating factor)及びＲＡＮＫ(receptor activator of NFκB)リガンド（ＲＡＮＫＬ）を処理して活性化させ、ここにオイパチリンを５０μＭの濃度で処理して４日間培養した後、ＤＥＣ２の発現様相を確認した。
その結果、図２に示すように、オイパチリンは、ＤＥＣ２のｍＲＮＡ発現を７〜８倍に増加させるＤＥＣ２誘導剤(inducer)として作用することを確認することができた。
実施例２．ブレオマイシンによって誘導された肺組織の線維化における効果の確認
前記実施例１から、オイパチリンがＤＥＣ２の発現を増加させることを確認したので、オイパチリンが線維化を抑制することの可能性を確認することができた。これを基に、実際の動物モデルを用いて、オイパチリンが実際に組織線維化を抑制することができるか否かを確認した。
５週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（体重１８．２〜２０．５ｇ）（ＫＯＡＴＥＣＨ、韓国）を実験動物として用いた。実験動物は、各群当たり５匹ずつであって、下記表１のような群に分けた。
実験動物は、ＳＰＦ(Specific Pathogen Free)、ＢＳＬ(Bio Safety Level)２等級施設でポリスルホン(polysulfone)材質、３６９Ｌ×１５６Ｗ×１３２Ｈ（ｍｍ）（ＥＵ、ＵＳＡ、ＵＫ ＧＬ ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ）規格の飼育箱を使って飼育した。飼育箱当たりの収容動物の数は検疫・馴化期間に２〜３匹、試験期間に２〜３匹とし、温度２２±２℃、相対湿度５０．０±１５．０％、換気回数１０〜２０回／時間、明暗周期（照明時間）１２時間／日（０７：００〜１９：００）、照度１５０〜３００Ｌｕｘの条件下で飼育した。
肺線維化を誘導するために、Ｋｒｅｍｅｒ等、Ｌａｘｅｒ等及びＢｅｒｋｍａｎ等の気管内注入(intratracheal instillation、ＩＴ)方法によってブレオマイシン(bleomycin)溶液を気管(trachea)を介して直接肺内に注入する方法を使用した。つまり、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを７０％Ｎ２Ｏ、３０％Ｏ２ガス及び１．５％イソフルラン(isoflurane)で吸入麻酔させた状態で、前頚部の皮膚を切開し、筋肉を整理して気管を露出させた後、眼科用手術ハサミで気管を少し切開した。先端を丸くした１９ゲージ(gauge)の注射針を装着した１ｍＬの注射器を使って、ブレオマイシンを溶かした蒸留水溶液５０μＬを、切開された気管を介して直接肺内に一気に注入した。注入直後すぐに切開した前頚部の皮膚を縫合し、麻酔から覚めるようにした後、一般飼育ケージに入れて飼育した。ブレオマイシンの投与は、ビジュアルインスチロボット(visual instillobot)を使って行い、ブレオマイシン−ＨＣｌ４０μｇ／５０μＬを１回投与して１２日間の肺線維化疾患誘導期間を設定した。
オイパチリンは、ＤＰＢＳバッファ（１％ＤＭＳＯ含有）に溶かして使用し、オイパチリンの投与液量は１ｍＬ／ｋｇとした。個体ごとの投与量は最近の体重測定を基準に算出した。ブレオマイシン投与１２日後、マイクロピペットを用いて１日１回（週５回）、１週間強制鼻腔投与した。オイパチリン投与後２〜３日間の毒性症状及び死亡の有無を観察したが、ブレオマイシンとオイパチリンを投与した後、何らの異常症状も観察されなかった。
各実験群当たり３匹を選定して肺組織を分離した。分離された肺組織をマッソントリクローム染色(masson's trichrome staining)して顕微鏡で観察した結果、ブレオマイシンの処理で肺線維化が誘導されたことと、オイパチリン２０μｇ投与群及びオイパチリン４０μｇ投与群でオイパチリンの投与により肺線維化が阻害されることを確認することができた。特に、オイパチリン４０μｇ投与群で肺線維化のより効果的な阻害を確認することができた（図３参照）。
このような結果は、オイパチリンが線維化疾患、特に肺線維症の効果的な治療剤として使用できるということを明確に裏付ける。
実施例３．肝線維化における効果の確認
クロモン誘導体が肝線維化に及ぼす影響を確認するために、ＨＳＣを製作し、ここにＴＧＦ−βを処理して肝線維化が誘導される過程でクロモン誘導体の効果を確認した。
３−１．ＨＳＣ製作
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの肝組織を取り外した後、単細胞懸濁液(single cell suspension)を作って継続的な培養を介して無限に増殖する細胞を得、ＲＴ−ＰＣＲ(reverse transcription polymerase chain reaction)、ＩＨＣ(immunohistochemistry)、ＦＡＣＳ(fluorescence-activated cell sorting)実験によってＨＳＣ類の間葉幹細胞(mesenchymal stem cell、ＭＳＣ)の細胞株であることを確認した。この細胞株をＯＮＧＨＥＰＡ１と命名し、韓国生命工学研究院の生物資源センター（ＫＣＴＣ）に寄託して受託番号（ＫＣＴＣ１３０８６ＢＰ）を付与された。
