CN103110695B

CN103110695B - 一种黄芩总黄酮苷元提取物的用途

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Publication number: CN103110695B
Application number: CN201310076988.5A
Authority: CN
Inventors: 张永煜; 曹慧娟; 孙淑军; 戴建业; 郑宁宁; 房军伟; 李倩华; 王洋
Original assignee: Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Shanghai University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2013-03-11
Filing date: 2013-03-11
Publication date: 2015-12-09
Anticipated expiration: 2033-03-11
Also published as: CN103110695A

Abstract

本发明公开了一种黄芩总黄酮苷元提取物的用途，所述用途是指以黄芩总黄酮苷元提取物作为活性成分之一或唯一活性成分用于制备预防或/和治疗肺癌的药物或保健食品。因实验结果表明，黄芩总黄酮苷元提取物对肺癌细胞的增殖、侵袭、转移等均有显著抑制作用，因此，以黄芩总黄酮苷元提取物作为活性成分可望开发成预防或/和治疗肺癌的药物或保健食品，尤其可望开发成预防或/和治疗非小细胞肺癌的药物或保健食品。

Description

一种黄芩总黄酮苷元提取物的用途

技术领域

本发明涉及黄芩总黄酮苷元提取物的一种新用途，具体说，是涉及黄芩总黄酮苷元提取物在制备预防或/和治疗肺癌的药物或保健食品中的应用，属于中药技术领域。

背景技术

原发性支气管肺癌简称肺癌，是指原发于各级支气管上皮的恶性肿瘤，发病与吸烟、空气污染等因素有关。肺癌是世界范围内诊断最多的癌症，每年有130万死亡病例和140万新发病例。它是全世界恶性肿瘤致死的首要疾病，也是最难治的实体瘤之一。由于其早期诊断仍缺乏有效手段，多数患者一经发现，已经处于中晚、期，所以总的5年生存率仍然很低，美国5年生存率5.5％的现状还没有发生明显改变。

黄芩是众多中药中应用最广泛的药物之一，具有清热燥湿，泻火解毒，止血安胎等功效。黄芩中包括黄芩苷、汉黄芩苷等苷类成分及黄芩素、汉黄芩素、千层纸素-A等苷元类成分。黄芩通常用以治疗炎症、高血压、心血管疾病、细菌及病毒感染。黄芩单独或与其它药物合用在体内实验具有抑制细胞生长的作用，对体外大鼠肿瘤模型也具有抑制作用。最重要的是它们对正常的上皮细胞、外周血细胞及骨髓细胞几乎没有或仅有少量的毒性。从中草药和天然植物中筛选和提取防治肿瘤的有效成分也成为治疗肿瘤的希望和新途径，是当前抗肿瘤新药研究的主要发展方向，但应用黄芩总黄酮苷元提取物预防或/和治疗肺癌的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供黄芩总黄酮苷元提取物用于制备预防或/和治疗肺癌的药物或保健食品的一种新用途，以充分发挥黄芩总黄酮苷元提取物在临床中的药用价值。

本发明所述的黄芩总黄酮苷元提取物的一种新用途，是指以黄芩总黄酮苷元提取物作为活性成分之一或唯一活性成分用于制备预防或/和治疗肺癌的药物或保健食品。

作为优选方案，是指以黄芩总黄酮苷元提取物作为活性成分之一或唯一活性成分用于制备预防或/和治疗非小细胞肺癌的药物或保健食品。

作为进一步优选方案，上述的黄芩总黄酮苷元提取物的总黄酮苷元含量≥45wt％。

作为更进一步优选方案，上述的黄芩总黄酮苷元提取物的总黄酮苷元含量为45～70wt％。

上述的药物可以是任何可药用的剂型，包括：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口服液、口含剂、颗粒剂、冲剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、混悬剂、粉剂、溶液剂、注射剂、栓剂、软膏剂、硬膏剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂等；优选口服剂型，如：胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、膏剂等。所述的口服剂型可含有常用的赋形剂，诸如粘合剂、填充剂、稀释剂、压片剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂和湿润剂，必要时可对片剂进行包衣。适宜的填充剂包括纤维素、甘露糖醇、乳糖和其它类似的填充剂；适宜的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羟基乙酸淀粉钠；适宜的润滑剂包括，例如硬脂酸镁；适宜的药物可接受的湿润剂包括十二烷基硫酸钠。

