CN101455718B

CN101455718B - 一种黄芩总黄酮苷元提取物的制药用途

Info

Publication number: CN101455718B
Application number: CN2008102048118A
Authority: CN
Inventors: 张永煜; 刘成海; 魏世道; 谢红东; 杨珂; 陶艳艳
Original assignee: Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2008-12-30
Filing date: 2008-12-30
Publication date: 2012-05-23
Anticipated expiration: 2028-12-30
Also published as: CN101455718A

Abstract

本发明公开了一种黄芩总黄酮苷元提取物，本发明还公开了该黄芩总黄酮提取物的制备方法及其在治疗和抗肾纤维化中的作用。该黄芩总黄酮苷元提取物中总黄酮苷元含量为45-70％，主要由黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A及其他苷元组成。该提取物的制备方法是：取黄芩根，粉碎，过1号筛；加1-5倍量水搅拌均匀，在32-40℃保温酶解5-9小时，于60℃真空烘干，加2-8倍量乙酸乙酯，连续提取6-10小时，减压回收溶剂，即得总黄酮苷元提取物。该提取物对氯化汞造模导致的肾纤维化的大鼠灌胃，发现给药组与模型组相比，能明显缓解肾纤维化症状，结果提示该总黄酮苷元提取物，预防肾纤维化且具有剂量依赖关系。

Description

一种黄芩总黄酮苷元提取物的制药用途

技术领域

本发明涉及一种黄芩总黄酮苷元提取物，制备方法及应用，具体是黄芩所含主要苷元的制备，以及在抗肾纤维化中的应用，属于医药技术领域。

背景技术

肾组织细胞代谢丰富，损害后容易发生组织缺氧与氧化应激损害。而氧化应激不仅可导致组织的脂质过氧化和炎性损伤，刺激促纤维化因子表达于肾小管上皮细胞转分化，从而导致肾纤维化；并通过激活NF-κB途径，进一步加重炎症损伤与纤维化。肾纤维化是各种慢性肾脏疾病发展到慢性肾衰竭等终末期肾病的共同通路，包括肾间质纤维化与肾小球硬化。其中肾间质纤维化是多种因素损伤肾小管上皮细胞后所致的肾脏常见病理变化，其进一步发展导致肾小球毛细血管狭窄、肾小管萎缩、肾功能损害。因此，氧化应激损伤在肾纤维化病理中有重要作用，提高组织的抗氧化能力，降低氧化应激可以减轻炎症和纤维化反应。

我们既往的研究也表明在氯化汞可直接与GSH结合，减少与耗竭机体抗氧化能力，并发现该模型具有显著的肾组织脂质过氧化损伤、NF-κB信号途径活化与肌成纤维细胞活化等特点。虽然血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)制剂通过阻断RAS信号途径等显示有较好的抗肾纤维化效果，但是由于其发病机制复杂，涉及多细胞、细胞因子和介质的参与。信号分子途径之间可能相互影响，存在多条旁路途径，因而目前尚缺乏特异有效的肾纤维化治疗方法。

中药具有多成分、多靶点、多途径的作用特点，在慢性纤维化疾病的治疗中显示了一定的优势。研究发现黄酮类化合物具有抗炎、抗氧化、抗变态、抗菌抗病毒等多方面的药理作用，近期报道黄芩及黄芩提取物具有抗肝、肺纤维化的作用。而现有技术中也提到黄芩提取物的制备方法，如中国发明专利(申请号：200510043709.0)提供了黄芩苷元的制备方法，即采用酶解黄芩，再用无水乙醇来提取。该方法存在很大的弊端，由于无水乙醇的极性相对较大，一些极性较小的苷，也同时会被提取出来，而这样提取物给出的药效实验结果，很难说清是苷或者是苷元的作用。也有人报道用微生物的酶，来酶解黄芩植物内的苷，该法与利用植物体内的酶相比，代价较高，而且由于使用了微生物的酶，可能会带入微生物自身代谢产物，未来可能会给临床用药带来一定的隐患。

发明内容

本发明的目的是，针对现有技术的不足，提供一种对黄芩根进行酶解后得到的总黄酮苷元提取物；本发明的另一个目的是提供该总黄酮苷元提取物的制备方法及应用。

本发明的技术方案是：一种黄芩总黄酮苷元提取物，其中黄芩总黄酮苷元含量为45-70％，由黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A及其他苷元组成。