ＨＳＣは、肝線維症に密接な関連がある。ＨＳＣが筋線維芽細胞に転換され、ＥＭＴ(Epithelial Mesenchymal Transition)に関与する様々なタンパク質を分泌することにより、肝線維化が生じる。よって、ＨＳＣ類の間葉幹細胞は、非常に優れた肝線維化モデルになることができる。
＊ＲＴ−ＰＣＲ結果：アルブミン陰性であって、ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞株が肝細胞(hepatocytes)ではないことを確認した。因みに、ＨＳＣは肝細胞ではなく、よって、アルブミンを発現しない。
＊ＩＨＣ分析結果：ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞株を固定した後、ａｎｔｉ−ＧＡＴＡ４とａｎｔｉ−ＣＫ−１８抗体を用いてＩＨＣを行った結果、ＧＡＴＡ４及びＣＫ−１８、すなわち中胚葉（ｅｎｄｏ）／外胚葉（ｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ）マーカーが発現することが分かった。これはＯＮＧＨＥＰＡ１細胞株が肝細胞ではないことを示す（図４参照）。
＊ＦＡＣＳ分析結果：ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞株が肝のＭＳＣであるかを確認するために、ＭＳＣマーカー抗体でＦＡＣＳを行った。ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７１及びＣＤ１０６が細胞の表面に発現することが分かった。ＯＮＧＨＥＰＡ１はＭＳＣであることが確認された（図５参照）。
３−２．肝線維化細胞株の線維化特性分析
肝線維化の最も重要な原因細胞はＨＳＣである。ＨＳＣは、複数の細胞に分化され、それらの一つが筋線維芽細胞(myofibroblast)である。また、ＨＳＣは、多量の細胞外基質タンパク質(extracellular matrix protein、ＥＣＭ)を細胞の間に分泌して細胞の動きを鈍化させる。コラーゲンα１(Collagen α1)が最も多いＥＣＭタンパク質である。同時に、線維芽細胞にαＳＭアクチニン(alpha smooth muscle actinin)が過発現して細胞骨格を硬化させる。
上述したようなＨＳＣ特性を用いてＯＮＧＨＥＰＡ１の線維化特性を確認した。線維化を誘導するために、ＴＧＦ−β(transforming growth factor beta)を処理し、６時間、１２時間、２４時間、４８時間が経過した時点で細胞の形態を観察した結果、２４時間が経過した時点でかなりの線維化が進行し、４８時間が経過した時点ではさらに線維化が進行したことを確認した（図６のＡを参照）。
３−３．オイパチリンの効果分析
上記の３−２からＯＮＧＨＥＰＡ１細胞の線維化特性を確認し、これを基にオイパチリンの効果を分析するための実験を行った。
ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養しながらＴＧＦ−βを処理して線維化を誘導するが、培養液上に５０μＭの濃度でオイパチリンを添加した。その結果、ＴＧＦ−βを処理した線維化実験群（実施例３−２の結果、図６のＡを参照）とは異なり、２４時間後にＨＳＣが筋線維芽細胞(myofibroblast)に分化する現象及び線維化現象が観察されなかった（図６のＢ参照）。このような結果は、オイパチリンが肝線維化の最も大きな原因であるＭＳＣ由来のＨＳＣが筋線維芽細胞に分化することを効果的に遮断することができることを示す。
前述したオイパチリンの効果をより明確に確認するために、前述と同様の方法でオイパチリンをまずＯＮＧＨＥＰＡ１細胞に処理した後、洗浄してオイパチリンを除去し、ＴＧＦ−βを処理して線維化を誘導したときの様相を調べた。その結果、図７に示すように、事前にオイパチリンを処理したとしても、線維化が進行している状態にオイバチリンが存在しなければ、線維化の進行を抑制することができないことが分かった。これはオイパチリン線維化の進行過程に直接関与して線維化の進行を抑制することを示す。
また、逆に、ＴＧＦ−βをまずＯＮＧＨＥＰＡ１細胞に処理して線維化を誘導した後、洗浄してＴＧＦ−βを除去し、オイパチリンを処理したときの様相を調べた。その結果、図８に示すように、事前にＴＧＦ−βを処理して線維化を誘導したにも拘らず、オイパチリンの処理により対照群と同様の正常な細胞状態を維持することが分かった。これは、既に線維化してしまったとしても、オイパチリンが細胞を本来の正常な状態に戻すことができる可能性を示す。
細胞の線維化が生じた後、オイパチリンが線維化細胞を正常細胞に戻すことができるかをより明確に確認するために、ＴＧＦ−βをＯＮＧＨＥＰＡ１細胞に２４時間処理して完全に線維化するようにした後、オイパチリンを処理したときの様相を調べた。その結果、図９のようにＴＧＦ−βの処理により完全に線維化してしまった状態でも、オイパチリンは細胞を正常な状態に戻すことができることが分かった。これは線維化がかなり進行した状態の線維症もオイパチリンが効果的に治療することができることを示す。