因实验结果表明，黄芩总黄酮苷元提取物对肺癌细胞的增殖、侵袭、转移等均有显著抑制作用，因此，以黄芩总黄酮苷元提取物作为活性成分可望开发成预防或/和治疗肺癌的药物或保健食品，尤其可望开发成预防或/和治疗非小细胞肺癌的药物或保健食品。

附图说明

图1体现了黄芩总黄酮苷元提取物对肺癌A549细胞的生长抑制作用；其中：a曲线为培养24小时的抑制曲线；b曲线为培养48小时的抑制曲线；c曲线为培养72小时的抑制曲线。

图2体现了黄芩总黄酮苷元提取物对肺癌A549细胞侵袭能力的影响；其中：A为对照组，B为用药浓度为1.6μg/mL的黄芩总黄酮苷元提取物组，C为用药浓度为3.2μg/mL的黄芩总黄酮苷元提取物组，D为用药浓度为6.4μg/mL的黄芩总黄酮苷元提取物组。

图3是黄芩总黄酮苷元提取物对肺癌A549细胞侵袭的抑制作用量化图；其中：A为对照组，B为用药浓度为1.6μg/mL的黄芩总黄酮苷元提取物组，C为用药浓度为3.2μg/mL的黄芩总黄酮苷元提取物组，D为用药浓度为6.4μg/mL的黄芩总黄酮苷元提取物组。

图4体现了黄芩总黄酮苷元提取物对肺癌A549细胞迁移能力的影响；其中：A为对照组，B为用药浓度为1.6μg/mL的黄芩总黄酮苷元提取物组，C为用药浓度为3.2μg/mL的黄芩总黄酮苷元提取物组，D为用药浓度为6.4μg/mL的黄芩总黄酮苷元提取物组。

图5是黄芩总黄酮苷元提取物对肺癌A549细胞迁移的抑制作用量化图；其中：A为对照组，B为用药浓度为1.6μg/mL的黄芩总黄酮苷元提取物组，C为用药浓度为3.2μg/mL的黄芩总黄酮苷元提取物组，D为用药浓度为6.4μg/mL的黄芩总黄酮苷元提取物组。

图6体现了黄酮总黄酮苷元提取物对肺癌A549细胞裸鼠移植瘤体积的影响；其中：A为对照组，B为黄芩总黄酮苷元提取物低剂量组(25mg/kg)，C为黄芩总黄酮苷元提取物高剂量组(100mg/kg)，D为顺铂组(1mg/kg)。

图7体现了黄酮总黄酮苷元提取物对肺癌A549细胞裸鼠移植瘤瘤重的影响；其中：A为对照组，B为黄芩总黄酮苷元提取物低剂量组(25mg/kg)，C为黄芩总黄酮苷元提取物高剂量组(100mg/kg)，D为顺铂组(1mg/kg)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整地说明。

本发明中所述的黄芩总黄酮苷元提取物可参照中国专利CN200810204811.8中所述制备方法制得，下述实施例中所用的黄芩总黄酮苷元提取物是参照该专利实施例1所述工艺制得，其中的总黄酮苷元含量＞45wt％。

实施例1

1.实验目的：检测黄芩总黄酮苷元提取物对人肺癌A549细胞的生长抑制作用

2.实验方法：

取对数生长期的人肺癌A549细胞经0.25％胰蛋白酶消化后，吹打成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10⁴个/mL，接种于96孔培养板中，每孔200μL，培养24h待细胞贴壁生长良好时，将原培养液轻轻吸去，实验组加入新配制的含不同浓度(6.4μg/mL、12.8μg/mL、25.6μg/mL、51.2μg/mL、102.4μg/mL)黄芩总黄酮苷元提取物的培养液，5个复孔为一组，对照孔加入与相应药物浓度组等量的DMSO，于37℃、5％CO₂饱和湿度下分别培养24h、48h、72h，每孔中加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，于37℃继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内上清液，每孔加入200μLDMSO振荡10min后比色，选择490nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值(OD)，以空白对照孔调零，记录结果，计算生长抑制率(IR)。在SPSS统计软件中计算出半数抑制浓度(IC50值)。实验重复三次。