本发明的黄芩总黄酮苷元提取物的制备方法，是将黄芩根酶解后用乙酸乙酯提取。

本发明的黄芩总黄酮苷元提取物的制备方法，取黄芩根，粉碎，过1号筛；取粉末，加1-5倍量水搅拌均匀，在32-40℃保温酶解5-9小时，于60℃烘干，加2-8倍量乙酸乙酯，连续提取6-10小时，减压回收溶剂，真空干燥，即得总黄酮苷元提取物。

本发明的黄芩总黄酮苷元提取物的最佳制备方法为取黄芩根粉末，加3倍量水，搅拌均匀，在36℃保温酶解9小时，于60℃烘干，加5倍量乙酸乙酯，连续提取8小时，减压回收溶剂，真空干燥，即得总黄酮苷元提取物。。

黄芩总黄酮苷元实验结果：本发明的黄芩总黄酮苷元提取物，可以有效改善肾纤维化大鼠一般状况如体重、活动、饮食及精神状况，改善异常增加的肾脏体重比，减少尿蛋白，改善肾功能，明显减轻大鼠肾组织炎症，减轻肾组织基底膜与间质内胶原沉积，减少肾组织羟脯氨酸含量。表明黄芩提取物对不同病因导致的肾功能损伤均具有良好改善作用，并具有较好的抗肾间质的纤维化的作用。

本发明的优点：

1、制备方法能耗低、污染小、工艺简单、适合工业化生产；

2、制备方法中采用的有机溶剂选择时，发明人比较了多种有机溶剂，但乙酸乙酯在收率和纯度方面都是最有优势。如与现有文献报道利用不同浓度乙醇提取物相比较，本发明提取物的收率约高出现有文献报道最好收率约1.5个百分点，为13％，测定了提取物中黄芩素的最高含量为65％、总黄酮苷元的含量约为70％，高于目前我们认为可信文献报道的最好纯度。

3、实验还发现模型组大鼠肾组织SOD活性及GSH含量显著性下降，进一步证实了肾间质纤维化的氧化损伤特点，而黄芩提取物干预后肾组织SOD活性及GSH含量显著上升，提示黄芩提取物具有提高损伤肾组织的氧化能力，且呈一定的量效关系；由结果推测该抗过氧化损伤，可能是黄芩总黄酮苷元提取物的抗肾纤维化的作用机制之一。

说明书附图

图1为黄芩总苷元提取物给药组与模型组比较的不同染色方法的肾病理切片图。

具体实施方式

实施例1：

取黄芩干燥的黄芩根，粉碎，过1号筛，取粉末1000克，加1L水搅拌均匀，在32℃下保温酶解5小时，于60℃条件下真空干燥16小时，将干燥粉末置于索氏提取器中，2000ml乙酸乙酯连续提取6小时，提取液，减压回收溶剂。即得到黄芩总黄酮苷元的提取物。

该提取物的特征：提取物呈黄色，重量约65g，总黄酮苷元收率为6.5％，以黄芩素为对照品，采用紫外分光光度法，测定提取物总黄酮含量＞45％。

实施例2：

取黄芩干燥的黄芩根，粉碎，过1号筛，取粉末1000克，加3L水搅拌均匀，在32℃下保温酶解9小时，于60℃条件下真空干燥16小时，将干燥粉末置于索氏提取器中，5000ml乙酸乙酯连续提取8小时，提取液，减压回收溶剂。即得到黄芩总黄酮苷元的提取物。

该提取物的特征：提取物呈黄色，重量约115g，总黄酮苷元收率为11.5％，采用紫外分光光度法，测定提取物总黄酮苷元含量＞50％。

实施例3：

取黄芩干燥的黄芩根，粉碎，过1号筛，取粉末1000克，加5L水搅拌均匀，在32℃下保温酶解7小时，于60℃条件下烘16小时，将干燥粉末置于索氏提取器中，8000ml乙酸乙酯连续提取10小时，提取液，减压回收溶剂。即得到黄芩总黄酮苷元的提取物。

该提取物的特征：提取物呈黄色，重量约120g，总黄酮苷元收率为12.0％，采用紫外分光光度法，测定提取物总黄酮苷元含量＞60％。

实施例4：

取黄芩干燥的黄芩根，粉碎，过1号筛，取粉末1000克，加1L水搅拌均匀，在36℃下保温酶解7小时，于60℃条件下烘16小时，将干燥粉末置于索氏提取器中，2000ml乙酸乙酯连续提取6小时，提取液，减压回收溶剂。即得到黄芩总黄酮苷元的提取物。