また、前述したようなオイパチリンの効果がオイパチリンのＥＭＴに対する影響によるものであるかを確認するために、各実験群で２４時間培養した細胞を対象に、ＥＣＭであるＣｏｌ１(type1 Collagen)、Ｖｉｍ(Vimentin)及びＴｗｉｓｔの発現様相を実時間ＲＴ−ＰＣＲによって確認した結果、図１０に示すように、ＴＧＦ−βの処理により線維化が誘導されてＥＭＴ調節因子の発現が増加する一方で、オイパチリンの処理によりそれらの発現が抑制されることが分かった。
前述したような結果は、オイパチリンが線維化疾患、特に肝線維症の効果的な治療剤として使用できるということを明確に裏付ける。
３−４．オイパチリン以外のクロモン誘導体の効果分析
実施例３−３と同様の方法でオイパチリン以外の様々なクロモン誘導体の線維化に対する効果を調べた。ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を培養しながらＴＧＦ−βを処理して線維化を誘導するが、培養液上に５０μＭの濃度でクロモン誘導体を添加した。
その結果、図１１に示すように、ＯＮＧＩ３００、ＯＮＧＣ２００、ＯＮＧＥ２００及びＯＮＧＨ２００のクロモン誘導体も線維化の進行を抑制するのに優れた効果があることが分かった。一方、図１１及び図１２に示すように、オウゴニン(Wogonin)を始めとして、ＯＮＧＡ１００、ＯＮＧＢ２００及びＯＮＧＥ３００は線維化進行抑制効果がないか非常に低く、ＯＮＧＤ２００、ＯＮＧＨ３００及びＯＮＧＤ４００は細胞に壊死を起こすなどの毒性を示した。
実施例４．グローバル遺伝子発現様相の分析
前述したような線維症治療効果に対するメカニズムを調べるために、ＤＭＳＯを処理したＯＮＧＨＥＰＡ１細胞（対照群）、ＴＧＦ−βの処理により線維化が誘導されたＯＮＧＨＥＰＡ１細胞、及びＴＧＦ−βとオイパチリンを一緒に処理したＯＮＧＨＥＰＡ１細胞のグローバル遺伝子発現様相を調べた。
ＤＭＳＯ、ＴＧＦ−βまたはオイパチリンをそれぞれ処理し、２４時間後にトータルＲＮＡを分離してライブラリを製作した後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｇｈ−ｓｅｑシーケンサで３０Ｇｉｇａの全トランスクリプトーム(transcriptome)約１０，０００個の発現したｍＲＮＡを分析した。
その結果、次の結果が得られた（図１３参照）。
１）３つの実験群に共通して発現する遺伝子の数：９０３３個
２）対照群ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞株に特異的に発現する遺伝子の数：６２８個
３）ＴＧＦ−β処理時に特異的に発現する遺伝子の数：１６９個
４）ＴＧＦ−βとオイパチリン処理時に特異的に発現する遺伝子の数：１５０個
５）ＴＧＦ−β処理群及びＴＧＦ−β＋オイパチリン処理群に共通して発現する遺伝子の数：６５７個
６）対照群及びＴＧＦ−β処理群に共通して発現する遺伝子の数：１７１個
７）対照群及びＴＧＦ−β＋オイパチリン処理群に共通して発現する遺伝子の数：１８８個
これにより、ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞株にＴＧＦ−βを処理すると、８２６（＝１６９＋６５７）個の遺伝子の発現が誘導されてＥＭＴプログラムが活性化され、これにオイパチリンを処理すると、３３８（＝１５０＋１８８）個の遺伝子の発現がさらに誘導されてＥＭＴプログラムを本来の状態に逆転させる分化転換(trans-differentiation)が発生することが分かった。
ＴＧＦ−β処理群及びＴＧＦ−β＋オイパチリン処理群で発現が変化する遺伝子の遺伝子誘導倍率(induction fold)及びｐ値(p-value)を比較して図１４のようなボルケーノプロット(volcano plot)で示した。
ＥＭＴは、腫瘍の発生、幹細胞の分化及び線維化に関与するセルラープログラム(cellular program)であって、現在までに数百個の遺伝子が関与することが知られている。Ｃｏｌｌａｇｅｎ α１、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、ａｓｍａｃｔｉｎｉｎ、Ｔｗｉｓｔ、Ｓｎａｉｌ１、Ｓｎａｉｌ２（＝Ｓｌｕｇ）、Ｎ−Ｃａｄｈｅｒｉｎなどが代表的なＥＭＴマーカーである。前記実施例においてオイパチリンがＴＧＦ−βによるＣｏｌｌａｇｅｎ α１、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ及びＴｗｉｓｔ遺伝子の発現を抑制することが分かった。また、ＲＮＡ−Ｓｅｑ結果をみると、９７６個の遺伝子がＴＧＦ−βまたはオイパチリン処理によって新たに発現することが分かった。すべての処理から共通して発見される９０３３個の遺伝子の発現も微視的に発現増減があって、これらのすべては直、間接的にＥＭＴに影響を及ぼすものと判断される。よって、ＴＧＦ−β＋オイパチリン処理によって統計的にｐ＜０．０５以下に発現が調節されるこれらの１０，０００個の遺伝子を全て選択し、選択した遺伝子それぞれに対して遺伝子がコードするタンパク質のすべての機能を統合したビッグデータ(big data)ベースの遺伝子インタラクトーム(interactome)を偏りなく(unbiased manner)分析して、これらの間のネットワークを調べてみた（図１５参照）。
