KR101780456B1 - 크로몬 유도체의 상피간엽이행 억제 활성을 이용한 섬유증 예방 및 치료용 약제학적 조성물로서의 새로운 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 크로몬 유도체의 상피간엽이행(Epithelial Mesenchymal Transition, EMT) 억제 활성을 이용한 섬유증 예방 및 치료용 약제학적 조성물로서의 새로운 용도에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 크로몬 유도체가 상피간엽이행을 억제할 수 있다는 것을 새롭게 발견함에 따라 이러한 활성을 이용하여 섬유증의 예방 및 치료제로 사용하는 새로운 용도에 관한 것이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 화학식 1의 크로몬 유도체를 유효성분으로 함유함으로써 상피간엽이행의 활성화를 효과적으로 억제할 수 있으며, 이에 따라 상피간엽이행의 활성화로 유도되는 기관 또는 조직의 섬유화를 효과적으로 억제할 수 있다. 특히 이미 섬유화가 이루어진 세포를 본래의 정상적인 형태로 되돌릴 수 있어 섬유증을 예방하거나 초기 대응하는 것에 그치지 않고 섬유증이 진행된 중기 또는 말기의 증상도 치료할 수 있다.

Description

크로몬 유도체의 상피간엽이행 억제 활성을 이용한 섬유증 예방 및 치료용 약제학적 조성물로서의 새로운 용도{New use of eupatilin and chromen derivatives as pharmaceutical composition for prevention and treatment of fibrosis via EMT inhibitory activity}

본 발명은 크로몬 유도체의 상피간엽이행 억제 활성을 이용한 섬유증 예방 및 치료용 약제학적 조성물로서의 새로운 용도에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 크로몬 유도체가 상피간엽이행(Epithelial Mesenchymal Transition, EMT)을 억제할 수 있다는 것을 새롭게 발견함에 따라 이러한 활성을 이용하여 섬유증의 예방 및 치료제로 사용하는 새로운 용도에 관한 것이다.

섬유증(fibrosis)은 재생이나 발생과정에서 기관이나 조직에 과도한 섬유성 결합조직이 형성되는 질환으로, 이러한 섬유성 결합조직은 정상적인 섬유조직의 형성과는 대조적이다. 기관이나 조직에 섬유성 결합조직이 과도하게 형성되면 조직이 단단해지고 체액의 유입이 감소되는 등 생체 내에서 본래의 기능을 충분히 수행할 수 없게 된다. 원인으로는 부상, 염증, 화상, 방사선, 화학요법, 림프수종 등이 알려져 있다. 이러한 섬유증으로 인한 문제는 섬유성 결합조직이 형성되는 위치에 따라 달라지게 되는데, 주로 간, 분비기관, 폐 등이 손상을 받는다. 섬유증에는 대표적으로 특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF), 골수섬유증(myelo fibrosis), 간섬유증(liver fibrosis) 및 신장섬유증(kidney fibrosis)이 있다.

특발성 폐섬유증은 만성적으로 진행되는 간질성 폐질환의 하나로 병의 경과가 좋지 않고 아직까지 증명된 치료 방법이 없는 질환이다. 폐의 조직검사 결과 벌집모양과 일정하지 않은 모양 등이 확인될 때 진단한다. 서서히 호흡곤란을 유발하며 저산소증 또는 심근경색으로 사망에 이르는 등 경과가 좋지 않다. 현재까지 원인으로 뚜렷하게 입증된 것은 없으나, 환경, 바이러스, 유전, 독성 화합물 등의 다양한 인자로 인해 폐에 염증이 유발되고 이 염증이 치유되는 과정에서 섬유세포가 과도하게 증식하여 폐에 섬유화가 진행되는 것으로 생각되고 있다.

골수섬유증은 골수조직의 섬유가 과잉발육되는 질환으로 피를 만드는 기능이 낮아지며 적혈구와 백혈구의 수, 이들의 작용에 변화가 일어나게 된다. 특발성과 속발성으로 구분된다. 이중 특발성은 전신골수의 심각한 섬유증식, 비대 증상을 나타내고, 말초혈중에 유핵적혈구나 유약한 과립구가 나타난다. 원인은 불확실하며 골수의 중독, 염증 등이 원인으로 생각되고 있다. 속발성은 백혈병, 악성림프종, 암골수전이, 화학약품의 중독 등의 경과중에 생긴다. 효과적인 치료제는 아직 개발되지 않은 실정이다.

간섬유증은 간경변증이라고도 한다. 만성적인 염증으로 인해 정상적인 간조직이 재생결절 등의 섬유화 조직으로 바뀌어 간의 기능이 저하되는 질환이다. 만성 B형 간염이나 C형 간염, 과음, 간독성물질 등으로 인해 간의 염증상태가 지속되는 경우에 주로 발생한다. 치료는 증상의 진행을 최대한 늦추는 목표로 이루어지며, 그 원인에 따라 항바이러스제 등이 사용되고 있으나 원인이 다를 경우 그 효과는 미지수이다.

신장섬유증은 세포외 기질이 축적되어 신장에 섬유화가 이루어지는 진행성 질환이며, 사구체 경화증과 세뇨관 간질성 섬유증이 특징이다. 신장의 섬유화로 인해 신장 기능에 부작용이 초래된다. 원인은 외상, 감염, 수술, 환경적인 요인, 화학물질, 방사선 노출 등이 있고, 통증, 배뇨관련문제, 메스꺼움, 구토 등의 증상이 나타날 수 있다. 약물이나 신장 이식으로 증상을 관리하지만 역시 효과적인 치료제의 개발이 필요하다.

한편, Grande 등은 최근에 상피간엽이행(Epithelial Mesenchymal Transition, EMT)(이하, 'EMT'라 한다.)의 주요 조절인자인 Twist 혹은 Snail이 신장 섬유화에서 중요한 역할을 담당한다는 연구결과를 제시한 바 있으며, Lovisa 등 또한 EMT가 신장 섬유증에서 중요한 역할을 한다고 제시한 바 있다. EMT는 정상세포가 종양세포로 가면서 중간단계인 세포골격 변화로 인해 세포모양이 이동하기 쉬운 간엽세포(mesenchymal cell)의 형태로 유전적 리프로그래밍(genetic reprogramming)되는 현상을 말한다. 따라서 EMT 관여 단백질의 발현을 억제하면 종양의 전이와 증식을 억제할 수 있다고 생각하여, 다양한 연구자들이 종양 치료제를 개발하기 위하여 이러한 EMT와 관련된 연구를 진행하고 있기도 하다. 이 EMT의 조절인자로는 Twist, Snail, Slug, E-cadherin, vimentin, collagen1 α1 등 약 수백여 개가 알려져 있다.

Suzuki 등은 DEC2(BHLHE41)가 이러한 EMT의 조절인자인 Twist의 전사억제인자이고, 이것의 발현을 저해하면 EMT가 활성화되어 악성 종양으로 전환된다는 것을 보고하였다. 또한 Sato 등은 DEC2가 EMT의 조절인자인 Slug의 발현을 억제하고 이에 따라 TGF-β로 유도되는 악성 종양화를 억제한다는 것을 보고하였다. 이밖에도 다양한 연구자들이 DEC2와 같은 EMT의 조절인자가 암전이 등과 관련이 있다는 것을 보고한 바 있다.

이와 같이 EMT 및 이 EMT의 조절인자에 관한 연구는 대부분 암 또는 종양에 관해서만 진행되어 왔다. 하지만 본 발명자는 기존의 일부 연구결과를 바탕으로 EMT와 섬유증의 연관성에 주목하게 되었고 EMT를 조절할 수 있다면 섬유증을 예방 및 치료할 수도 있을 것으로 기대하였다.

한편 크로몬(chromone, chromen-4-one, 4H-chromen-4-one) 구조를 갖는 자연 화합물에는 대표적으로 유파틸린(eupatilin), 오고닌(wogonin), 미리세틴(myricetin) 등이 있으며, 이중 유파틸린은 애엽(약쑥, Artemisia asiatica)에 함유된 성분으로 알려져 있고, 기존에는 주로 항암효과에 관하여 연구가 이루어져 왔다.

