CN109045048B - 一种苦杏仁苷在制备膝骨关节炎抗炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种苦杏仁苷在制备膝骨关节炎抗炎药物中的应用，在炎症状态下，AMD通过抑制p38/MAPK信号通路来调控Dnmt3b表达，从而延缓软骨细胞的退变。在体验证AMD通过调控p38/MAPK/Dnmt3b信号通路来调节软骨细胞的代谢，从而延缓OA的退变。因此AMD具有很好的临床骨性关节炎治疗的应用前景。由于现有消炎镇痛药往往存在胃肠道反应、过敏反应以及肾损害等，本发明在有效剂量范围内能很好地控制副作用反应，同时并不影响其对软骨细胞抗炎能力的增强。

Description

一种苦杏仁苷在制备膝骨关节炎抗炎药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种苦杏仁苷的新用途，即苦杏仁苷在制备治疗膝骨关节炎药物中的应用，尤其是苦杏仁苷在制备软骨细胞抗炎性药物中的应用。

背景技术

关节炎是导致运动系统残障的最常见原因，而骨性关节炎(Osteoarthritis，OA)为最常见的关节炎类型。OA作为退行性关节疾病，其病理特点是关节软骨的退变，软骨下骨硬化，炎症以及骨赘的形成。其临床症状主要包括慢性疼痛，关节失稳，僵硬以及影像学上的关节间隙狭窄。OA致病因素具有多样性，主要包括肥胖、关节畸形、职业性屈曲及负重、有关节手术及外伤史和遗传因素等。目前认为关节软骨的退变是其发病的根本。由于关节软骨没有自身修复能力，目前亟待明确新的治疗靶点来减缓甚至阻止软骨退变或促进内源性再生。

OA被认为是一种慢性炎症性疾病，在其发生发展过程中，软骨、软骨下骨和滑膜均参与其炎症反应过程。在老年和糖尿病患者中，经典炎症因子如白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)以及趋化因子等能够导致全身性炎症反应的发生，这也导致滑膜细胞和软骨细胞中核转录因子-κB(Nuclear factorkappa B，NF-κB)等信号转导途径的激活。始动炎症信号也参与OA发病机制，包括损伤相关分子模式(damage associated molecuLar patterns，DAMPs)，警报素(S100A8和S100A9)和补体等。研究发现DAMPs和警报素在OA关节中丰富存在，其可通过Toll样受体(Toll-likereceptors，TLRs)或者经典NF-κB信号通路调节软骨细胞中基质金属蛋白酶(Matrixmetalloproteinases，MMPs)和含血小板凝血酶敏感蛋白结构域的解聚素与金属蛋白酶(Adisintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS)的表达。此外，通过DAMPs，细胞外基质(ExtracelluLar matrix，ECM)片段和死细胞碎片可以激活OA软骨细胞和滑膜细胞中的补体。最近的研究进一步发现，全身性炎症可通过炎症介质激活软骨细胞中NF-κB信号通路、zinc-ZIP8-MTF1轴以及自噬机制等重编程肥大分化以及分解代谢反应。此外，全基因组关联分析(Genome wide association study，GWAS)表明炎症信号通过细胞因子诱导的丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPKs)、NF-κB活化和氧化磷酸化导致OA发病。以上研究，进一步证明炎症在OA的发生发展中扮演着重要的角色。