抑制率(％)＝(1－实验孔OD值/对照孔OD值)×100％

3.实验结果

表1各实验组在作用24h后所测的细胞OD值(n＝5)

实验组	n	OD值
			6.4μg/mL试样的溶媒对照组	5	0.330±0.025
6.4μg/mL试样组	5	0.270±0.030**
			12.8μg/mL试样的溶媒对照组	5	0.321±0.020
12.8μg/mL试样组	5	0.268±0.014**
			25.6μg/mL试样的溶媒对照组	5	0.307±0.018
25.6μg/mL试样组	5	0.180±0.011**##▲▲
			51.2μg/mL试样的溶媒对照组	5	0.320±0.018
51.2μg/mL试样组	5	0.105±0.004**##▲▲■■
			102.4μg/mL试样的溶媒对照组	5	0.289±0.024
102.4μg/mL试样组	5	0.196±0.007**##▲▲★★

表2各实验组在作用48h后所测的细胞OD值(n＝5)

实验组	n	OD值
			6.4μg/mL试样的溶媒对照组	5	0.381±0.056
6.4μg/mL试样组	5	0.238±0.079*
			12.8μg/mL试样的溶媒对照组	5	0.359±0.052
12.8μg/mL试样组	5	0.233±0.032**
			25.6μg/mL试样的溶媒对照组	5	0.373±0.041
25.6μg/mL试样组	5	0.146±0.014**##▲▲
			51.2μg/mL试样的溶媒对照组	5	0.376±0.029
51.2μg/mL试样组	5	0.094±0.002**##▲▲■■
			102.4μg/mL试样的溶媒对照组	5	0.340±0.022
102.4μg/mL试样组	5	0.157±0.009**##▲▲■★

表3各实验组在作用72h后所测的细胞OD值(n＝5)

实验组	n	OD值
			6.4μg/mL试样的溶媒对照组	5	0.568±0.064
6.4μg/mL试样组	5	0.316±0.030**
			12.8μg/mL试样的溶媒对照组	5	0.557±0.037
12.8μg/mL试样组	5	0.298±0.032**
			25.6μg/mL试样的溶媒对照组	5	0.598±0.033
25.6μg/mL试样组	5	0.163±0.018**##▲▲
			51.2μg/mL试样的溶媒对照组	5	0.544±0.062
51.2μg/mL试样组	5	0.093±0.005**##▲▲■■
			102.4μg/mL试样的溶媒对照组	5	0.515±0.013
102.4μg/mL试样组	5	0.152±0.009**##▲▲★★

注：上述的试样是指黄芩总黄酮苷元提取物；

*表示试样组与相应的溶酶对照组比较*P<0.05，**P<0.01；

#表示6.4μg/mL浓度组与其它浓度组之间比较#P<0.05，##P<0.01；

▲表示12.8μg/mL浓度组与其它浓度组之间比较▲P<0.05，▲▲P<0.01；

■表示25.6μg/mL浓度组与其它浓度组之间比较■P<0.05，■■P<0.01；

★表示51.2μg/mL浓度组与其它浓度组之间比较★P<0.05，★★P<0.01。

表4各实验组对肺癌A549细胞的生长抑制率(％)

由上实验结果及图1可见：黄芩总黄酮苷元提取物在用药浓度为6.4μg/mL到51.2μg/mL之间时对人肺癌A549细胞的生长有抑制作用，在用药浓度为25.6μg/mL时对A549细胞的生长抑制效果接近半数抑制浓度(IC₅₀)，在用药浓度为51.2μg/mL时抑制作用明显增加，但在用药浓度为102.4μg/mL时反而下降。黄芩总黄酮苷元提取物作用于肺癌A549细胞24h、48h、72h的IC₅₀分别为42.3μg/mL、9.6μg/mL、6.5μg/mL。