본 발명자는 EMT와 섬유증과의 연관성 및 DEC2와 EMT의 연관성에 주목하고, 유파틸린이 골수세포에서 분화된 대식세포의 DEC2 mRNA를 상향조절한다는 관찰을 통해 유파틸린을 포함한 크로몬 유도체의 섬유증 치료제로서의 가능성을 연구하게 되었다. 이의 결과 이러한 크로몬 유도체가 EMT를 억제할 수 있다는 것을 세포모델 및 동물모델을 통해 새롭게 밝혔고, 이에 따라 EMT의 활성화로 기관 또는 조직이 섬유화하는 것을 이들 화합물이 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

Grande MT, Sanchez-Laorden B, Lopez-Blau C, De Frutos CA, Boutet A, Arevalo M, Rowe RG, Weiss SJ, Lopez-Novoa JM, Nieto MA. Snail1-induced partial epithelial-to-mesenchymal transition drives renal fibrosis in mice and can be targeted to reverse established disease. Nat Med. 2015 Sep;21(9):989-97. Lovisa S, LeBleu VS, Tampe B, Sugimoto H, Vadnagara K, Carstens JL, Wu CC, Hagos Y, Burckhardt BC, Pentcheva-Hoang T, Nischal H, Allison JP, Zeisberg M, Kalluri R. Epithelial-to-mesenchymal transition induces cell cycle arrest and parenchymal damage in renal fibrosis. Nat Med. 2015 Sep;21(9):998-1009. Suzuki M, Sato F, Bhawal UK. The basic helix-loop-helix(bHLH) transcription factor DEC2 negatively regulates Twist1 through an E-box element. Biochem Biophys Res Commun. 2014 Dec 12;455(3-4):390-5. Sato F, Kawamura H, Wu Y, Sato H, Jin D, Bhawal UK, Kawamoto T, Fujimoto K, Noshiro M, Seino H, Morohashi S, Kato Y, Kijima H. The basic helix-loop-helix transcription factor DEC2 inhibits TGF-β-induced tumor progression in human pancreatic cancer BxPC-3 cells. Int J Mol Med. 2012 Sep;30(3):495-501. Dong Y, Geng Y, Li L, Li X, Yan X, Fang Y, Li X, Dong S, Liu X, Li X, Yang X, Zheng X, Xie T, Liang J, Dai H, Liu X, Yin Z, Noble PW, Jiang D, Ning W. Blocking follistatin-like 1 attenuates bleomycin-induced pulmonary fibrosis in mice. J Exp Med. 2015 Feb 9;212(2):235-52.

본 발명의 주된 목적은 크로몬 유도체를 섬유증의 예방 및 치료제로 사용하는 새로운 용도를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 섬유증의 예방 및 치료를 위한 새로운 약제학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 섬유증을 효과적으로 예방 및 치료하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 크로몬 유도체 및 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로부터 선택된 화합물을 유효성분으로 함유하는 생체의 기관 또는 조직의 섬유화로 인한 질환의 예방 및 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R₁은 수소, 하이드록실기, 메톡시기, 트리플루오로메틸기 또는 아세톡시기이고, R₂는 메틸기, 에틸기, 사이클로펜틸기, 사이클로헥실기, 페닐기 또는 벤질기이며, R₃는 수소, 에틸기, 아세틸기, 아세톡시기, 카르복실기, 벤조일옥시기 또는 3,4,5-트리하이드록시벤조일옥시기이고, R₄ 내지 R₆는 각각 독립적으로 수소, 하이드록실기, 메틸기, 메톡시기, 아세톡시기, 카르복실기 또는 벤조일옥시기이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 생체의 기관 또는 조직의 섬유화로 인한 질환 중에서도 특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis), 골수섬유증(myelofibrosis), 간섬유증(liver fibrosis) 및 신장섬유증(kidney fibrosis)으로 이루어진 군중에서 선택된 질환의 예방 및 치료에 특히 효과적일 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물에 있어서, 상기 R₁은 하이드록실기 또는 메톡시기이고, 상기 R₂는 메틸기이며, 상기 R₃은 수소이고, 상기 R₅는 하이드록실기 또는 메톡시기이며, 상기 R₄ 및 R₆은 각각 독립적으로 수소, 하이드록실기 또는 메톡시기인 것이 바람직하다.

본 발명의 약제학적 조성물에 있어서, 상기 크로몬 유도체는 2-(3,4-다이메톡시페닐)-5,7-다이하이드록시-6-메톡시-크로몬(유파틸린, 화학식 2), 2-(3,4-다이하이드록시페닐)-5,7-다이하이드록시-6-메톡시-크로몬(화학식 3), 5,7-다이하이드록시-2-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)-6-메톡시-크로몬(화학식 4), 5,7-다이하이드록시-2-(4-하이드록시페닐)-6-메톡시-크로몬(화학식 5), 5-하이드록시-2-(4-하이드록시페닐)-6,7-다이메톡시-크로몬(화학식 6) 및 2-(3,4-다이하이드록시페닐)-5-하이드록시-6,7-다이메톡시-크로몬(화학식 7) 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 화학식 1의 크로몬 유도체를 유효성분으로 함유함으로써 EMT의 활성화를 효과적으로 억제할 수 있으며, 이에 따라 EMT의 활성화로 유도되는 기관 또는 조직의 섬유화를 효과적으로 억제할 수 있다. 특히 이미 섬유화가 이루어진 세포를 본래의 정상적인 형태로 되돌릴 수 있어 섬유증을 예방하거나 초기 대응하는 것에 그치지 않고 섬유증이 진행된 중기 또는 말기의 증상도 치료할 수 있다.