该提取物的特征：提取物呈黄色，重量约85g，总黄酮苷元收率为8.5％，采用紫外分光光度法，测定提取物总黄酮苷元含量＞60％。

实施例5：

取黄芩干燥的黄芩根，粉碎，过1号筛，取粉末1000克，加3L水搅拌均匀，在36℃下保温酶解9小时，于60℃条件下烘16小时，将干燥粉末置于索氏提取器中，5000ml乙酸乙酯连续提取8小时，提取液，减压回收溶剂。即得到黄芩总黄酮苷元的提取物。

该提取物的特征：提取物呈黄色，重量约130g，总黄酮苷元收率为13.0％，采用紫外分光光度法，测定提取物总黄酮苷元含量＞60％。

实施例6：

取黄芩干燥的黄芩根，粉碎，过1号筛，取粉末1000克，加5L水搅拌均匀，在36℃下保温酶解7小时，于60℃条件下烘16小时，将干燥粉末置于索氏提取器中，8000ml乙酸乙酯连续提取10小时，提取液，减压回收溶剂。即得到黄芩总黄酮苷元的提取物。

该提取物的特征：提取物呈黄色，重量约105g，总黄酮苷元收率为10.5％，采用紫外分光光度法，测定提取物总黄酮苷元含量＞70％。

实施例7：

取黄芩干燥的黄芩根，粉碎，过1号筛，取粉末1000克，加1L水搅拌均匀，在40℃下保温酶解9小时，于60℃条件下烘16小时，将干燥粉末置于索氏提取器中，2000ml乙酸乙酯连续提取8小时，提取液，减压回收溶剂。即得到黄芩总黄酮苷元的提取物。

该提取物的特征：提取物呈黄色，重量约70g，总黄酮苷元收率为7.0％，采用紫外分光光度法，测定提取物总黄酮苷元含量＞63％。

实施例8：

取黄芩干燥的黄芩根，粉碎，过1号筛，取粉末1000克，加3L水搅拌均匀，在40℃下保温酶解5小时，于60℃条件下烘16小时，将干燥粉末置于索氏提取器中，8000ml乙酸乙酯连续提取6小时，提取液，减压回收溶剂。即得到黄芩总黄酮苷元的提取物。

实施例9：

取黄芩干燥的黄芩根，粉碎，过1号筛，取粉末1000克，加5L水搅拌均匀，在40℃下保温酶解5小时，于60℃条件下烘16小时，将干燥粉末置于索氏提取器中，5000ml乙酸乙酯连续提取10小时，提取液，减压回收溶剂。即得到黄芩总黄酮苷元的提取物。

该提取物的特征：提取物呈黄色，重量约110g，总黄酮苷元收率为11.0％，采用紫外分光光度法，测定其总黄酮苷元含量＞60％。

附：药理活性实验例：

实验例1：

1.1实验目的：黄芩提取物对大鼠肾显微结构的影响

1.2实验材料：

实验动物：雄性SD大鼠共33只，清洁级，体重(120-140g)，中国科学院上海实验动物中心提供，证书号：SCXK(沪)-2003-0002，饲养于上海中医药大学实验动物中心，自由饮食及饮水。

实验药物：按照上述任一实施例方法制备成供试药物。氯化汞干粉，分析纯，批号2000102，贵州铜仁化学试剂厂生产。

1.3实验方法：

动物分组：SD大鼠33只，分为正常组、模型组(10只)、黄芩提取物高剂量(8只)、黄芩提取物低剂量组(8只)。

给药方案：自氯化汞造模之日起，黄芩提取物高、低剂量组分别予10mg/kg大鼠体重及20mg/kg大鼠体重灌胃，每日一次。正常组予等量生理盐水灌胃。

肾组织病理染色：留取肾组织后，以10％中性甲醛缓冲液固定24小时，石腊包埋，切成3μm厚度切片。常规方法进行HE染色。肾组织基膜染色用六胺银染色法，即石蜡切片常规脱蜡至水，双蒸水清洗3次，0.5％高碘酸氧化20min，双蒸水清洗3次，置六胺银工作液，58℃水浴1h，双蒸水清洗2次，0.2％氯化金1min，双蒸水清洗2次，核固红染液10min，马休黄1min，无水乙醇1.5min，二甲苯1min，中性树胶封片。肾组织胶原染色用Masson三色法，即常规脱蜡至水，Masson复合染色液染3min，0.2％醋酸水溶液稍洗，浸入1％磷钼酸10min，0.2％醋酸水溶液稍洗，亮绿染色液染5min，0.2％醋酸水溶液洗2次，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.4实验结果：