目前在人类OA发病中的基因突变已被多次报道，如生长分化因子5(Growth/differentiation factor 5，GDF5)，母亲DPP同源物3(Mothers against decapentaplegichomolog 3，SMAD3)，然而许多研究发现在GWAS层面上很难重复此类基因与疾病全面易感性之间的联系。这可能是由于人类低外显的基因多态性所导致的。此外，有研究认为，表观遗传修饰的继承可能导致OA的易感性。表观遗传学被定义为在DNA序列不改变的情况下基因表达的可遗传性改变。表观遗传的调控中有三个主要的机制：(1)通过改变染色质结构的组蛋白转录后修饰；(2)非编码核糖核酸(Ribonucleic acid，RNA)在调控mRNA表达时转录后的作用；(3)脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid，DNA)的甲基化。DNA甲基化过程中S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)的甲基(-CH3)转移到胞嘧啶中结合鸟嘌呤的5’端(CpG位点)形成甲基化的胞嘧啶，即5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)。CpG二核苷酸的甲基化作用导致重复元件的沉默，X染色体失活，基因组印记，通过抑制转录起始调控基因的表达。目前发现有三个具有催化活性的DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases，DNMTts)的存在。DNMT1主要在细胞分化过程中维持DNA甲基化作用，而DNMT3A和DNMT3B作为从头DNA甲基转移酶(de novo DNA methyltransferases，de novo Dnmts)在发育过程中建立特殊的DNA甲基化类型。在小鼠中敲除这些酶会导致胚胎致死(Dnmt1和Dnmt3b)或出生后的损害(Dnmt3a)，证实了它们在发育过程中的重要性。目前de novo DNMT3A和DNMT3B的生物学功能未被完全阐述清楚，特别是出生后组织动态平衡中的调控作用。有研究发现DNMT3A/DNMT3B在胚胎和造血干细胞的分化过程中以及在破骨细胞生成中起着重要作用。目前在软骨相关生物学以及疾病上，有很多关于表观遗传方面，如组蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylases，HDACs)，小分子核糖核酸(MicroRNAs，miRNAs)的报道，然而，目前在软骨细胞中这些酶的蛋白表达或功能尚未见报道。

近年来，DNA甲基化修饰在OA发生发展过程中的作用研究逐步展开。研究发现在OA组织中Mmp13启动子出现CpG甲基化减少，这一定程度上可以用来解释在OA软骨细胞中发现Mmp13表达增加；诱导性一氧化氮合成酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)的表达增加中也发现NF-κB反应增强子的去甲基化。来自健康以及OA软骨细胞DNA的全基因组甲基化分析发现存在不同的甲基化位点。OA样本的分析也表明OA病人的亚组能够通过不同的甲基化类型来进一步区分。关节软骨细胞大多为有丝分裂后细胞，不需要通过DNMTs表达来维持复制所需的甲基化，因此DNMTs的表达可能参与了关节软骨细胞的从头甲基化过程。在OA病人的软骨组织中，DNA的总甲基化水平未发生变化，而特定位点的甲基化水平有所不同，由于DNMT1主要维持甲基化状态，因此我们认为在OA病人中的DNMT1水平未发生变化。另有研究发现在OA的软骨中DNMT1水平没有发生变化。因此，DNMT3A、DNMT3B可能在关节软骨的DNA甲基化过程中起重要作用。另外，哺乳动物中DNMT3B的甲基化活性也高于DNMT3A；Dnmt3a基因敲除小鼠在出生后4周时发生死亡，而Dnmt3b基因完全敲除小鼠在胚胎发育至E14.5天到E18.5天时发生胚胎致死。因此，我们认为，DNMT3B有可能在OA的发生发展过程中起着更为至关重要的作用。由此可见，表观遗传学在OA的研究中已成为重要的一部分，针对调控甲基化改变相关基因/途径等的研究能够为OA的治疗提供新的靶点。

OA属中医“骨痹”范畴，《素问·刺节论》：“病在骨，骨重不可举，骨髓酸痛，寒气至，名日骨痹”；《金匮要略·中风历节病篇》指出“历节痛，不可屈伸”，“寸口脉沉而弱，沉即主骨，弱即主筋，沉即为肾，弱即为肝”，指出了OA的病因病理和临床特点。中医认为OA病机实属“本虚标实”，肝肾亏虚为本、血脉不利为标。人至中年，肾之精气日渐亏虚，骨髓失之充养，渐致筋骨衰退。肾气亏虚，推动无力，血运之畅而未及四肢，或过之操劳，累及骨节，而致内生瘀血，痹阻经络。因此传统医学认为OA的病机主要为肾精亏虚，瘀血痹阻，治疗上多以补肾活血为主。基于现有的实验和临床研究发现，补肾活血类药物对OA的治疗作用，主要通过下调关节周围滑膜和软骨细胞中的MMPs(尤其是MMP13)和ADAMTS的表达，抑制软骨细胞外基质的降解，延缓关节软骨的退变，从而实现对OA软骨的保护和修复作用。此外，有研究表明补肾活血类药物可以调节膝关节软骨细胞中的炎症反应。然而，补肾活血中药在炎症环境中如何调控MMPs和ADAMTS5的具体机制尚需进一步研究。前期研究中项目组对补肾活血方中10种单味药的多种有效单体进行初步筛选，发现桃仁有效单体成分苦杏仁苷(Amygdalin，AMD)对软骨细胞的退变具有一定的保护作用，并能在一定程度上调节Dnmt3b的表达。为进一步明确补肾活血方有效成分AMD在OA中的具体干预机制，本发明以AMD为研究对象，从炎症及DNA甲基转移酶层面上阐明其可能干预机制：补肾活血方有效单体成分AMD通过调控炎症信号-Dnmt3b-Mmp13/Adamts5信号通路，延缓OA的发生发展。因此，本发明不仅在OA发病机制上有新的认识和突破，也为探寻补肾活血中药干预OA的机制提供新的契机和思路。