도 1은 본 발명의 크로몬 유도체 중 하나인 유파틸린의 합성과정을 나타낸 것이다.
도 2는 골수세포에서 분화된 대식세포에서 유파틸린의 DEC2 mRNA 발현 증가 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 유파틸린의 섬유화 저해효과를 나타낸 것으로, 각 실험군 중 생쥐 1마리로부터 3부분의 폐조직을 회수 후 masson's trichrome staining하여 현미경으로 촬영한 사진이다. 정상대조군 : 블레오마이신 및 유파틸린을 투여하지 않고 vehicle 만을 투여하여 사육한 정상 생쥐, 블레오마이신 투여군 : 블레오마이신을 투여하여 폐섬유화를 유도한 생쥐, 블레오마이신+유파틸린 투여군 : 블레오마이신을 투여하여 폐섬유화를 유도하고 유파틸린(40㎍)을 투여한 생쥐.
도 4는 섬유화 세포 모델로 제조한 ONGHEPA1 세포주의 IHC 분석 결과를 나타낸 것으로, 이 세포주가 중배엽에서 기원한 세포이며 간세포(hepatocytes)가 아니므로 간성상세포(Hepatic Stellate Cells, HSC)(이하, 'HSC'라 한다.) 계통의 세포라는 것을 알 수 있다. 좌측 : anti-GATA4 항체 반응 양성화를 사용한 IHC 결과, 우측 : anti-CK-18 항체 반응 음성화를 사용한 IHC 결과.
도 5는 ONGHEPA1 세포주의 FACS 분석 결과를 나타낸 것으로, ONGHEPA1은 간의 간엽줄기세포로서 생체막 단백질인 CD29, CD44, CD71 및 CD106을 발현한다.
도 6은 유파틸린(이하, 도면에서 Eupatilin의 약자인 'Eup'를 사용함) 처리하의 섬유화 저해효과 실험결과를 나타낸 것으로, ONGHEPA1 세포의 배양 시간(6시간, 12시간, 24시간, 48시간 경과 시점) 및 약물 처리에 따른 현미경 사진을 나타낸 것이다. 대조군 : 별도의 처리없이 ONGHEPA1 세포를 배양한 대조군, 6h ~ 48h TGFβ : 배양액에 TGF-β(5ng/㎖, 이하 다른 도면에서도 TGF-β는 5ng/㎖의 농도로 처리한 것이다.)를 첨가하고 6 ~ 48시간 동안 ONGHEPA1 세포를 배양한 실험군, 6h ~ 48h TGFβ Eup(50μM) : 배양액에 TGF-β 및 유파틸린(50μM, 이하 다른 도면에서도 유파틸린 및 크로몬 유도체는 50μM의 농도로 처리한 것이다.)을 첨가하고 6 ~ 48시간 동안 ONGHEPA1 세포를 배양한 실험군.
도 7은 유파틸린의 섬유화 저해효과 실험결과를 나타낸 것으로, 유파틸린을 먼저 ONGHEPA1 세포에 처리한 다음 세척하여 유파틸린을 제거하고 TGF-β를 처리하여 섬유화를 유도하였을 때의 현미경 사진을 나타낸 것이다. DMSO : 배양액에 DMSO (유파틸린의 용매)를 첨가하고 24시간 동안 ONGHEPA1 세포를 배양한 대조군, Eup : 배양액에 유파틸린을 첨가하고 24시간 동안 ONGHEPA1 세포를 배양한 대조군, TGFβ : 배양액에 TGF-β를 첨가하고 24시간 동안 ONGHEPA1 세포를 배양한 대조군, TGFβ+DMSO : 배양액에 TGF-β 및 DMSO를 첨가하고 24시간 동안 ONGHEPA1 세포를 배양한 대조군, TGFβ+Eup : 배양액에 TGF-β 및 유파틸린을 첨가하고 24시간 동안 ONGHEPA1 세포를 배양한 대조군, Eup -2hr ~ 6hr + TGFβ : 배양액에 유파틸린을 첨가하고 2 ~ 6시간 ONGHEPA1 세포를 배양한 다음 세척하여 유파틸린을 제거하고 TGF-β를 첨가하여 24시간 동안 배양한 실험군.
도 8은 유파틸린의 섬유화 저해효과 실험결과를 나타낸 것으로, TGF-β를 먼저 ONGHEPA1 세포에 처리하여 섬유화를 유도한 다음 세척하여 TGF-β를 제거하고 유파틸린을 처리하였을 때의 현미경 사진을 나타낸 것이다. DMSO : 배양액에 DMSO(유파틸린의 용매)를 첨가하고 24시간 동안 ONGHEPA1 세포를 배양한 대조군, Eup : 배양액에 유파틸린을 첨가하고 24시간 동안 ONGHEPA1 세포를 배양한 대조군, TGFβ : 배양액에 TGF-β를 첨가하고 24시간 동안 ONGHEPA1 세포를 배양한 대조군, TGFβ+DMSO : 배양액에 TGF-β 및 DMSO를 첨가하고 24시간 동안 ONGHEPA1 세포를 배양한 대조군, TGFβ+Eup : 배양액에 TGF-β 및 유파틸린을 첨가하고 24시간 동안 ONGHEPA1 세포를 배양한 대조군, TGFβ-1hr ~ 12hr + Eup : 배양액에 TGF-β를 첨가하고 1 ~ 12시간 ONGHEPA1 세포를 배양한 다음 세척하여 TGF-β를 제거하고 유파틸린을 첨가하여 24시간 동안 배양한 실험군.
도 9는 유파틸린의 섬유화 역전 효과 실험결과를 나타낸 것으로, TGF-β를 먼저 ONGHEPA1 세포에 처리하여 섬유화를 유도한 다음 세척하여 TGF-β를 제거하고 유파틸린 또는 TGF-β를 처리하였을 때의 현미경 사진을 나타낸 것이다. TGFβ 24hr & wash : 배양액에 TGF-β를 첨가하고 24시간 ONGHEPA1 세포를 배양한 다음 세척하여 TGF-β를 제거하고 24시간 동안 배양한 대조군, TGFβ+TGFβ : 배양액에 TGF-β를 첨가하고 24시간 ONGHEPA1 세포를 배양한 다음 세척하여 TGF-β를 제거하고 다시 TGF-β를 첨가하여 24시간 동안 배양한 대조군, TGFβ+Eup : 배양액에 TGF-β를 첨가하고 24시간 ONGHEPA1 세포를 배양한 다음 세척하여 TGF-β를 제거하고 유파틸린(50μM) 및 TGF-β를 첨가하여 24시간 동안 배양한 실험군.
도 10은 유파틸린의 EMT 저해효과 실험결과를 나타낸 것으로, ONGHEPA1 세포의 처리에 따른 Col1, Vim 및 Twist의 발현양상을 분석한 real-time RT-PCR 결과를 나타낸 그래프이다. Cont : 별도의 처리없이 ONGHEPA1 세포를 24시간 배양한 대조군, Eup : 배양액에 유파틸린을 첨가하여 ONGHEPA1 세포를 24시간 배양한 대조군, TGFβ : 배양액에 TGF-β를 첨가하여 ONGHEPA1 세포를 24시간 배양한 대조군, TGFβ+Eup : 배양액에 TGF-β 및 유파틸린을 첨가하여 ONGHEPA1 세포를 24시간 배양한 실험군.
도 11 및 12는 크로몬 유도체의 섬유화 저해효과 실험결과를 나타낸 것으로, TGF-β를 처리하여 섬유화를 유도하고 각 50μM 크로몬 유도체를 처리하였을 때의 현미경 사진을 나타낸 것이다. DMEM : 별도의 처리없이 ONGHEPA1 세포를 배양한 대조군, TGFβ : 배양액에 TGF-β를 첨가하고 24시간 동안 ONGHEPA1 세포를 배양한 대조군, TGFβ+Eup : 배양액에 TGF-β 및 유파틸린을 첨가하고 24시간 동안 ONGHEPA1 세포를 배양한 대조군, TGFβ+ONGA100 : 배양액에 TGF-β 및 ONGA100(화학식 8)을 첨가하고 24시간 동안 ONGHEPA1 세포를 배양한 실험군, TGFβ+ONGI300 : 배양액에 TGF-β 및 ONGI300(화학식 3)을 첨가하고 24시간 동안 ONGHEPA1 세포를 배양한 실험군, TGFβ+ONGC200 : 배양액에 TGF-β 및 ONGC200(화학식 5)을 첨가하고 24시간 동안 ONGHEPA1 세포를 배양한 실험군, TGFβ+ONGE200 : 배양액에 TGF-β 및 ONGE200(화학식 6)을 첨가하고 24시간 동안 ONGHEPA1 세포를 배양한 실험군, TGFβ+ONGH200 : 배양액에 TGF-β 및 ONGH200(화학식 7)을 첨가하고 24시간 동안 ONGHEPA1 세포를 배양한 실험군, TGFβ+wogonin : 배양액에 TGF-β 및 wogonin(화학식 9)을 첨가하고 24시간 동안 ONGHEPA1 세포를 배양한 실험군, TGFβ+ONGB200 : 배양액에 TGF-β 및 ONGB200(화학식 10)을 첨가하고 24시간 동안 ONGHEPA1 세포를 배양한 실험군, TGFβ+ONGE300 : 배양액에 TGF-β 및 ONGE300(화학식 11)을 첨가하고 24시간 동안 ONGHEPA1 세포를 배양한 실험군, TGFβ+ONGD200 : 배양액에 TGF-β 및 ONGD200(화학식 12)을 첨가하고 24시간 동안 ONGHEPA1 세포를 배양한 실험군, TGFβ+ONGH300 : 배양액에 TGF-β 및 ONGH300(화학식 13)을 첨가하고 24시간 동안 ONGHEPA1 세포를 배양한 실험군, TGFβ+ONGD400 : 배양액에 TGF-β 및 ONGD400(화학식 14)을 첨가하고 24시간 동안 ONGHEPA1 세포를 배양한 실험군.
도 13은 대조군 ONGHEPA1 세포, 섬유화를 유도한 ONGHEPA1 세포 및 섬유화를 유도하고 유파틸린을 처리한 ONGHEPA1 세포의 transcriptome을 분석한 결과를 나타낸 것이다. 대조군 : ONGHEPA1 세포, TGFβ : 배양액에 TGF-β를 첨가하고 24시간 동안 ONGHEPA1 세포를 배양한 대조군, TGFβ+Eup : 배양액에 TGF-β 및 유파틸린을 첨가하고 24시간 동안 ONGHEPA1 세포를 배양한 실험군.
도 14는 정상적인 ONGHEPA1 세포, 섬유화를 유도한 ONGHEPA1 세포 및 섬유화를 유도하고 유파틸린을 처리한 ONGHEPA1 세포에서 발현이 변화되는 유전자의 유전자 induction fold와 p-value를 비교하여 나타낸 volcano plot이다.
도 15는 정상적인 ONGHEPA1 세포, 섬유화를 유도한 ONGHEPA1 세포 및 섬유화를 유도하고 유파틸린을 처리한 ONGHEPA1 세포에서 발현이 유의적으로 변화되는 유전자들의 interactome을 unbiased manner로 분석하여 나타낸 것이다.

EMT가 신장 섬유증에서 중요한 역할을 하며(Grande et al., 2015 및 Lovisa et al., 2015) 이러한 EMT가 DEC2에 의해 조절될 수 있다는 기존의 연구결과(Suzuki et al., 2014 및 Sato et al., 2012)를 바탕으로 EMT와 섬유증의 연관성, 그리고 DEC2와 EMT의 연관성에 주목하게 되었고 DEC2를 조절할 수 있다면 EMT를 조절할 수 있게 되어 결과적으로 섬유증을 예방 및 치료할 수 있을 것이라 판단하였다.

DEC2는 EMT의 조절인자인 Twist 및 Slug의 전사억제인자로 알려져 있으므로, DEC2의 발현을 증가시킬 수 있다면 EMT 조절인자의 발현이 억제되고 EMT가 억제되어 결과적으로 섬유화가 억제될 것이다.

이에 먼저 본 발명의 크로몬 유도체 중 유파틸린의 DEC2 발현 조절 가능성을 조사한 결과, 유파틸린이 DEC2의 mRNA 발현을 크게 증가시키는 것으로 나타나 유파틸린의 섬유증 치료 가능성을 발견하였다(도 2 참조).

유파틸린의 섬유증 치료 가능성을 좀더 명확하게 확인하기 위하여, 쥐의 폐에 블레오마이신(bleomycin)을 주입하여 폐섬유화를 유도하면서 이때 유파틸린의 효과를 조사한 결과, 블레오마이신으로 유도된 폐조직의 섬유화를 유파틸린이 효과적으로 억제하는 것으로 나타나 유파틸린이 실제로 특발성 폐섬유증과 같은 폐조직의 섬유화를 억제할 수 있다는 사실을 발견할 수 있었다(도 3 참조).

여기서 멈추지 않고 유파틸린이 폐섬유증 이외에 다른 조직의 섬유증도 억제할 수 있는지 확인하고자 하였으며, 이를 확인하기 위한 모델로 간섬유증과 밀접한 관계가 있는 것으로 알려진 HSC에 주목하였다. HSC는 정상적인 상태에서는 휴지상태로 존재하다가 염증 등의 스트레스로 인해 간세포가 손상되면 TGF-β 또는 PDGF 같은 세포 성장인자에 의해 활성화되어 세포외 기질(extra cellular matrix, ECM)을 다량 생산함으로써 조직을 경화시키고, 자신이 근섬유아세포(myofibroblast, MFB)로 분화하여 조직의 섬유화를 유발할 수 있다. 따라서 이 HSC의 무한증식세포(immortalized cell)를 얻고 여기에 TGF-β를 처리하면 섬유화를 유도할 수 있어 섬유화에 대한 유용한 모델이 될 수 있을 것이라 기대하였다. 결과적으로 무한증식 HSC를 얻을 수 있었고, TGF-β의 처리를 통해 실제로 근섬유화세포로 100% 분화하는 세포주를 확립할 수 있었다(도 4 및 5 참조). 이 세포주를 ONGHEPA1(KCTC13086BP)로 명명하였다.