驚くべきことに、これらの遺伝子ネットワークのハブ(hub)は、８個であって、複数のノード(node)を媒介として１つのネットワークフレームワークを構成し、８つのハブがほとんどＥＭＴに関連する遺伝子から構成されていることが分かった。細胞骨格プロテオームハブ（Ｉ）とコラーゼンプロテオームハブ（II）は、ｉｎｔｅｇｒｉｎ α１（Ｉｔｇａ１）ノードによってネットワークが形成され、ＥＭＴの重要因子として知られているＣｙｃｌｉｎ Ｂ１を含むｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅプロテオームハブ−１（III）はプロテインキナーゼＣアルファ(proteinkinase C alpha)（ＰＫＣＡ）ノードに接続され、前記３つのプロテオームハブと共にｉｎｔｅｇｒｉｎ ｂｅｔａ ３（Ｉｔｂｇ３）ノードによって強固なネットワークを構築していることが分かった。他の２番目のｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅハブ−２（IV）は、転写因子Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｅｎｈａｎｃｅｒ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ １（Ｌｅｆ１）ノードがＣｙｃｌｉｎ Ｄ１（Ｃｃｄｎ１）によって接続され、Ａｄｅｎｙｌａｔｅ Ｃｙｃｌａｓｅ ９（Ａｄｃｙ９）シグナル伝達ハブが、ＥＭＴに重要なキモカインＣＸＣＬ１６を媒介としてＥＭＴ因子Ｃ−Ｆｏｓ、ＣＣＬ２、Ｊｕｎｂとネットワークで接続されていることが分かった。ここで、Ａｄｃｙ９シグナル伝達ハブは、オイパチリンによって影響を受ける新しいＥＭＴレギュレータであると思われる。がん細胞のＥＭＴに大きな影響を与えることが知られているＣＤ４４ハブ（Ｖ）は、細胞移動(cell migration)及び浸潤(invasion)に関与するｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ １（Ｓｐｐ１／オステオポンチン(Osteopontin)）ノードに接続されていることが分かった。Ｓｐｐ１（オステオポンチン(Osteopontin)）も重要なＥＭＴ因子として知られている。Ｓｐｐ１ノードは、ＥＣＭプロテアーゼ(protease)であるＭｍｐ３とネットワークで接続されていた。ＥＣＭマトリックスの重要タンパク質であり且つＥＭＴの主要因子であるフィブリン(Fibrillin)とエラスチン(Elastin)を含むハブ（VI）は、ｃｅｎｔｒａｌノードであるｉｎｔｅｇｒｉｎ ｂ３（Ｉｔｇｂ３）に接続されていることが分かった。ＥＭＴ原因サイトカインｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂ２プロテオームハブ（VII）は、ｓｅｒｐｉｎｅ１及びＦｉｇｆ（＝ＶｅｇｆＤ）を含み、ｋｉｎａｓｅ ｉｎｓｅｒｔ ｄｏｍａｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（Ｋｄｒ）ノードとネットワークを構築していることが分かった。ＥＭＴの重要受容体として知られているｓｅｍａｐｈｏｒｉｎとコレステロール受容体（Ｖｌｄｒ）ハブ（VIII）には、ｐｌｅｘｉｎ Ｄ、ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎｇ ３Ｅ、ｎｅｕｒｏｐｈｉｌｉｎ及びＮＧＦを含んでおり、ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ受容体ハブは、Ｋｄｒノードとネットワークを形成していることが分かった。Ｖｌｄｒ受容体ハブは、ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（Ｎｇｆ）を介してｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ２Ｉ（ｒｓ２）に接続されてシグナル伝達軸が形成されていることが分かった。ＥＭＴの主要転写因子であるＳｎａｉｌ２（＝Ｓｌｕｇ）−Ｅｃａｄｈｅｒｉｎ（＝Ｃａｄｈ１）ノードは、ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅプロテオームハブ（II）とネットワークを構築し、Ｅｃａｄｈｅｒｉｎは、重要なＥＭＴ因子であるＭｍｐ３、ｃａｖｉｏｌｉｎ（Ｃａｖ）、Ｔｅｎａｓｃｉｎ Ｃ（Ｔｎｃ）及びＰＫＣａに接続されていることが分かった。ＰＫＣａは、ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｂ４によって細胞骨格及びコラーゲンプロテオームハブとネットワークを構築していた。Ｔｅｎａｓｃｉｎ Ｃはｉｎｔｅｇｒｉｎ ｂ３に直接接続されていた。