发明内容

本发明目的是提供一种苦杏仁苷的新功能，即对人体毒性小且具有软骨细胞抗炎活性的功能。本发明旨在通过增加软骨细胞的抗炎能力从而有效防治骨性关节炎，进而提供一种苦杏仁苷在制备膝骨关节炎抗炎药物中的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种苦杏仁苷在制备膝骨关节炎抗炎药物中的应用。

进一步，所述药物为软骨细胞抗炎药物。

更进一步，所述药物为提高软骨细胞DNA甲基转移酶Dnmt3b表达的药物。

本发明所述苦杏仁苷在关节软骨细胞抗炎中有效剂量为10mg/mL，在关节软骨抗炎中的剂量为0.5mg/Kg。

本发明所述苦杏仁苷(Amygdalin，AMD)化学式是C₂₀H₂₇NO₁₁，结构如下：

人正常关节软骨中DNMT3B大量表达，OA患者关节软骨中DNMT3B表达明显下降。软骨细胞中敲减Dnmt3b导致软骨细胞出现退变表型，表明Dnmt3b在一定程度上能有效维持关节软骨细胞的正常代谢与功能。中药单体AMD通过调控软骨细胞中p38/MAPK/Dnmt3b信号通路来调控Dnmt3b表达，延缓软骨细胞退变，防止关节软骨退变，从而延缓OA的进展。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：1)在炎症状态下，AMD通过抑制p38/MAPK信号通路来调控Dnmt3b表达，从而延缓软骨细胞的退变。2)在体验证AMD通过调控p38/MAPK/Dnmt3b信号通路来调节软骨细胞的代谢，从而延缓OA的退变。因此AMD具有很好的临床骨性关节炎治疗的应用前景。由于现有消炎镇痛药往往存在胃肠道反应、过敏反应以及肾损害等，本发明在有效剂量范围内能很好地控制副作用反应，同时并不影响其对软骨细胞抗炎能力的增强。

附图说明

图1人软骨细胞蛋白浓度标准曲线。

图2软骨中DNMT3B表达情况，A为健康人关节软骨(ND)与OA患者关节软骨(OA)中DNMT3B的免疫组织化学染色结果；B为健康人软骨细胞与OA患者关节软骨细胞中DNMT3BmRNA的Real-time PCR分析结果；C.炎症环境下人软骨细胞中DNMT3B蛋白的Western-Blot及分析结果(D)；E.炎症环境下人软骨细胞中DNMT3B的mRNA的Real-time PCR分析结果；F软骨退变相关基因COL2A1的mRNA的Real-time PCR分析结果，G为基质降解酶MMP13的mRNA的Real-time PCR分析结果；(Scale bars:100μm；*p<0.05vs ND/Veh)。

图3为AMD作用于小鼠原代关节软骨细胞的影响，A为小鼠原代关节软骨细胞在不同浓度的AMD作用下的细胞存活率；B为AMD作用于小鼠原代关节软骨细胞的IC₅₀曲线。

图4小鼠基因型电泳鉴定图。

图5不同MOI腺病毒侵染软骨细胞的影响，A为不同MOI重组酶腺病毒对软骨细胞的侵染结果(第一行白光镜下细胞形态图，第二行荧光镜下细胞核染色荧光图，第三行荧光镜下GFP荧光图，第四行荧光镜下细胞核GFP合成荧光图)；B为不同MOI重组酶腺病毒侵染软骨细胞后的GFP阳性细胞数；C为不同MOI重组酶腺病毒侵染软骨细胞后Dnmt3b基因敲减效率。

图6重组酶腺病毒及AMD干预软骨细胞后Dnmt3b以及软骨退变相关基因的mRNA表达水平，A为Dnmt3b基因，B为Mmp13基因，C为Admts5基因；WT表示未敲除Dnmt3b基因软骨细胞，Dnmt3b ko表示Dnmt3b基因敲除的软骨细胞。