实施例2

1.实验目的：检测黄芩总黄酮苷元提取物对人肺癌A549细胞侵袭能力的影响

2.实验方法：

采用Transwell小室法检测细胞的侵袭能力。基质胶Matrigel分装后于-20℃保存，使用前放置于4℃融化，操作时用预冷的移液枪及枪头。用无血清的DMEM培养液以1：3稀释基质胶，取30μL加入Transwell小室中，于37℃孵育30min，用无血清的培养液调整细胞浓度为2×10⁵个/mL。按照分组情况上室分别加入不含药及含药的200μL细胞悬液，下室加入含10％血清的DMEM培养液600μL，于37℃、5％CO₂条件下培养24h；在培养24h后用PBS冲洗Transwell小室，用棉签轻轻擦去上室上表面的细胞，倒置风干；用95％乙醇固定20min，风干后用0.1％结晶紫染液，将小室放入其中，使小室下表面正好与染液表面接触，染色30min；双纯水清洗小室下表面，晾干后在倒置显微镜下(×200倍)随机取5个视野，拍照计数。

每组设3个平行孔，实验重复3次。

侵袭率(％)＝(1－实验孔侵袭细胞数/对照孔侵袭细胞数)×100％

3.实验结果

表5各实验组所测的侵袭细胞数(n＝3)

实验组	细胞数
		空白对照组	61±4
用药浓度为1.6μg/mL的黄芩总黄酮苷元提取物组	40±6
		用药浓度为3.2μg/mL的黄芩总黄酮苷元提取物组	37±1
用药浓度为6.4μg/mL的黄芩总黄酮苷元提取物组	18±1*

注：*表示黄芩总黄酮苷元提取物组与空白对照组比较*P<0.05，**P<0.01；

#表示3.2μg/mL浓度组与其它浓度组之间比较#P<0.05，##P<0.01；

▲表示6.4μg/mL浓度组与其它浓度组之间比较▲P<0.05；▲▲P<0.01。

由表5及图2和图3所示结果可见：空白对照组的肺癌A549细胞穿过铺Matrigel小室滤膜的细胞数为61士4，当用6.4μg/mL的黄芩总黄酮苷元提取物处理肺癌A549细胞24h后，侵袭细胞数明显下降，为18士1，与空白对照组比较具有统计学意义(P<0.01)。

使用1.6、3.2、6.4μg/mL的黄芩总黄酮苷元提取物作用于肺癌A549细胞24h的侵袭率分别为34.9％、40.2％、71.2％。

实施例3

1.实验目的：检测黄芩总黄酮苷元提取物对人肺癌A549细胞迁移能力的影响

2.实验方法：

采用Transwell小室法检测细胞的迁移能力。无血清的培养液调整细胞密度为2×10⁵个/mL。按照分组情况上室分别加入不含药及含药的200μL细胞悬液，下室加入含10％血清的DMEM培养液600μL，于37℃、5％CO₂条件下培养24h；在培养24h后用PBS冲洗Transwell小室，用棉签轻轻擦去上室上表面的细胞，倒置风干；用95％乙醇固定20min，风干后用0.1％结晶紫染液，将小室放入其中，使小室下表面正好与染液表面接触，染色30min；双纯水清洗小室下表面，晾干后在倒置显微镜下(×200倍)随机取5个视野，拍照计数。

每组设3个平行孔，实验重复3次。

迁移率(％)＝(1－实验孔迁移细胞数/对照孔迁移细胞数)×100％

3.实验结果

表6各实验组所测的穿膜细胞数(n＝3)

实验组	细胞数
		空白对照组	61±14
用药浓度为1.6μg/mL的黄芩总黄酮苷元提取物组	29±3*
		用药浓度为3.2μg/mL的黄芩总黄酮苷元提取物组	23±2**
用药浓度为6.4μg/mL的黄芩总黄酮苷元提取物组	18±4**

注：*表示黄芩总黄酮苷元提取物组与空白对照组比较*P<0.05，**P<0.01。

由表6及图4和图5所示结果可见：空白对照组的肺癌A549细胞穿过小室滤膜的细胞数为61士14，当用1.6、3.2、6.4μg/mL的黄芩总黄酮苷元提取物处理A549细胞24h后，迁移细胞数明显下降，分别为29±3、23士2、18士4，与空白对照组比较具有统计学意义(P<0.05到P<0.01)。