상기와 같은 ONGHEPA1 세포를 이용하여 유파틸린의 섬유화 억제 효과를 확인한 결과, TGF-β의 처리로 유도된 섬유화를 유파틸린이 효과적으로 억제하는 것으로 나타나 유파틸린이 실제로 간섬유증과 같은 간조직의 섬유화를 억제할 수 있다는 사실을 발견할 수 있었다(도 6 참조). 또한, 유파틸린을 ONGHEPA1 세포에 전처리한 다음 세척하여 유파틸린을 제거하고 TGF-β를 처리하여 섬유화를 유도하였을 경우에는 어떠한 변화도 없는 것으로 나타나 유파틸린이 정상적인 HSC에는 어떠한 영향도 미치지 않는다는 사실도 발견할 수 있었다(도 7 참조).

지금까지는 조직 또는 세포가 섬유화하는 과정에서 유파틸린의 효과를 확인하여 유파틸린이 섬유화의 진행을 억제한다는 것을 밝혔지만, 이미 섬유화가 이루어진 상태에서는 어떠한 효과를 나타낼 것인지 추가로 확인할 필요가 있었다. 이에 ONGHEPA1 세포에 TGF-β를 처리하고 일정시간이 지나도록하여 섬유화를 진행시킨 이후에 유파틸린을 처리하였을 때의 변화를 조사한 결과, 이미 섬유화가 이루어진 ONGHEPA1 세포를 유파틸린이 본래의 정상적인 형태로 되돌릴 수 있다는 것을 발견할 수 있었다(도 8 및 9 참조). 이는 유파틸린이 섬유증을 예방하거나 초기 대응하는 것에 그치지 않고 섬유증이 진행된 중기 또는 말기의 증상도 치료할 수 있다는 것을 의미한다.

연구 초기에 예상했던 것과 같이 섬유증의 치료 효과가 EMT의 억제를 통해 이루어진 것인지를 확인하고자, EMT에 관여하는 인자인 Col1(type 1 Collagen), Vim(Vimentin) 및 Twist의 발현양상을 조사한 결과, 유파틸린이 이들 유전자의 발현을 억제하는 것으로 나타나 예상했던 바와 같이 유파틸린이 EMT를 억제함으로써 섬유화를 억제한다는 것이 확인되었다(도 10 참조).

유파틸린의 섬유증 치료 효과가 EMT를 억제하기 때문인지 보다 명확하게 알아보고자 정상세포에 비해 섬유화가 유도될 때, 그리고 유파틸린의 처리로 섬유화가 억제될 때의 총 mRNA 분석을 통해 발현에서 유의적인 차이를 보이는 유전자를 조사하고 이들 유전자 사이의 상호작용체(interactome)를 조사하였다. 이의 결과, 8개의 유전자 네트워크 허브를 이루고 이들 허브가 대부분 EMT에 관련된 유전자로 구성되어 있으며, 이들 허브를 연결하는 노드 유전자가 EMT의 매우 중요한 인자들인 것으로 나타나 유파틸린의 섬유증 치료 효과가 EMT의 조절을 통해 이루어진다는 것이 명확하게 밝혀졌다(도 13 내지 15 참조).

또한, 총 mRNA 분석결과 중 특히 발현 차이가 큰 유전자를 분석한 결과, 103개의 유전자가 TGF-β 처리 섬유화 유도로 인해 발현이 크게 증가하고 유파틸린 처리로 섬유화가 억제되면서 발현이 거의 이루어지지 않을 정도로 차이가 있는 것을 발견할 수 있었다. 즉 이들 유전자는 유파틸린의 표적유전자라고 할 수 있다. 이들 유전자들 또한 대부분 EMT에 관여하는 인자들이며 기존 연구결과를 통해 섬유화에 중요한 인자로 알려진 것이었다(표 2 내지 5 참조).

특히 Follistatin-like 1(Fstl1) 유전자의 경우, 이 유전자의 발현을 억제시키면 블레오마이신으로 폐섬유화를 유도하더라도 폐섬유화가 거의 이루어지지 않는다는 연구결과(Dong et al., 2015)가 있었는데, 유파틸린이 이러한 Fstl1의 발현을 거의 제로에 가깝게 억제한다는 결과는 유파틸린의 폐섬유화 치료 효과를 보다 명확하게 설명하는 것이며 상기와 같은 가설과 함께 유파틸린이 강력한 섬유증 치료제가 될 수 있다는 것을 뒷받침한다.

또한, 상기 103개의 유전자는 HSC 세포 뿐만 아니라 다른 섬유아세포나 암세포에서도 발현되는 유전자들로 상기와 같은 결과는 유파틸린이 간섬유화 뿐만 아니라 다른 조직 또는 세포의 섬유화도 치료할 수 있다는 것을 시사한다.

이와 같은 결과들을 바탕으로 유파틸린의 섬유증 치료 효과를 확인하였으며, 이러한 효과가 유파틸린의 특이적인 구조로 인한 것이라 예상하였다. 따라서 유파틸린과 유사한 구조를 갖는 화합물 또한 유사한 효과를 나타낼 것이라 판단하였고, ONGHEPA1 세포 모델을 사용하여 같은 방법으로 유파틸린 이외에 다른 크로몬 유도체의 섬유증 치료 효과를 조사하였다. 이의 결과, 화학식 2, 화학식 3, 화학식 5 및 화학식 7과 같은 유파틸린과 유사한 구조를 갖는 크로몬 유도체가 우수한 섬유화 억제 효과를 나타냈으며, 반면 유파틸린과 유사한 구조를 갖는 크로몬 유도체이지만 화학식 8, 화학식 9(오고닌, wogonin), 화학식 10, 화학식 11과 같이 화학식 1의 구조에서 -O-R₂의 치환기가 H인 구조의 화합물은 모두 섬유화 억제 효과가 없는 것으로 나타났고, 화학식 12와 같이 -O-R₂의 치환기가 -OH인 구조의 화합물과 화학식 13 및 화학식 14와 같이 R₃의 치환기가 -O-CH₃(methoxy)인 구조의 화합물은 세포에 괴사를 일으키는 등의 독성을 나타내었다(도 11 및 12 참조).

이와 같이, 섬유화 억제 효과를 위해서는 화학식 1의 구조에서 -O-R₂의 치환기와 R₃의 치환기가 매우 중요한 것으로 나타났으며, 이에 따라 화학식 1의 구조에서 -O-R₂의 치환기가 H 또는 -OH가 아니고, R₃의 치환기가 -O-CH₃가 아닌 경우 섬유화 억제 효과를 나타낼 수 있을 것으로 판단된다.

본 발명의 크로몬 유도체는 통상의 방법, 예를 들어 도 1과 같은 방법 또는 이의 변형을 통해 제조될 수 있으며, 화합물을 합성 또는 판매하는 회사를 통해 쉽게 입수할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 전체 조성물의 중량을 기준으로 본 발명의 크로몬 유도체를 0.1 내지 90중량%로 함유할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명 약제학적 조성물의 일일 투여량은 조성물에 함유된 본 발명의 크로몬 유도체를 기준으로 체중 1㎏ 당 약 0.0001 내지 100㎎, 바람직하게는 0.001 내지 10㎎일 수 있으며, 하루 1회 내지 수회 나누어 투여될 수 있으나 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.

실제 임상 투여 시에 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 크로몬 유도체에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

크로몬 유도체

본 실시예에서는 2-(3,4-다이메톡시페닐)-5,7-다이하이드록시-6-메톡시-크로몬(화학식 2)(유파틸린), 2-(3,4-다이하이드록시페닐)-5,7-다이하이드록시-6-메톡시-크로몬(화학식 3)(이하, 'ONGI300'이라 한다.), 5,7-다이하이드록시-2-(4-하이드록시페닐)-6-메톡시-크로몬(화학식 5)(이하, 'ONGE200'이라 한다.), 5-하이드록시-2-(4-하이드록시페닐)-6,7-다이메톡시-크로몬(화학식 6)(이하, 'ONGC200'이라 한다.) 및 2-(3,4-다이하이드록시페닐)-5-하이드록시-6,7-다이메톡시-크로몬(화학식 7)(이하, 'ONGH200'이라 한다.)을 포함하여, 오고닌 등 화학식 8 내지 14와 같은 크로몬 유도체를 사용하였다.

본 실시예에서 사용한 유파틸린은 도 1과 같은 과정을 거쳐 합성하여 사용하였다.