图7AMD在炎症状态下对软骨细胞中Dnmt3b、软骨退变相关基因以及炎症因子mRNA表达的Real-time PCR分析结果；A为Dnmt3b，B为Mmp13mRNA；C为Adamts5；D为IL-1β；E为Tnf-αmRNA；F为Nlrp3；G为Cox2mRNA。

图8AMD在炎症状态下对软骨细胞中炎症相关通路的相对定量分析结果；A为各组软骨细胞的Western-Blot图，B为p65信号相对定量分析结果；C为p38信号相对定量分析结果。

图9p38抑制剂SB203580对软骨细胞的影响；A为p38/MAPK信号通路的Western-Blot图，B为p38/MAPK信号通路的相对定量分析结果；C为软骨细胞中Dnmt3b mRNA的Real-time PCR分析结果；D为软骨细胞中Mmp13mRNA的Real-time PCR分析结果；E为软骨细胞中Adamts5mRNA的Real-time PCR分析结果；F为软骨细胞中IL-1βmRNA的Real-time PCR分析结果；G为软骨细胞中Tnf-αmRNA的Real-time PCR分析结果。

图10AMD连续干预8周、12周后各组小鼠的体重情况。

图11AMD连续干预8周、12周后各组小鼠膝关节的影响，A为Micro-CT扫描结果(coronal代表冠状面、Axial代表水平面和3-D代表三维，Vlechle代表不加药，AMD代表添加AMD)，B为骨小梁相对体积，C为骨密度。

图12AMD连续干预8周、12周后各组小鼠膝关节的ABH染色及骨形态计量学分析结果，A为ABH染色扫描结果，B为各膝关节样本的软骨面积，C为各膝关节样本的OARSI评分。

图13AMD连续干预8周、12周后各组小鼠重要脏器的HE染色结果，Kidney为肾，Lung为肺，Spleen为脾，Liver为肝，Heart为心。

图14AMD连续干预8周后各组小鼠膝关节的免疫组织化学染色结果；A为Col10al，B为Dnmt3b。

图15AMD连续干预8周后各组小鼠膝关节的Phos-p38免疫荧光检测结果(A)及相对定量分析(B)。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明实施例所用苦杏仁苷：AMD(#A6005，SIGMA公司，美国)；PBS缓冲液pH7.4(Phosphate buffered saline，PBS，10×，#46-013-CM，Mediatech公司，美国)，所述超纯水是指电阻率达到18MΩ*cm(25℃)的水，本发明实施例所述百分浓度除特别说明外均为质量百分浓度。

实施例1人类骨性关节炎软骨中DNMT3B的表达特征

1、比较健康人非患病关节软骨与OA患者关节软骨中DNMT3B的表达情况

1.1实验样本：正常关节软骨组织采自截肢患者的关节软骨组织(距骨或膝关节11例)，OA患者膝关节软骨组织采自全膝关节置换术后手术置换下的退变膝关节软骨组织(57例)。

1.2实验分组

(A)非患病(Non-diseased，ND)组；(B)OA组。

1.3关节软骨组织的获取与切片的制备

各组样本用HBSS(Hank's平衡盐溶液)清洗数次后，放置于10％NBF(超纯水配制)中浸泡3日达到充分固定。固定后用去离子水冲洗6次(15分钟/次)，然后用14％EDTA水溶液脱钙处理10天，每天换液。脱钙完成后(用针头针刺时无明显阻塞感)，用1×PBS冲洗3次(15分钟/次)，去离子水冲洗3次(15分钟/次)，酒精(30％，50％，70％)逐级脱水各15分钟，然后经全自动组织脱水机处理后用石蜡包埋制备供体蜡块。使用直径为1mm的组织冲头从供体蜡块中提取标记的组织样本(深度3mm)，通过缓慢推动组织冲头柱塞，将提取的组织样本(1-4个/样本)转移到受体蜡块的相应孔，并做好标记。注意操作，以免损坏供体蜡块和组织冲头，同时确保所提取组织的均匀性。然后将受体蜡块置于载玻片上(朝下)，并在37℃温育蜡块过夜，使提取的组织样本粘附在相应的孔中。次日，取一载波片在烤箱(70℃)加热10分钟后，将其放在已粘附到受体蜡块的载波片下面，此时受体蜡块表面迅速变成液体，通过移动受体蜡块上的两个载波片，易于推开表面气泡，并平整受体蜡块表面。取出第二张载波片，将带有原始波片(载波片朝下)的受体蜡块冷却至室温后，将其放置在冰盘(无水)上放置20分钟，易于移除第一张载玻片，完成阵列蜡块的制备(含176个提取样本)。切片时，以5μm厚度切片。