＜ハブI．細胞骨格プロテオームハブ＞
Ｔｒｏｐｏｎｉｎ I１ ＆ Ｔｒｏｐｏｎｉｎ Ｉ２、Ｔｒｏｐｏｍｙｏｓｉｎ ２、Ｔｒａｎｓｇｅｌｉｎ、α２ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ、Ｍｙｏｓｉｎ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ９ ＆ １１、Ｌｅｉｏｍｏｄｉｎ １、γ２ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｉｔｉｎ、Ｌａｍｉｎｉｎ ｓｕｂｕｎｉｔ α４

＜ハブII．コラーゲンプロテオームハブ＞
Ｃｏｌｌａｇｅｎ ４ α５ ＆ α６、Ｃｏｌｌａｇｅｎ ５ α１ ＆ α３、Ｃｏｌｌａｇｅｎ ６ α３、Ｃｏｌｌａｇｅｎ ８ α１ ＆ α５、Ｃｏｌｌａｇｅｎ １１ α１、Ｃｏｌｌａｇｅｎ １２ α１、Ｃｏｌｌａｇｅｎ １５ α１

＜ハブIII．ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅプロテオームハブ−１＞
Ｃｙｃｌｉｎ Ｂ１、Ｇａｄｄ４５ａ、Ｃｙｃｌｉｎ Ｆ、ＡＳＰＭ、ＮＩＭＡ−ｒｅｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ（Ｎｅｋ２）、Ｏｐｔｉｎｅｕｒｉｎ

＜ハブIV．Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅプロテオームハブ−２＞
Ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１、Ｃｄｋ１４、Ｃ−Ｆｏｓ、Ｊｕｎｂ、ＣＣＬ２、ＣＣＬ７

＜ハブＶ．ＣＤ４４関連プロテオームハブ＞
Ｃｄ４４、Ｈｙｐｏｘｉａ Ｕｐ−Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ １（Ｈｙｏｕ１）、Ｎｃａｍ、Ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ−Ｒｅｌａｔｅｄ ＧＴＰａｓｅ Ｍ（Ｉｒｇｍ１）、Ｐａｒｐ４、Ｐａｒｐ９、Ｐｄｉａ４ ＆ Ｐｄｉａ６
＜ハブVI．Ｆｉｂｒｉｌｌｉｎプロテオームハブ＞
Ｅｆｅｍｐ２（ＥＧＦ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｆｉｂｕｌｉｎ−Ｌｉｋｅ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍａｔｒｉｘ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２）、Ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ ５（Ｆｂｎ５）、Ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ ２（Ｆｂｎ２）、Ｅｌａｓｔｉｎ（Ｅｌｎ）、Ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ １（Ｆｂｎ１）

＜ハブVII．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｂｅｔａ ２プロテオームハブ＞
ＲＡＲ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｏｒｐｈａｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａ（Ｒｏｒａ）、Ｎｅｕｒｏｎａｌ ＰＡＳ Ｄｏｍａｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ２（Ｎｐａｓ２）、Ｓｅｒｐｉｎｅ １、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｂｅｔａ ２（Ｔｇｆｂ２）、Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｄ（Ｆｉｇｆ）

＜ハブVIII．Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ ＆ Ｖｌｄｒ受容体プロテオームハブ＞
Ｐｌｅｘｉｎ Ｄ１、Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ ３Ｅ、Ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ ３Ａ、Ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ １、Ｖｅｒｙ Ｌｏｗ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（Ｎｇｆ）

＜ＴＧＦ−β−Ｅｕｐａｔｉｌｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅの主要ネットワークノード＞