실시예 1. DEC2 발현 증가 효과 확인

DEC2는 EMT의 조절인자인 Twist 및 Slug의 전사억제인자로 알려져 있다. 본 발명자는 DEC2의 발현이 증가하면 Twist 및 Slug 등 EMT 조절인자의 전사가 억제되고, 이에 따라 EMT가 억제되기 때문에 조직이 섬유화되는 것이 억제될 것이라고 판단하였다.

따라서 본 발명의 크로몬 유도체로 인해 DEC2의 발현이 증가하는지를 확인하였다. 이때 크로몬 유도체로는 유파틸린을 사용하였다.

쥐 골수세포(mouse bone marrow cells, MBMC)에 M-CSF(macrophage-colony stimulating factor)와 RANK(receptor activator of NFκB) 리간드(RANKL)를 처리하여 활성화시키고, 여기에 유파틸린을 50μM의 농도로 처리하여 4일간 배양한 후 DEC2의 발현양상을 확인하였다.

이의 결과, 도 2에서와 같이 유파틸린은 DEC2의 mRNA 발현을 7 ~ 8배 증가시키는 DEC2 유도제(inducer)로 작용한다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2. 블레오마이신으로 유도된 폐조직의 섬유화에서 효과 확인

상기 실시예 1을 통해 유파틸린이 DEC2의 발현을 증가시킨다는 것을 확인하였으며, 이에 따라 유파틸린이 섬유화를 억제할 것이라는 가능성을 확인할 수 있었다. 이를 바탕으로 실제 동물모델을 사용하여 유파틸린이 실제로 조직 섬유화를 억제할 수 있는지를 확인하였다.

5주령의 수컷 C57BL/6J 생쥐(체중 18.2 ~ 20.5g)(KOATECH, 한국)를 실험동물로 사용하였으며, 실험동물은 각 군당 5마리씩으로 다음 표 1과 같은 군으로 나누었다.

실험군	블레오마이신 투여	유파틸린 투여
정상대조군	-	-
블레오마이신 투여군	40㎍/head	vehicle
블레오마이신+유파틸린 1㎍ 투여군	40㎍/head	1㎍/20㎕
블레오마이신+유파틸린 5㎍ 투여군	40㎍/head	5㎍/20㎕
블레오마이신+유파틸린 10㎍ 투여군	40㎍/head	10㎍/20㎕
블레오마이신+유파틸린 20㎍ 투여군	40㎍/head	20㎍/20㎕
블레오마이신+유파틸린 40㎍ 투여군	40㎍/head	40㎍/20㎕

실험동물은 SPF(Specific Pathogen Free), BSL(Bio Safety Level) 2등급시설에서 폴리술폰(polysulfone) 재질, 369L x 156W x 132H(mm)(EU, USA, UK GL compliance) 규격의 사육상자를 사용하여 사육하였다. 사육상자 당 수용동물 수는 검역ㅇ순화기간에 2 ~ 3마리, 시험기간에 2 ~ 3마리로 하였고, 온도 22 ± 2℃, 상대습도 50.0 ± 15.0%, 환기횟수 10 ~ 20회/시간, 명암주기(조명시간) 12시간/일(07:00 ~ 19:00), 조도 150 ~ 300Lux의 조건 하에서 사육하였다.

폐섬유화를 유도하기 위해 Kremer 등, Laxer 등 및 Berkman 등의 기관내 주입(intratracheal instillation, IT) 방법에 따라 블레오마이신(bleomycin) 용액을 기관(trachea)을 통하여 직접 폐 속에 주입하는 방법을 사용하였다. 즉, C57BL/6J 생쥐를 70% N₂O와 30% O₂ 가스 및 1.5% isoflurane으로 흡입마취한 상태에서 전경부의 피부를 절개하고 근육을 정리하여 기관을 노출시킨 다음 안과용 수술가위로 기관을 조금 절개하였다. 앞을 둥글게 만든 19 gauge 주사바늘을 장착한 1㎖ 주사기를 사용하여 블레오마이신을 녹인 증류수용액 50㎕를 절개된 기관을 통하여 직접 폐 속으로 단번에 주입하였다. 주입 직후 곧바로 절개한 전경부의 피부를 봉합하고 마취에서 깨어나게 한 다음 일반사육 케이지에 담아 사육하였다. 블레오마이신의 투여는 비디오 점적기(visual instillobot)를 이용하여 수행하였으며, 블레오마이신-HCl 40㎍/50㎕을 1회 투여하여 12일간의 폐섬유화 질환 유도기간을 설정하였다.

유파틸린은 DPBS buffer(1% DMSO 함유)에 녹여 사용하였으며, 유파틸린의 투여액량은 1㎖/㎏으로 하였고, 개체별 투여량은 최근 체중 측정을 기준으로 산출하였다. 블레오마이신 투여 12일 후, 마이크로 피펫을 이용하여 1일 1회(주 5회), 1주간 강제 비강투여하였다. 유파틸린 투여 후 2 ~ 3일간의 독성증상 및 사망유무를 관찰하였으나, 블레오마이신과 유파틸린을 투여한 후 별다른 이상증상이 관찰되지 않았다.

각 실험군 당 3마리를 선정하여 폐조직을 분리하였다. 분리된 폐조직을 masson's trichrome staining하여 현미경으로 관찰한 결과, 블레오마이신의 처리로 폐섬유화가 유도되었으며, 유파틸린 20㎍ 투여군 및 40㎍ 투여군에서 유파틸린의 투여로 폐섬유화가 저해되는 것을 확인할 수 있었다. 특히 유파틸린 40㎍ 투여군에서 폐섬유화의 보다 효과적인 저해를 확인할 수 있었다(도 3 참조).

이와 같은 결과는 유파틸린이 섬유화 질환, 특히 폐섬유증의 효과적인 치료제로 사용될 수 있다는 것을 명확하게 뒷받침한다.

실시예 3. 간섬유화에서 효과 확인

크로몬 유도체가 간섬유화에 미치는 영향을 확인하기 위하여 HSC를 제작하고 여기에 TGF-β를 처리하여 간섬유화가 유도되는 과정에서 크로몬 유도체의 효과를 확인하였다.

3-1. HSC 제작

C57BL/6 마우스의 간조직을 떼어낸 후 단세포 현탁액(single cell suspension)을 만들어 계속적인 배양을 통해 무한 증식하는 세포를 얻었고, RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction), IHC(immunohistochemistry), FACS(fluorescence-activated cell sorting) 실험을 통해 HSC 류의 간엽줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC) 세포주임을 확인하였다. 이 세포주를 ONGHEPA1이라고 명명하였으며, 한국생명공학연구원의 생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호(KCTC13086BP)를 부여받았다.

HSC는 간섬유증과 밀접한 관련이 있다. HSC가 근섬유화 세포로 전환되고, EMT(Epithelial Mesenchymal Transition)에 관여하는 다양한 단백질을 분비함으로써 간의 섬유화가 이루어진다. 따라서 HSC 류의 간엽줄기세포는 매우 우수한 간섬유화 모델이 될 수 있다.

* RT-PCR 결과 : 알부민 음성으로 나타나 ONGHEPA1 세포주가 간세포(hepatocytes)가 아님을 확인하였다. 참고로 HSC는 간세포가 아니며, 따라서 알부민을 발현하지 않는다.

* IHC 분석결과 : ONGHEPA1 세포주를 고정한 후 anti-GATA4와 anti-CK-18 항체를 사용하여 IHC를 수행한 결과, GATA4 및 CK-18, 즉 endo/ectodermal 마커가 발현되는 것으로 나타났다. 이는 ONGHEPA1 세포주가 간세포가 아님을 나타낸다(도 4 참조).

* FACS 분석결과 : ONGHEPA1 세포주가 간의 MSC인지 확인하기 위해 MSC 마커 항체로 FACS를 수행하였다. CD29, CD44, CD71 및 CD106이 세포의 표면에 발현되는 것으로 나타나 ONGHEPA1는 MSC임이 확인되었다(도 5 참조).

3-2. 간섬유화 세포주의 섬유화 특성 분석

간섬유화의 가장 중요한 원인 세포는 HSC이다. HSC는 여러 세포로 분화되며 그 중 하나가 근섬유아세포(myofibroblast)이다. 또한 HSC는 다량의 세포외 기질 단백질(extracellular matrix protein, ECM)을 세포 사이에 분비하여 세포의 움직임을 둔화시킨다. Collagen α1이 가장 많은 ECM 단백질이다. 동시에 섬유아세포에 αSMactinin(alpha smooth muscle actinin)이 과발현되어 세포 골격을 경화시킨다.

상기와 같은 HSC의 특성을 이용하여 ONGHEPA1의 섬유화 특성을 확인하였다. 섬유화를 유도하기 위해 TGF-β(transforming growth factor beta)를 처리하고 6시간, 12시간, 24시간, 48시간이 경과된 시점에서 세포의 형태를 관찰한 결과, 24시간이 경과된 시점에서 상당한 섬유화가 진행되었으며 48시간이 경과된 시점에서는 더욱 섬유화가 진행되었음을 확인하였다(도 6의 A 참조).