1.4软骨组织的免疫组织化学分析

取阵列蜡块的切片，60℃烤片过夜。次日，取出切片，待其恢复至室温后逐级脱蜡复水(二甲苯脱蜡3次，5分钟/次；100％、95％酒精2次，5分钟/次；70％酒精1次，5分钟/次；去离子水2次，1分钟/次)；用Dako Target修复液(pH 6.0，10×，#S1699，Dako公司，美国)进行高压修复(温度107℃)，当压强至3Pa时停止修复(一般7分钟左右)，流水冲洗高压锅直至恢复室温后用1×PBS洗涤3次，5分钟/次；用PeroxAbolish过氧化氢封闭剂(50-100uL，#PXA969，Biocare medical公司，美国)淬灭内源性过氧化物酶10-15分钟，1×PBS洗涤3次，5分钟/次；用Background Punisher非特异性结合抗体封闭剂(50-100uL，#BP974，Biocaremedical公司，美国)阻断非特异性结合点10分钟，1×PBS洗涤3次，5分钟/次；滴加DNMT3B一抗(用含5％NGS和0.1％Triton X-100洗涤剂的PBS以体积比1:1000稀释)后将切片置于湿盒，4℃孵育过夜。次日，取出湿盒，自然恢复至室温后1×PBS洗涤切片3次，5分钟/次；滴加山羊抗兔IgG二抗(1×PBS以1:1000稀释)，室温孵育1小时后，1×PBS洗涤3次，5分钟/次；用S-HRP(1×PBS以1:1000稀释，链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物，#21124，Thermo FisherScientific公司，美国)室温孵育20-30分钟后，PBST洗涤3次，5分钟/次，1×PBS洗涤3-5次，5分钟/次；HRP底物试剂盒进行呈色(约5分钟)，去离子水洗涤3次终止反应；逐级脱水透明(95％酒精3次，1分钟/次；100％酒精2次，1分钟/次；二甲苯脱蜡3次，1分钟/次)，封片剂完成封片。在蔡司直立显微镜下观察并完成采片，结果见图2中A(2个平行样)。

2.比较健康人软骨细胞与OA患者关节软骨细胞中DNMT3B的表达情况

2.1实验分组

(A)健康关节软骨细胞组(ND组)；(B)OA关节软骨细胞组(OA组)。

2.2人关节软骨细胞的分离与培养

1)用HBSS清洗各组关节组织样本(样本来源同1.1)数次后用酒精纱布进行擦拭，有助于操作者分清软骨的位置。

2)将各组关节组织样本分别放置于含HBSS的10cm培养皿中，利用一次性手术刀从关节组织样本中切除软骨组织，并将其转移至含有HBSS的50mL离心管中，用HBSS洗涤三次。

3)将各组软骨组织分别放置于含5-10mL基础培养基(DMEM/F12培养基+5％FBS+2％P/S(青霉素/链霉素双抗液，#15140122，Gibco公司，美国))的10cm培养皿中，利用一次性手术刀切成碎片(约2mm×2mm×2mm)，并转移至含有消化培养基(DMEM/F12培养基+5％FBS+2％P/S+0.4％链霉蛋白酶)的磁力搅拌烧瓶中，在37℃培养箱中旋转培养90分钟，用HBSS洗涤三次后，加入含有消化培养基(DMEM/F12培养基+5％FBS+2％P/S+0.035％胶原酶P)的磁力搅拌烧瓶，在37℃培养箱中旋转培养14-16小时。

4)结束后，收集细胞消化培养基于50mL离心管中，利用70μm细胞过滤器过滤细胞，1000转/分钟离心5分钟，去上清，用10-20mL基础培养基重悬细胞，并进行计数，调整细胞浓度为100,000/cm²进行接种，置于37℃，5％CO₂恒温培养箱中连续培养12小时。

2.3 Real-time PCR分析各组软骨细胞中DNMT3B的mRNA表达情况

2.3.1关节软骨细胞mRNA的提取

1)吸出原有培养基，1×PBS清洗一次，向培养板中直接加入0.5mL Trizol，反复吹打均匀后转移至分离凝胶管中(使用前13,000rpm离心1分钟)，室温下静置5分钟。