Ｉｎｔｅｇｒｉｎ α１、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ β３、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ β４、Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ α、Ｌｅｆ１、Ｓｌｕｇ、Ｃａｄｈｅｒｉｎ １（＝Ｅ−Ｃａｄｈｅｒｉｎ）、Ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ ９、Ｓｐｐ１（＝Ｏｓｔｅｏｐｏｉｎｔｉｎ）、Ｆｉｂｒｉｌｉｎ １、Ｄｅｄｉｃａｔｏｒ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ １（Ｄｏｃｋ１）、Ｓｙｋ２、Ｎｏｔｃｈ４など

前述したような結果は、オイパチリンがＴＧＦ−β処理で誘導されるＥＭＴプログラムを逆転させ、このときのメカニズムは、８つのＥＭＴプロテオームハブ、すなわち細胞骨格プロテオームハブ（I）、コラーゲンプロテオームハブ（II）、Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅプロテオームハブ−１（III）、Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅプロテオームハブ−２（IV）、ＣＤ４４関連プロテオームハブ（Ｖ）、Ｆｉｂｒｉｌｌｉｎプロテオームハブ（VI）、ＴＧＦ−β２プロテオームハブ（VII）、並びにＳｅｍａｐｈｏｒｉｎ及びＶｌｄｒ受容体プロテオームハブ（VIII）の生成と消滅からなり、ｉｎｔｅｇｒｉｎ α１、ｉｎｔｅｒｇｒｉｎ β３、ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃα、Ｓｎａｌｉ２、Ｋｄｒ、Ｅｃａｄｈｅｒｉｎ、ａｄｅｎｙｌａｔｅ ｃｙｃｌａｓｅ ９が重要なノードとしてネットワーク接続されることを示す。
実施例５．標的遺伝子の分析
前記実施例４でのグローバル遺伝子発現様相の調査結果に基づいて、ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞においてＴＧＦ−β処理によって発現が誘導され、ここにオイパチリンを処理した場合に発現が退行する遺伝子、すなわち、ＴＧＦ−β処理群とオイパチリン処理群との間に発現差が現れる遺伝子のうち、ＴＧＦ−β処理で発現が大きく増加してからオイパチリン処理でほとんど発現しない程度に大きな変化を示す遺伝子を選別した。
その結果を下記表２及び表５の１０３個の遺伝子が選別された。
前記１０３個の遺伝子の機能及び関連研究結果を調べた結果、ほとんどがＥＭＴに関与する因子として確認された。特に、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ １（Ｆｓｔｌ１）遺伝子の場合、これをノックアウトさせると、ブレオマイシンで肺線維化を誘導しても、ほとんど肺線維化しないという研究結果(Dong et al., 2015)があった。
ＥＭＴが腎臓線維症において重要な役目をし(Grande et al., 2015及びLovisa et al., 2015)、このようなＥＭＴがＤＥＣ２によって調節できるという既存の研究結果(Suzuki et al., 2014及びSato et al., 2012)を基に、ＥＭＴと線維症との連関性、及びＤＥＣ２とＥＭＴとの連関性に着目するようになった。ＤＥＣ２を調節することができれば、ＥＭＴを調節することができ、結果的に線維症を予防及び治療することができると判断した。
ＤＥＣ２は、ＥＭＴの調節因子であるＴｗｉｓｔ及びＳｌｕｇの転写抑制因子として知られているので、ＤＥＣ２の発現を増加させることができれば、ＥＭＴ調節因子の発現が抑制され、ＥＭＴが抑制され、結果として線維化が抑制されるだろう。
そこで、まず、本発明のクロモン誘導体のうちオイパチリンのＤＥＣ２発現調節可能性を調べた結果、オイパチリンがＤＥＣ２のｍＲＮＡ発現を大きく増加させることが確認され、オイパチリンの線維症治療可能性を発見した（図２参照）。
オイパチリンの線維症治療可能性をより明確に確認するために、マウスの肺にブレオマイシン(bleomycin)を注入して肺線維化を誘導し、このとき、オイパチリンの効果を調べた結果、ブレオマイシンにより誘導された肺組織の線維化をオイパチリンが効果的に抑制することが確認され、オイパチリンが実際に特発性肺線維症などの肺組織線維化を抑制することができるという事実を発見することができた（図３参照）。