结果见图一。

1.5结论

结论：通过观察，发现，黄芩混合物给药组与模型组比较，形态方面具有显著的改善，但与阴性对造组比较，显示出一定的肾小管及沉积纤维的损害，这说明氯化汞造模是成功的，且黄芩提取物具有一定的改善作用。

实验例2：

2.1实验目的：黄芩提取物对大鼠尿蛋白、血清肌酐、血清尿素氮含量的影响

2.2实验材料例：

2.3实验方法：

动物分组及给药方案：SD大鼠33只，分为正常组(7只)、模型组(10只)、黄芩提取物高剂量(8只)、黄芩提取物低剂量组(8只)。自氯化汞造模之日起，黄芩提取物高、低剂量组分别予10mg/kg大鼠体重及20mg/kg大鼠体重灌胃(相当于黄芩6g/60kg体重成人剂量的等体重5倍、10倍量)，每日一次。正常组予以等量生理盐水灌胃。

2.4实验结果：

结果见表一。

表一各组大鼠肾组织中尿蛋白、血清肌酐、学期尿素氮的含量

注：与正常组比较，^*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与20mg/kg黄芩提取物组相比▲P＜0.05。

2.5结论：

按试剂盒方法测定血清肌酐与尿素氮含量，从结果来看，从尿蛋白及血清肌酐与尿素氮含量方面来考察，给药组与模型组相比较，高剂量组与模型组比较，具有显著意义，但是低剂量组虽有差异，但是差异无统计学意义。

实验例3：

3.1实验目的：黄芩提取物对大鼠肾组织羟脯氨酸含量的影响

3.2实验材料：

3.3实验方法：

肾组织羟脯氨酸含量测定：采用Jamall氏法，即标本预处理：称取100mg湿肝置于已加入1ml蒸馏水试管中，在低温下匀浆，将匀浆液装入安剖瓶中，并用1.5ml蒸馏水冲洗，装入安剖瓶中，加2.5ml 12mol/L HCl封瓶后置烘箱， 105℃，水解18h。过滤，取水解液100μl，每个标本取2管置烘箱，40℃，干燥后取出待测。标本测定：样品管加1.2ml 50％异丙醇和0.2ml氯铵-T，室温放置10min，加入欧氏液(Ehrlich’S reagent solution，为25％(w/v)对二甲基氨基甲苯、27.3％(v/v)高氯酸的异丙醇溶液)试剂1ml，振荡混匀，温浴，50℃，90min。测定波长为558nm，蒸馏水调零。依据标准曲线计算Hyp含量。

3.4实验结果：

结果见表二。

表二各组大鼠肾组织中羟脯氨酸的含量差异

注：与正常组比较，^**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01。

3.5结论：

从羟脯氨酸含量方面来考察，发现给药组与模型组之间均既有显著统计学意义，虽然给药组与正常对照组之间有差异，但是无统计学意义。

实验例4：

4.1实验目的：黄芩提取物对大鼠肾中谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)含量的影响

4.2实验材料：

4.3实验方法：

按照试剂盒说明检测肾组织中SOD和GSH的含量，

4.4实验结果

见表三。

表三各组大鼠肾组织中GSH、SOD含量

注：与正常组比较，^**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01.

4.5结论

提取物对模型大鼠SOD活性和GSH含量的影响发现，给药组与模型组比较，显著提高，且具有统计学意义，同时考察发现虽然给药组SOD及GSH的含量少于正常组，但是均无统计学差异。

Claims

1.黄芩总黄酮苷元提取物在制备抗肾纤维化药物中的应用，其特征在于，总黄酮苷元含量为45-70％，由黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A及其他苷元组成，黄芩总黄酮苷元提取物的制备方法为：取黄芩根，粉碎，过1号筛；取粉末，加1-5倍量水搅拌均匀，在32-40℃保温酶解5-9小时，于60℃烘干，加2-8倍量乙酸乙酯，连续提取6-10小时，减压回收溶剂，即得。

2.如权利要求1所述的黄芩总黄酮苷元提取物在制备抗肾纤维化药物中的应用，其特征在于，黄芩总黄酮苷元提取物的制备方法为：加3倍量水，36℃酶解9个小时，60℃烘干，加5倍量乙酸乙酯，连续提取8个小时，减压回收溶剂，真空干燥即得。

3.如权利要求1所述的黄芩总黄酮苷元提取物在制备抗肾纤维化药物中的应用，其特征在于，所述药物为片剂、微囊、糖浆或乳剂。