2)在步骤1)的凝胶管中加入0.1mL的氯仿(为Trizol总体积的1/5)，上下颠倒混均15-30秒，室温下静置2-3分钟；结束后，13,000rpm 4℃离心15分钟后，小心吸取上清液，转移到另一1.5mL离心管中。

3)步骤2)上清液中加入1倍体积的70％酒精，振荡混均30秒后，将其加入到RNA抽提试剂盒提供的2mL收集管中，并根据试剂盒内操作说明进一步提纯mRNA。

2.3.2 mRNA的浓度测定与逆转录

各组样本取1.5μL mRNA，利用超微量紫外分光光度仪中进行RNA浓度测定；各组样本取500ng mRNA按照逆转录试剂盒内操作说明配制反应体系(20μL)合成cDNA，剩余mRNA保存于-80℃冰箱。

逆转录反应体系如下：mRNA 500ng、无RNA酶的水16μL、5x iscript 4μL。

逆转录程序如下：延伸引物25℃5分钟、逆转录反应46℃20分钟、逆转录酶灭活(终止反应)95℃1分钟。

2.3.3实时聚合酶链式反应(Real-time PCR)定量分析基因

取各组逆转录获得的互补脱氧核糖核酸(cDNA)，加入80μL无RNA酶的水5倍稀释后作为PCR反应模板。各组样本取500ng mRNA按照SYBR试剂盒内操作说明配制反应体系(20μL)扩增目的基因，剩余mRNA保存于-80℃冰箱。本实验选择DNMT3B为目的基因，GAPDH作为内参基因(引物序列见表1)，以目的基因拷贝数/GAPDH比值作为统计值，采用2^-ΔΔCT法分析实时荧光PCR数据，应用Real-time PCR分析DNMT3B在OA关节软骨细胞中的表达水平，结果见图2中B所示。

Real-time PCR反应体系如下：

cDNA模板2μL、上游引物(10μLM)0.5μL、下游引物(10μLM)0.5μL、Sybr greenmix10μL、无RNA酶的水7μL。

Real-time PCR反应程序如下：

最初变性95℃3分钟、变性95℃10秒、退火延伸60℃60秒(变性、退火延伸循环数40)、溶解曲线60-95℃5秒hold/1℃。

3.炎症环境下人软骨细胞中DNMT3B以及软骨退变相关基因的mRNA的表达情况

3.1实验分组

(A)对照组(Veh组)；(B)IL-1β组。

3.2人关节软骨细胞的分离和培养。

方法同实施例1实验方法2.2。

3.3药物干预

人关节软骨细胞接种至DMEM/F12培养基，在37℃，5％CO₂培养箱中连续培养24小时后，IL-1β组加入IL-1β(10ng/mL)，对照组加入等量的DPBS(Dulbecco’s磷酸盐缓冲液)，继续置于37℃，5％CO₂培养箱中连续培养48小时。

3.4 Real-time PCR分析炎症环境下人软骨细胞中DNMT3B和软骨退变相关基因的mRNA表达水平

关节软骨细胞mRNA的提取、浓度测定、逆转录和Real-time PCR定量分析基因同实验方法2.3。本实验选择DNMT3B、COL2A1、MMP13为目的基因，GAPDH作为内参基因，以目的基因拷贝数/GAPDH(引物序列见表1)比值作为统计值，采用2^-ΔΔCT法分析实时荧光PCR数据，应用Real-timePCR分析DNMT3B、COL2A1、MMP13在各组软骨细胞中的表达水平，结果见图2中E-G。

3.5 Western-Blot检测炎症环境下人软骨细胞中DNMT3B的表达情况

3.5.1关节软骨细胞总蛋白提取

1)吸去3.3培养板中的各组培养液，用预冷的1×PBS清洗1次，加入预冷的细胞裂解液(含1％蛋白酶磷酸酶抑制剂)，静置5分钟后，用细胞刮刀小心将细胞从培养板中刮下，吹打成细胞悬液后转移至1.5mL的离心管中，冰上静置30分钟，每10分钟旋涡震荡一次。