3-3. 유파틸린의 효과 분석

상기 3-2를 통해 ONGHEPA1 세포의 섬유화 특성을 확인하였으며, 이를 바탕으로 유파틸린의 효과를 분석하기 위한 실험을 수행하였다.

ONGHEPA1 세포를 배양하면서 TGF-β를 처리하여 섬유화를 유도하되, 배양액 상에 50μM의 농도로 유파틸린을 첨가하였다. 이의 결과 TGF-β를 처리한 섬유화 실험군(실시예 3-2의 결과, 도 6의 A 참조)에서와는 달리 24시간 이후에 HSC가 근섬유아세포(myofibroblast)로 분화되는 현상 및 섬유화 현상이 관찰되지 않았다(도 6의 B 참조). 이러한 결과는 유파틸린이 간섬유화의 가장 큰 원인인 MSC 유래의 HSC가 근섬유아세포로 분화하는 것을 효과적으로 차단할 수 있다는 것을 나타낸다.

상기와 같은 유파틸린의 효과를 보다 명확하게 확인하기 위하여, 상기와 동일한 방법으로 유파틸린을 먼저 ONGHEPA1 세포에 처리한 다음 세척하여 유파틸린을 제거하고 TGF-β를 처리하여 섬유화를 유도하였을 때의 양상을 조사하였다. 이의 결과, 도 7에서와 같이 사전에 유파틸린을 처리하였다고 하더라도 섬유화가 진행되는 상태에 유파틸린이 존재하지 않는다면 섬유화의 진행을 억제하지 못하는 것으로 나타났다. 이는 유파틸린이 섬유화가 진행되는 과정에 직접적으로 관여하여 섬유화의 진행을 억제한다는 것을 나타낸다.

이번엔 반대로 TGF-β를 먼저 ONGHEPA1 세포에 처리하여 섬유화를 유도한 다음 세척하여 TGF-β를 제거하고 유파틸린을 처리하였을 때의 양상을 조사하였다. 이의 결과, 도 8에서와 같이 사전에 TGF-β를 처리하여 섬유화를 유도하였음에도 불구하고 유파틸린의 처리로 인해 대조군과 같은 정상적인 세포상태를 유지하는 것으로 나타났다. 이는 이미 섬유화가 진행되었다고 하더라도 유파틸린이 세포를 본래의 정상적인 상태로 되돌릴 수 있다는 가능성을 나타낸다.

세포의 섬유화가 이루어진 이후 유파틸린이 섬유화 세포를 정상세포로 되돌릴 수 있는지 보다 명확하게 확인하기 위하여, TGF-β를 ONGHEPA1 세포에 24시간 처리하여 완전히 섬유화가 이루어지도록 한 다음 유파틸린을 처리하였을 때의 양상을 조사하였다. 이의 결과, 도 9에서와 같이 TGF-β의 처리로 인하여 완전히 섬유화가 이루어진 상태에서도 유파틸린은 세포를 정상상태로 되돌릴 수 있는 것으로 나타났다. 이는 섬유화가 상당히 진행된 상태의 섬유증도 유파틸린이 효과적으로 치료할 수 있음을 나타낸다.

또한, 상기와 같은 유파틸린의 효과가 유파틸린의 EMT에 대한 영향으로 인한 것인지 확인하기 위하여, 각 실험군에서 24시간 배양한 세포를 대상으로 ECM인 Col1(type 1 Collagen), Vim(Vimentin) 및 Twist의 발현양상을 real-time RT-PCR을 통해 확인한 결과, 도 10에서와 같이 TGF-β의 처리로 인해 섬유화가 유도되어 EMT 조절인자들의 발현이 증가하는 반면, 유파틸린의 처리로 인해 이들의 발현이 억제되는 것으로 나타났다.

상기와 같은 결과들은 유파틸린이 섬유화 질환, 특히 간섬유증의 효과적인 치료제로 사용될 수 있다는 것을 명확하게 뒷받침한다.

3-4. 유파틸린 이외 크로몬 유도체의 효과 분석

상기 실시예 3-3과 같은 방법으로 유파틸린 이외의 다양한 크로몬 유도체의 섬유화에 대한 효과를 조사하였다. ONGHEPA1 세포를 배양하면서 TGF-β를 처리하여 섬유화를 유도하되, 배양액 상에 50μM의 농도로 크로몬 유도체를 첨가하였다.

이의 결과, 도 11에서와 같이 ONGI300, ONGC200, ONGE200 및 ONGH200의 크로몬 유도체도 섬유화의 진행을 억제하는데 우수한 효과가 있는 것으로 나타났다. 반면, 도 11 및 12에서와 같이 오고닌을 비롯하여, ONGA100, ONGB200 및 ONGE300은 섬유화 진행 억제효과가 없거나 매우 낮은 것으로 나타났으며, ONGD200, ONGH300 및 ONGD400은 세포에 괴사를 일으키는 등의 독성을 나타내었다.

실시예 4. 글로벌 유전자 발현 양상 분석

상기와 같은 섬유증 치료 효과에 대한 메커니즘을 살펴보기 위하여, DMSO를 처리한 ONGHEPA1 세포(대조군), TGF-β의 처리로 인해 섬유화가 유도된 ONGHEPA1 세포 및 TGF-β와 유파틸린을 함께 처리한 ONGHEPA1 세포의 글로벌 유전자 발현 양상을 조사하였다.

DMSO, TGF-β 또는 유파틸린을 각각 처리하고 24시간 후에 total RNA를 분리하여 라이브러리를 제작한 다음 Illumina High-seq 시퀀서로 30 Giga의 전체 transcriptome 약 10,000여 개의 발현된 mRNA를 분석하였다.

이의 결과, 다음과 같은 결과가 나타났다(도 13 참조).

1) 3가지 실험군에 공통으로 발현되는 유전자 수 : 9,033개

2) 대조군 ONGHEPA1 세포주에 특이적으로 발현하는 유전자 : 628개

3) TGF-β 처리 시 특이적으로 발현하는 유전자 : 169개

4) TGF-β와 유파틸린 처리 시 특이적으로 발현되는 유전자 : 150개

5) TGF-β 처리군 및 TGF-β+유파틸린 처리군에서 공통으로 발현되는 유전자 : 657개

6) 대조군 및 TGF-β 처리군에서 공통으로 발현되는 유전자 : 171개

7) 대조군 및 TGF-β+유파틸린 처리군에서 공통으로 발현되는 유전자 : 188개

이에 따라, ONGHEPA1 세포주에 TGF-β를 처리하면 826(= 169 + 657)개 유전자의 발현이 유도되어 EMT program이 활성화되고 여기에 유파틸린을 처리하면 328(= 150 + 188)개 유전자의 발현이 다시 유도되어 EMT program을 본래의 상태로 역전시키는 trans-differentiation이 발생한다는 것을 알 수 있었다.

TGF-β 처리군 및 TGF-β+유파틸린 처리군에서 발현이 변화되는 유전자의 유전자 induction fold와 p-value를 비교하여 도 14와 같은 volcano plot으로 나타내었다.

EMT는 종양 발생, 줄기세포 분화 및 섬유화에 관여되는 cellular program으로 현재까지 수백여 개의 유전자가 관여한다는 것이 알려져 있다. Collagen a1, Vimentin, asmactinin, Twist, Snail1, Snail2(=Slug), N-Cadherin 등이 대표적인 EMT marker들이다. 상기 실시예에서 유파틸린이 TGF-β에 의한 Collagen a1, Vimentin 및 Twist 유전자의 발현을 억제하는 것으로 나타났고, RNA-Seq 결과를 보면 976개의 유전자가 TGF-β 또는 유파틸린 처리에 의하여 새롭게 발현되는 것으로 나타났으며, 모든 처리에서 공통으로 발견되는 9,033개의 유전자 발현도 미시적으로 발현 증감이 있어서 이들 모두 직, 간접적으로 EMT에 영향을 미칠 것이라 판단된다. 따라서 TGF-β+유파틸린에 처리에 의하여 통계적으로 p<0.05 이하로 발현이 조절되는 이들 10,000여 개의 유전자들을 모두 선택하고 선택된 유전자 각각에 대해 유전자가 코딩하는 단백질의 모든 기능을 통합한 big data 기반의 유전자 interactome을 unbiased manner로 분석하여 이들 간의 네트워크를 조사해 보았다(도 15 참조).