使用1.6、3.2、6.4μg/mL的黄芩总黄酮苷元提取物作用于肺癌A549细胞24h的迁移率分别为34.7％、45.2％、52.8％。

实施例4

1.实验目的：体内观察黄芩总黄酮苷元提取物对人肺癌A549裸鼠异种移植肿瘤体积及抑瘤率的影响

2.实验方法

2.1接种方法

用带6号针头的1mL微量注射器抽取肺癌A549细胞悬液接种于消毒后的裸鼠右前肢背部皮下，每个部位接0.1mL(含活细胞数5×10⁶个)，继续在SPF条件下饲养，每天观察接种部位肿瘤生长情况，待接种部位出现较硬的瘤结节时，表明造模成功。

2.2实验分组及给药方法

当接种部位移植瘤生长至一定体积时进行分组及给药，将32只成瘤裸鼠按照随机数字法，随机分为4组：黄芩总黄酮苷元提取物高、低剂量组、顺铂组及溶剂对照组，每组均为8只。治疗组用灌胃法每日喂服黄芩总黄酮苷元提取物各一次，高剂量组按100mg/kg给药，低剂量组按25mg/kg给药，用0.5％CMC-Na溶解后灌胃；对照组灌服等量溶剂；各组治疗28天。顺铂组按照1mg/kg体重腹腔注射给药，连用10天。

在最后一次给药后24h以脱颈方式处死裸鼠。

2.3移植瘤体积的计算

治疗过程中观察裸鼠精神情况、进食、活动、大小便性状、移植瘤生长情况。每隔2天测量体重及测量肿瘤结节的长径(a)、短径(b)，按公式v＝1/2ab²计算肿瘤的体积。

抑瘤率(％)＝[(对照组平均瘤重一治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重)]×100％

3.实验结果

表7各实验组对肺癌A549细胞移植瘤体积的影响(0-12天)

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

表8各实验组对肺癌A549细胞移植瘤体积的影响(15-30天)

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

表9各实验组对人肺癌A549细胞移植瘤生长的抑制作用()

注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

上述实验结果计量资料以表示，应用SPSS19.0统计软件包进行统计分析，组间差异比较采用单因素方差分析，若方差不齐，对数转换后行单因素方差分析。以P<0.05为差异表示有统计学意义。

由表7至表9及图6和图7所示结果可见：黄芩总黄酮提取物高剂量组对肿瘤体积的影响在灌胃给药12天时开始显现，与对照组比较具有统计学意义(P<0.05到P<0.01)；该提取物高剂量组可以使移植瘤的瘤重减轻，与对照组比较具有统计学意义(P<0.05)，结果表明该提取物高剂量组对A549细胞裸鼠移植瘤体积及瘤重具有一定的抑制作用。

实验中对照组有一只裸鼠死亡，解剖见肿瘤化脓。

综上研究结果表明，黄芩总黄酮苷元提取物在体外对肺癌细胞的增殖、侵袭、转移及在体内对移植瘤体积及瘤重均有显著抑制作用，因此，以黄芩总黄酮苷元提取物作为活性成分可望开发成预防或/和治疗肺癌的药物或保健食品，尤其可望开发成预防或/和治疗非小细胞肺癌的药物或保健食品。

最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种黄芩总黄酮苷元提取物的用途，其特征在于：以黄芩总黄酮苷元提取物作为活性成分之一或唯一活性成分用于制备预防或/和治疗肺癌的药物或保健食品。

2.如权利要求1所述的黄芩总黄酮苷元提取物的用途，其特征在于：以黄芩总黄酮苷元提取物作为活性成分之一或唯一活性成分用于制备预防或/和治疗非小细胞肺癌的药物或保健食品。

3.如权利要求1或2所述的黄芩总黄酮苷元提取物的用途，其特征在于：所述的黄芩总黄酮苷元提取物的总黄酮苷元含量≥45wt％。

4.如权利要求3所述的黄芩总黄酮苷元提取物的用途，其特征在于：所述的黄芩总黄酮苷元提取物的总黄酮苷元含量为45～70wt％。