2)4℃、13,000rpm离心10分钟，小心吸出上清液至新的1.5mL的离心管中，置于冰上，即得总蛋白提取液。

3.5.2关节软骨细胞总蛋白定量

1)将待测蛋白样品、细胞裂解液(含1％蛋白酶磷酸酶抑制剂)、1×PBS各自1mL分别加入已标记的1.5mL离心管，一同置于碎冰中待用。

2)标准品供试液制备：2mg/mL的BSA标准品(10×1mL安瓿瓶(ampules)，包含2mg/mL牛血清白蛋白(BSA)，0.9％盐和0.05％叠氮化钠)依次用细胞裂解液(含1％蛋白酶磷酸酶抑制剂)稀释，获得BSA浓度为2000μg/mL、1500μg/mL、1000μg/mL、750μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、0μg/mL的蛋白标准品供试液。

3)BCA工作液制备：根据待测标准品与样品数量，按BCA蛋白浓度试剂盒(#23225，ThermoFisher Scientific公司，美国)中BCA试剂A:BCA试剂B＝50:1(v/v)的比例加入加样槽中混合均匀，即得，室温24小时稳定。

BCA工作液总体积＝(标准品数+样品数)×2复孔×200uL

4)各取10uL蛋白标准品供试液以及3.5.1制备的样品供试液分别加入96孔酶标板的标准品孔和样品孔中，每个浓度平行制备2孔。

5)各孔加入200uL BCA工作液，加盖，37℃孵育30分钟。

6)孵育结束后，使其自然恢复至室温，置于细胞成像微孔板检测系统中，在λ＝562nm处测定OD值，制作标准曲线如图1所示，得回归方程：y(OD)＝0.0005x(C)+0.0059，R²＝0.9983，即待上样蛋白样品浓度＝(OD-0.0059)/0.0005。

3.5.3关节软骨细胞总蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳

1)根据上述测得的各组蛋白浓度，配制等体积等质量的待上样蛋白样品。各组样本取30ug蛋白，并计算其体积，用细胞裂解液(含1％蛋白酶磷酸酶抑制剂)补齐至40uL，最后加入10uL5×loading buffer，终体积为50uL。同时配制等体积的蛋白Marker(8uL Maker+32uL RIPA裂解缓冲液+10uL 5×loading buffer)。

2)将各组待上样蛋白样品在金属浴100℃孵育10分钟，结束后待其恢复至室温，短暂离心，置于冰上待用。

3)取预制蛋白凝胶，小心拔出胶板的“梳子”，并撕去底部绿色封条；将胶板插入含有1×电泳缓冲液的垂直电泳槽中。

4)胶孔1中分别加入47uL蛋白Marker，其余孔中加入47uL的待上样蛋白样品。

5)加样完成后将电极插于垂直电泳槽合适位置；打开电泳仪电源，将电压调至80V，等待30分钟后，将电压调至110V，等待1.5-2.0小时，直到10kDa到达胶底部，停止电泳仪。

3.5.4关节软骨细胞总蛋白转膜

1)从垂直电泳槽中取出胶板，自来水冲洗胶板，小心移去短胶板，用胶刀切去多余胶，将胶小心地从长胶板上移到去离子水中，浸泡待用。

2)取小型PVDF转模包，将含PVDF膜的转模层放置于电极板上，小心赶气泡；将胶小心地从去离子水中转移到PVDF膜上，小心赶气泡；然后将未含PVDF膜的转模层放置于PVDF膜上，小心赶气泡。完成后盖上电极盖，将转膜板插入转膜仪中，2.5A，25V转膜7分钟。

3.5.5关节软骨细胞的蛋白免疫印迹

1)封闭：待转膜完成，将已载蛋白的PVDF膜迅速置于3-5mL封闭液(含5％BSA的1×TBST)，振摇1小时。

2)一抗孵育：封闭结束后，按稀释倍数(1:1000，v/v)将适量DNMT3B一抗加入封闭液，充分混匀，置于摇床4℃振摇过夜。

3)二抗孵育：次日，吸除一抗封闭液，加入适量1×TBST进行洗涤3次，10分钟次；加入适量封闭液，按具体稀释倍数(1:4000，v/v)稀释，将适量相应二抗加入封闭液，充分混匀，置于室温振摇1小时。

4)显影：二抗孵育结束后，吸除二抗封闭液，加入适量1×TBST进行洗涤3次，10分钟/次；小心用吸水纸吸去过多水分，迅速置于透明纸张保护套中，滴加预混的ECL显影液，使其均匀分布于待测膜，并去除多余气泡；用吸水纸略吸去过多的ECL显影液；将待测膜置于ChemiDocTMMP成像系统进行成像，并利用Image J 1.46r进行半定量分析。