놀랍게도 이들 유전자 네트워크의 허브(hub)는 8개로 여러 노드(nod)를 매개하여 하나의 네트워크 프레임워크를 구성하며, 8개의 허브가 대부분 EMT에 관련된 유전자로 구성 되어 있는 것으로 나타났다. 세포골격 단백체 허브(I) 및 콜라젠 단백체 허브(II)는 integrin α1(Itga1) 노드에 의하여 네트워크가 형성되며, EMT의 중요인자로 알려진 Cyclin B1을 포함한 cell cycle 단백체 허브-1(III)은 protein kinase C alpha(PKCA) 노드에 연결되어 위 3개 단백체 허브와 함께 integrin beta 3(Itbg3) 노드에 의하여 견고한 네트워크를 구축하고 있는 것으로 나타났다. 다른 두 번째 cell cycle 허브-2(IV)는 전사인자 Lymphoid Enhancer Binding Factor 1(Lef1) 노드가 Cyclin D1(Ccdn1)에 의해 연결되고 Adenylate Cyclase 9(Adcy9) 신호전달 허브가 EMT에 중요한 키모카인 CXCL16을 매개로 EMT 인자들 C-Fos, CCL2, Junb와 네트워크로 연결 되어 있는 것으로 나타났다. 여기서 Adcy9 신호전달 허브는 유파틸린에 의하여 영향을 받는 새로운 EMT regulator라고 사료된다. 암세포의 EMT에 지대한 영향을 주는 것으로 알려진 CD44 허브(V)는 cell migration 및 invasion에 관여하는 secreted phosphoprotein 1(Spp1/Osteopontin) 노드와 연결되어 있는 것으로 나타났다. Spp1(osteopontin) 역시 중요한 EMT 인자로 알려져 있다. Spp1 노드는 ECM protease인 Mmp3와 네트워크로 연결되어 있었다. ECM matrix의 중요 단백질이고 EMT 주요 인자인 Fibrillin 및 Elastin을 포함한 허브(VI)는 central 노드인 integrin b3(Itgb3)에 연결되어 있는 것으로 나타났다. EMT 원인 사이토카인 transforming growth factor b2 단백체 허브(VII)는 serpine1 및 Figf(=VegfD)를 포함하고 kinase insert domain receptor(Kdr) 노드와 네트워크를 구축하고 있는 것으로 나타났다. EMT의 중요 수용체로 알려진 semaphorin과 콜레스테롤 수용체(Vldr) 허브(VIII)에는 plexin D, semaphoring 3E, neurophilin 및 NGF를 포함하고 있고 semaphorin 수용체 허브는 Kdr 노드와 네트워크를 형성하고 있는 것으로 나타났다. Vldr 수용체 허브는 nerve growth factor(Ngf)를 통해 insulin receptor substrate 2I(rs2)와 연결되어 신호전달 축이 형성되어 있는 것으로 나타났다. EMT의 주요 전사인자인 Snail2(=Slug)-Ecadherin(=Cadh1) 노드는 cell cycle 단백체 허브(II)와 네트워크를 구축하고 Ecadherin은 중요한 EMT 인자들 Mmp3, caviolin(Cav), Tenascin C(Tnc) 및 PKCa와 연결되어 있는 것으로 나타났다. PKCa는 integrin b4에 의하여 세포골격 및 콜라젠 단백체 허브와 네트워크를 구축하고 있었다. Tenascin C는 integrin b3와 직접 연결 되어 있었다.

< 허브 I. 세포골격 단백체 허브 >

Troponin I1 & Troponin I2, Tropomyosin 2, Transgelin, α2 smooth muscle actin, Myosin heavy chain 9 & 11, Leiomodin 1, γ2 smooth muscle acitin, Laminin subunit α4

<허브 II. 콜라겐 단백체 허브>

Collagen 4 α5 & α6, Collagen 5 α1 & α3, Collagen 6 α3, Collagen 8 α1 & α5, Collagen 11 α1, Collagen 12 α1, Collagen 15 α1

<허브 III. Cell cycle 단백체 허브-1>

Cyclin B1, Gadd45a, Cyclin F, ASPM, NIMA-related kinase (Nek2), Optineurin

<허브 IV. Cell cycle 단백체 허브-2>

Cyclin D1, Cdk14, C-Fos, Junb, CCL2, CCL7

<허브 V. CD44 연관 단백체 허브>

Cd44, Hypoxia Up-Regulated 1 (Hyou1), Ncam, Calreticulin, Immunity-Related GTPase M (Irgm1), Parp4, Parp9, Pdia4 & Pdia6

<허브 VI. Fibrillin 단백체 허브>

Efemp2 (EGF Containing Fibulin-Like Extracellular Matrix Protein 2), Fibrillin 5 (Fbn5), Fibrillin 2 (Fbn2), Elastin (Eln), Fibrillin 1 (Fbn1)

<허브 VII. Transforming Growth Factor Beta 2 단백체 허브>

RAR Related Orphan Receptor A (Rora), Neuronal PAS Domain Protein 2 (Npas2), Serpine 1, Transforming Growth Factor Beta 2 (Tgfb2), Vascular Endothelial Growth Factor D (Figf)

<허브 VIII. Semaphorin & Vldr 수용체 단백체 허브>

Plexin D1, Semaphorin 3E, Semaphorin 3A, Neuropilin 1, Very Low Density Lipoprotein Receptor, Nerve Growth Factor (Ngf)

<TGF-β-Eupatilin Interactome의 주요 네트워크 노드>

Integrin α1, Integrin β3, Integrin β4, Protein kinase Cα, Lef1, Slug, Cadherin1 (=E-Cadherin), Adenylate cyclase 9, Spp1 (=Osteopointin), Fibrilin1, Dedicator of cytokinesis 1 (Dock1), Syk2, Notch4 등

상기와 같은 결과는 유파틸린이 TGF-β 처리로 유도되는 EMT 프로그램을 역전시키며, 이때의 메커니즘은 8개의 EMT 단백체 허브들, 즉 세포골격 단백체 허브(I), 콜라젠 단백체 허브(II), Cell cycle 단백체 허브-1(III), Cell cycle 단백체 허브-2(IV), CD44 연관 단백체 허브(V), Fibrillin 단백체 허브(VI), TGF-β2 단백체 허브(VII), 및 Semaphorin 및 Vldr 수용체 단백체 허브(VIII)의 생성과 소멸로 이루어지며 integrin α1, intergrin β3, protein kinase Cα, Snali2, Kdr, Ecadherin, adenylate cyclase 9이 중요한 노드로 네트워크가 연결된다는 것을 나타낸다.

실시예 5. 표적 유전자 분석

상기 실시예 4에서와 같은 글로벌 유전자 발현 양상 조사결과를 바탕으로, ONGHEPA1 세포에서 TGF-β 처리로 발현이 유도되고, 여기에 유파틸린을 처리하였을 경우 발현이 퇴행하는 유전자, 즉 TGF-β 처리군과 유파틸린 처리군 사이에 발현 차이가 나타나는 유전자들 중, TGF-β 처리로 발현이 크게 증가하였다가 유파틸린의 처리로 발현이 거의 이루어지지 않을 정도로 큰 변화를 나타내는 유전자들을 선별하였다.

이의 결과 다음 표 2 및 5와 같은 103개의 유전자가 선별되었다.

No.	Description (Abbreviation)	Log2fc	p-value
1	Actin, gamma2 (Actg2)	-5.83	0.00005
2	Periostin (Postn)	-4.92	0.00005
3	Collagen, type XI, alpha 1 (Col11a1)	-3.11	0.00005
4	Fibronectin 1 (Fn1)	infinite	0.0002
5	Thrombospondin, type I domain containing 7A (Thsd7a)	5.06	0.0002
6	TraB domain containing 2B (Trabd2b)	2.75	0.0003
7	Collagen type XV, alpha 1 (Col5a1)	2.26	0.00055
8	Slit homolog 3 (Slit3)	3.65	0.00065
9	Cell migration inducing protein, hyaluronan biding (Cemip)	- 2.75	0.00095
10	Inhibition beta-A (Inhba)	2.19	0.0015
11	Spectrin alpha, erythrocytic 1 (Spta1)	4.01	0.00165
12	Exocyst complex component 4 (Exoc4)	2.9	0.0019
13	A disintegrin-like and metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif 12 (Adamts12)	2.09	0.0025
14	Ephrin B2 (Efnb2)	1.92	0.0038
15	c-fos induced growth factor (Figf)	2.49	0.0044
16	Elastin (Eln)	3.28	0.00555
17	Heparan sulfate 6-O-sulfotransferase 2 (Hs6st2)	3.26	0.0056
18	Perlecan (Heparan sulfate proteoglycan2) (Hspg2	infinite	0.0057
19	Tubulin-specific chaperone d (Tbcd)	2.11	0.00595
20	Natriuretic peptide receptor 3 (Npr3)	2.82	0.00675
21	Serin (or cysteine) peptidase inhibitor, clade F, member 1 (Serpinf1)	1.99	0.00685
22	TLC domain-containing protein 2 (Tlcd2)	infinite	0.0074
23	Fras 1 related extracellular matrix protein 1 (Frem1)	2.36	0.0075
24	Caldesmon 1 (Cald1)	infinite	0.0074
25	Lysyl oxidase-like 2 (Loxl2)	1.93	0.0078
26	Tissue inhibitor of metalloproteinase 3 (Timp3)	infinite	0.00785
27	Collagen, type III, alpha 1 (Col3a1)	infinite	0.0083
28	Protein disulfide isomerase associated 6 (Pdia6)	1.85	0.00835
29	Pleiotrophin (Ptn)	2.06	0.00875
30	Prostate androgen-regulated mucin-like protein 1 (Parm1)	1.57	0.01225