ここで止まらず、オイパチリンが肺線維症以外に他の組織の線維症も抑制することができるかを確認しようとした。これを確認するためのモデルとして、肝線維症と密接な関係があることが知られているＨＳＣに注目した。ＨＳＣは、正常な状態では休止状態で存在しており、炎症などのストレスにより肝細胞が損傷すると、ＴＧＦ−βまたはＰＤＧＦなどの細胞成長因子によって活性化され、細胞外基質(extra cellular matrix、ＥＣＭ)を多量生産することにより組織を硬化させ、自分が筋線維芽細胞(myofibroblast、ＭＦＢ)に分化して組織の線維化を引き起こすことがある。したがって、このＨＳＣの不死化細胞(immortalized cell)を得、ここにＴＧＦ−βを処理すると、線維化を誘導することができて線維化に対する有用なモデルになることができるものと期待した。結果的に不死化ＨＳＣを得ることができ、ＴＧＦ−βの処理によって、実際に筋線維芽細胞に１００％分化する細胞株を確立することができた（図４及び５を参照）。この細胞株をＯＮＧＨＥＰＡ１（ＫＣＴＣ１３０８６ＢＰ）と命名した。
前述したようなＯＮＧＨＥＰＡ１細胞を用いてオイパチリンの線維化抑制効果を確認した結果、ＴＧＦ−βの処理によって誘導された線維化をオイパチリンが効果的に抑制することが確認され、オイパチリンが実際に肝線維症などの肝組織線維化を抑制することができることを発見することができた（図６参照）。また、オイパチリンをＯＮＧＨＥＰＡ１細胞に前処理した後、洗浄してオイパチリンを除去し、ＴＧＦ−βを処理して線維化を誘導した場合には、何らの変化もないことが分かり、オイパチリンが正常ＨＳＣには何らの影響も及ばないことも発見することができた（図７参照）。
これまでは、組織または細胞の線維化過程でオイパチリンの効果を確認してオイパチリンが線維化の進行を抑制することを解明したが、既に線維化してしまった状態ではどんな効果を示すかをさらに確認する必要があった。このため、ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞にＴＧＦ−βを処理し、一定時間が経過するようにして線維化を進めた後にオイパチリンを処理したときの変化を調べた結果、既に線維化してしまったＯＮＧＨＥＰＡ１細胞をオイパチリンが本来の正常な形態に戻すことができることを発見することができた（図８及び９を参照）。これはオイパチリンが線維症を予防または初期対応することに止まらず、線維症が進んでいる中期または末期の症状も治療することができることを意味する。
研究の初期に予想していたように線維症の治療効果がＥＭＴの抑制によって得られたかを確認するために、ＥＭＴに関与する因子であるＣｏｌ１(type 1 Collagen)、Ｖｉｍ(Vimentin)及びＴｗｉｓｔの発現を調べた結果、オイパチリンがこれらの遺伝子の発現を抑制することが確認され、予想のとおり、オパチリンがＥＭＴを抑制することにより線維化を抑制するということが確認された（図１０参照）。
オイパチリンの線維症治療効果がＥＭＴを抑制するからであるかをより明確に調べるために、正常細胞に比べて線維化が誘導されるとき、及びオイパチリンの処理で線維化が抑制されるときの総ｍＲＮＡ分析によって、発現における有意な差を示す遺伝子を調べ、それらの遺伝子間の相互作用体（インタラクトーム）を調べた。その結果、８つの遺伝子ネットワークハブをなし、これらのハブがほとんどＥＭＴ関連遺伝子から構成されており、これらのハブを接続するノード遺伝子がＥＭＴの非常に重要な因子であることが確認され、オイパチリンの線維症治療効果がＥＭＴの調節によって得られることが明らかになった（図１３乃至１５参照）。
また、総ｍＲＮＡ分析結果のうち、特に発現差の大きい遺伝子を分析した結果、１０３個の遺伝子の発現がＴＧＦ−β処理線維化誘導により大幅に増加し、オイパチリン処理で線維化が抑制されながら、ほとんど発現されない程度に差異があることを発見することができた。すなわち、これらの遺伝子はオイパチリンの標的遺伝子であるといえる。これらの遺伝子はまた、ほとんどＥＭＴに関与する因子であり、既存の研究結果から、線維化における重要な因子として知られているものであった（表２乃至表５参照）。
特にＦｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ １（Ｆｓｔｌ１）遺伝子の場合、この遺伝子の発現を抑制させると、ブレオマイシンで肺線維化を誘導しても、ほとんど肺線維化しないという研究結果(Dongetal., 2015)があったが、オイパチリンがこのようなＦｓｔｌ１の発現をほぼゼロに近く抑制するという結果は、オイパチリンの肺線維化治療効果をより明確に説明するものであり、上述したような仮説と共に、オパチリンが強力な線維症治療剤になれることを裏付ける。
また、前記１０３個の遺伝子は、ＨＳＣ細胞だけでなく、他の線維芽細胞やがん細胞においても発現する遺伝子であって、上述したような結果は、オイパチリンが肝線維化だけでなく、他の組織または細胞の線維化も治療することができることを示唆する。