No.	Description (Abbreviation)	Log2fc	p-value
31	Dihydropyrimidinase-like 3 (Dpysl3)	infinite	0.0138
32	Collagen, type XII, alpha 1 (Col12a1)	2.02	0.01435
33	Crystallin, zeta (quinone reductase)-like 1 (Cryzl1)	infinite	0.01475
34	Calumenin (Calu)	infinite	0.015
35	Follistatin-like 1 (Fstl1)	infinite	0.0156
36	Vinculin (Vcl)	infinite	0.01575
37	Cyclin D2 (Ccnd2)	2.29	0.01585
38	A disintegrin-like and metallopeptidase (reprolysin type) with thrombospondin type 1 motif 2 (Adamts2)	2.08	0.1685
39	Dysferlin (Dysf)	2.06	0.01765
40	Olfactomedin 2 (Olfm2)	1.9	0.01845
41	Ubiquitin-like modifier activating enzyme 1 (Uba1)	infinite	0.01855
42	Leprecan 1 (Lepre1)	1.75	0.01865
43	Prosaposin (Psap)	infinite	0.01875
44	Latent transforming growth factor beta binding protein 1 (Ltbp1)	3.32	0.01985
45	Spectrin beta, non-erythrocytic 1 (Sptbn1)	infinite	0.02
46	Palladin, cytoskeletal associated protein (Palld)	infinite	0.02005
47	Protein FAM 53B (Fam53b)	infinite	0.02015
48	Caveolin 1, Caveolae protein (Cav1)	1.76	0.02025
49	Nischarin (Nisch)	infinite	0.02075
50	Fibronectin type III domain containing 1 (Fndc1)	1.75	0.02105
51	Tropomyosin 1, alpha (Tpm1)	infinite	0.02145
52	Doublecortin-like kinase 1 (Dclk1)	1.54	0.023
53	Actin alpha 4 (Actn4)	infinite	0.0241
54	Colony stimulating factor 1 (macrophage) (Csf1)	2.15	0.02535
55	Tenascin C (Tnc)	5.1	0.02575
56	Intersectin 1 (SH3 domain protein 1A) (Itsn1)	infinite	0.0263
57	Transforming, acidic coiled-coil containing protein 2 (Tacc2)	infinite	0.0267
58	Pleckstrin and sec7 domain containing 3 (Psd3)	1.43	0.0275
59	C-terminal-binding protein 2 (Ctbp2)	infinite	0.0277
60	Heat shock protein 90, alpha (cytosolic), class A member 1(Hsp90aa1)	infinite	0.029

No.	Description (Abbreviation)	Log2fc	p-value
61	Septin2 (Sept2)	infinite	0.02975
62	Epidermal growth factor-containing fibulin-like extracellular matrix protein 2 (Efemp2)	1.66	0.03005
63	EH-domain containing 2 (Ehd2)	infinite	0.03025
64	Coatomer protein complex, subunit gamma 1 (Copg1)	infinite	0.03045
65	v-myc myelocytomatosis viral related oncogene, neuroblastoma derived (Mycn)	2.05	0.031
66	Lethal giant larvae homolog 1 (Ligi1)	infinite	0.0331
67	Interleukin 18 receptor accessory protein (Il18rap)	1.69	0.0332
68	Willians-Beuren syndrome chromosome reion 17 homolog (Wbscr17)	- 2.83	0.03325
69	Collagen type 1 alpha 1 (Col1a1)	- 1.64	0.0334
70	Synaptopodin (Synpo)	- infinite	0.03375
71	Integrin beta 5 (Itgb5)	- infinite	0.0342
72	Tankyrase, TRF1-interacting ankyrin-related ADP-rebose polymerase 2 (Tnks2)	- infinite	0.0349
73	Procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 3 (Plod3)	- 2.01	0.0355
74	BTAF1 RNA polymerase II, B-TFIID transcription factor-associated (Btaf1)	- infinite	0.0356
75	Dynein cytoplasmic 1 heavy chain 1 (Dync1h1)	- infinite	0.03565
76	Aurora kinase A (Aurka)	- 15.3	0.03595
77	WNK lysine deficient protein kinase 1 (Wnk1)	- infinite	0.03685
78	Collagen type VII alpha1 (Col7a1)	- 15.2	0.03715
79	Procollagen-proline, 2-oxoglutarate 4-dioxygenase (proline 4-hydroxylase), alpha 1 polypeptide (P4ha1)	- 1.81	0.0375
80	Spectrin repeat containing nuclear envelope 2 (Syne2)	- infinite	0.0376
81	Cell cycle associated protein 1 (Caprin1)	- infinite	0.0382
82	Calreticlin (Calr)	- 1.74	0.03845
83	Endoglin (Eng)	- infinite	0.03895
84	Microtubule-associated protein 4 (Map4)	- infinite	0.039
85	rho/rac guanine nucleotide exchange factor (GEF) 2 (Arhgef2)	- infinite	0.03915
86	Inositol hexakisphosphate kinase 1 (Ip6k1)	- infinite	0.03985
87	TEA Domain Transcription factor 1 (TEAD1)	- infinite	0.04005
88	Procollagen lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase 2 (Plod2)	- 1.48	0.0402
89	Family with sequence similarity 175, member B (Fam175b)	- infinite	0.0413
90	ArfGAP with SH3 domain, ankyrin repeat and PH domain 1 (Asap1)	- infinite	0.0414

No.	Description (Abbreviation)	Log2fc	p-value
91	Laminin, alpha 4 (Lama4)	- 1.29	0.04145
92	Serine (or cysteine) peptidase inhibitor, clade E, member 1 (Serpine 1)	- 1.78	0.0419
93	Importin-4 (Ipo4)	- infinite	0.04235
94	Transformation/ transcription domain-associated protein (Trrap)	- infinite	0.043
95	Surfeit 1 (SURF1)	- infinite	0.044
96	Oxysterol binding protein-like 9 (Osbpl9)	- infinite	0.0458
97	Endoplasmic reticulum-golgi intermediate compartment 1 (ERGIC1)	- 1.26	0.0465
98	Ring finger protein 145 (Rnf145)	- infinite	0.04665
99	AXL receptor tyrosine kinase (Axl)	- infinite	0.048
100	Latent transforming growth factor beta binding protein 2 (Ltbp2)	- infinite	0.04845
101	Latent transforming growth factor beta binding protein 4 (Ltbp4)	- infinite	0.0492
102	Multiple coagulation factor deficiency 2 (Mcfd2)	- 1.28	0.04935
103	Thymoma viral proto-oncogene 1 (Akt1)	- infinite	0.04985

상기 103개 유전자들의 기능 및 관련 연구결과들을 조사한 결과 대부분이 EMT에 관여하는 인자들로 조사되었으며, 특히 Follistatin-like 1(Fstl1) 유전자의 경우, 이를 낙아웃시키면 블레오마이신으로 폐섬유화를 유도하더라도 폐섬유화가 거의 이루어지지 않는다는 연구결과(Dong et al., 2015)가 있었다.

한국생명공학연구원 KCTC13086BP 20160825

Claims (4)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 크로몬 유도체 및 이의 약제학적으로 허용 가능한 염으로부터 선택된 화합물을 유효성분으로 함유하는 섬유증의 예방 및 치료용 약제학적 조성물.
   [화학식 1]
   

   

   
   상기 화학식 1에서,
   R₁은 수소, 하이드록실기, 메톡시기, 트리플루오로메틸기 또는 아세톡시기이고,
   R₂는 메틸기, 에틸기, 사이클로펜틸기, 사이클로헥실기, 페닐기 또는 벤질기이며,
   R₃는 수소, 에틸기, 아세틸기, 아세톡시기, 카르복실기, 벤조일옥시기 또는 3,4,5-트리하이드록시벤조일옥시기이고,
   R₄ 내지 R₆는 각각 독립적으로 수소, 하이드록실기, 메틸기, 메톡시기, 아세톡시기, 카르복실기 또는 벤조일옥시기이되,
   단 5,7-다이하이드록시-2-(4-하이드록시-3-메톡시페닐)-6-메톡시-크로몬 및 5,7-다이하이드록시-6-메톡시-2-페닐-크로몬은 제외한다.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 섬유증은 특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis), 골수섬유증(myelofibrosis), 간섬유증(liver fibrosis) 및 신장섬유증(kidney fibrosis)으로 이루어진 군 중에서 선택된 질환인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
3. 제 1항에 있어서,
   상기 R₁은 하이드록실기 또는 메톡시기이고,
   상기 R₂는 메틸기이며,
   상기 R₃은 수소이고,
   상기 R₅는 하이드록실기 또는 메톡시기이며,
   상기 R₄ 및 R₆은 각각 독립적으로 수소, 하이드록실기 또는 메톡시기인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
4. 제 3항에 있어서,
   상기 크로몬 유도체는
   2-(3,4-다이메톡시페닐)-5,7-다이하이드록시-6-메톡시-크로몬,
   2-(3,4-다이하이드록시페닐)-5,7-다이하이드록시-6-메톡시-크로몬,
   5,7-다이하이드록시-2-(4-하이드록시페닐)-6-메톡시-크로몬,
   5-하이드록시-2-(4-하이드록시페닐)-6,7-다이메톡시-크로몬 및
   2-(3,4-다이하이드록시페닐)-5-하이드록시-6,7-다이메톡시-크로몬 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
   

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