これらの結果に基づいて、オイパチリンの線維症治療効果を確認した。このような効果がオイパチリンの特異的な構造によるものと予想した。よって、オイパチリンと類似の構造を持つ化合物も類似の効果を示すだろうと判断した。また、ＯＮＧＨＥＰＡ１細胞モデルを用いて同様の方法でオイパチリン以外にクロモン誘導体の線維症治療効果を調べた。その結果、化学式２、化学式３、化学式５及び化学式７のオイパチリンと類似の構造を持つクロモン誘導体が優れた線維化抑制効果を示した。これに対し、オイパチリンと類似の構造を持つクロモン誘導体であるものの、化学式８、化学式９（オウゴニン、ｗｏｇｏｎｉｎ）、化学式１０、化学式１１のように、化学式１の構造で−Ｏ−Ｒ２の置換基がＨである構造の化合物は、いずれも線維化抑制効果がなかった。また、化学式１２のように−ＯＲ２の置換基が−ＯＨである構造の化合物と、化学式１３及び化学式１４のようにＲ３の置換基が−Ｏ−ＣＨ３（メトキシ）である構造の化合物は、細胞に壊死を起こすなどの毒性を示した（図１１及び図１２を参照）。
このように、線維化抑制効果のためには、化学式１の構造において−Ｏ−Ｒ２の置換基とＲ３の置換基が非常に重要であることが分かった。これにより、化学式１の構造において−Ｏ−Ｒ２の置換基がＨまたは−ＯＨではなく、Ｒ３の置換基が−Ｏ−ＣＨ３ではない場合、線維化抑制効果を示すことができるものと判断される。
本発明のクロモン誘導体は、通常の方法、例えば、図１のような方法またはその変形によって製造でき、化合物を合成または販売する会社から容易に入手することができる。
本発明の医薬組成物は、全体組成物の重量に対して、本発明のクロモン誘導体を０．１乃至９０重量％で含有することができる。
本発明の医薬組成物は、臨床投与の際に経口または非経口投与が可能であり、非経口投与の際に腹腔内注射、直腸内注射、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射、子宮内頚膜注射、脳血管内注射または胸部内注射によって投与でき、一般な医薬品製剤の形で使用できる。
本発明の医薬組成物は、単独で、または手術、放射線治療、ホルモン療法、化学治療及び生物学的反応調節剤を用いる方法と併用して使用することができる。
本発明の医薬組成物の１日投与量は、組成物に含有された本発明のクロモン誘導体を基準に、体重１ｋｇ当たり約０．０００１〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１〜１０ｍｇであり、１日１回乃至数回に分けて投与できるが、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度などによってその範囲が多様である。
実際の臨床投与の際に非経口のさまざまな剤形で投与できるが、製剤化する場合には、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調製することができる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれ得る。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール(Propylene glycol)、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油、オレイン酸エチルなどの注射可能なエステルなどが使用できる。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用できる。
本発明の医薬組成物は、本発明のクロモン誘導体に、さらに同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上含有することができる。
本発明の医薬組成物は、線維症、特に特発性肺線維症(idiopathic pulmonary fibrosis、ＩＰＦ)、骨髄線維症(myelofibrosis)、肝線維症(liver fibrosis)及び腎臓線維症(kidney fibrosis)の予防及び治療に有用に使用できる。特に、既に線維化してしまった細胞を本来の正常な形態に戻すことができるため、線維症を予防または初期対応することに止まらず、線維症が進んでいる中期または末期の症状も効果的に治療することができる。
［受託番号］
寄託機関名：韓国生命工学研究院
受託番号：ＫＣＴＣ １３０８６ＢＰ
受託日：２０１６年８月２５日

Claims (1)

  1. ２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−６−メトキシ−クロモン、５，７−ジヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシフェニル）−６−メトキシ−クロモン、５−ヒドロキシ−２−（４−ヒドロキシフェニル）−６，７−ジメトキシ−クロモン、２−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−５−ヒドロキシ−６，７−ジメトキシ−クロモン及びそれらの薬学的に許容される塩から選択された化合物を有効成分として含有する、肺線維症（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）及び肝線維症（ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ）の予防及び治療用医薬組成物。
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