5)抗体洗脱：显影结束后，将待测膜转移至含有TBST的孵育盒中，洗涤3次，5分钟/次；加入1×抗体洗脱液洗脱15分钟；然后加入TBST洗涤3次，5分钟/次。

6)封闭：待洗涤完成，将待测膜迅速置于3-5mL封闭液(含5％BSA的1×TBST)，振摇1小时。

7)内参蛋白β-actin孵育：封闭结束后，按稀释倍数(1:2000)将适量β-actin一抗加入封闭液，充分混匀，置于摇床4℃振摇过夜。其余步骤同2)-4)。

表1引物序列

2、结果

(1)健康人关节软骨与OA患者关节软骨中DNMT3B的表达情况

图2中A表明，在人类ND关节软骨组织切片中可以检测到大量DNMT3B的表达。然而，在OA患者关节软骨组织切片的表层软骨细胞中未发现DNMT3B的表达，只有在深层软骨组织中存在部分DNMT3B阳性的软骨细胞。

(2)健康人软骨细胞与OA患者关节软骨细胞中DNMT3B mRNA的表达情况

图2中B表明，在人类OA患者原代软骨细胞中DNMT3B mRNA的表达较人类ND关节原代软骨细胞明显降低，且差异有统计学意义(p<0.05)。

(3)炎症环境下人软骨细胞中DNMT3B以及软骨退变标志物COL2A1、MMP13的mRNA和DNMT3B蛋白的表达情况

图2中C-G表明，人类ND关节原代软骨细胞在炎症因子IL-1β的刺激下，使得软骨细胞中的DNMT3B蛋白表达量下降，半定量结果显示在IL-1β的刺激下，软骨细胞中DNMT3B蛋白下降为Veh组的40％，且差异有统计学意义(p<0.05)(图2中C和D)。在IL-1β的刺激下，人类ND关节原代软骨细胞中的DNMT3B mRNA表达量下降，差异有统计学意义(p<0.05)(图2中E)。此外，在IL-1β的刺激下，人软骨细胞中软骨退变标志物COL2A1表达量明显下降(图2中F)，而基质降解酶MMP13表达量上升，差异有统计学意义(p<0.05)(图2中G)。

3、结论

(1)在人类正常关节软骨细胞中DNMT3B大量存在，而在OA关节软骨细胞中DNMT3B表达明显下降。

(3)炎症因子能够促进人健康软骨细胞中DNMT3B的mRNA和蛋白表达下降，此外，炎症因子也能导致软骨细胞中COL2A1mRNA表达下降、MMP13mRNA表达上升从而发生软骨细胞退变。

实施例2苦杏仁苷通过调控Dnmt3b延缓软骨细胞退变的体外研究

1、方法

1.软骨细胞中AMD最佳药物作用浓度的筛选

1.1实验分组

(A)空白组；(B)对照组；(C)药物组。

1.2小鼠关节软骨细胞的分离与培养

1)取2周龄C57BL/6J小鼠，用CO₂处死后将其置于70％酒精中浸泡5-10分钟。

2)取出小鼠，去皮，用镊子夹取股骨头软骨层，并用剪刀剪断附着的韧带及软组织，将软骨组织置于含DPBS的1.5mL离心管中。

3)撤去吸水性垫布，擦净超净工作台，更换手套，37℃预热消化培养基(DMEM培养基+10％FBS+1％P/S+胶原酶P 0.5mg/mL)。

4)用DPBS清洗1.5mL离心管中的软骨帽4次，每次枪头吹打10次以上。

5)弃DPBS上清，加入消化培养基，倒冲出软骨组织于新的10cm Petri培养皿中，可反复多次冲洗，使消化培养基完全覆盖软骨组织。

6)轻微晃动Pet_ri培养皿，做好标记，置于37℃培养箱中消化4-6小时。

7)每隔1小时吹打软骨组织，结束后将P_et_ri培养皿中的消化培养基转移至50_mL的离心管中继续吹打(30-40次)，用40_μm细胞过滤器过滤后，400g离心5分钟。

8)用5_mL普通培养基(DMEM培养基₊10％FBS+1％P/S)重悬，计数后调整浓度为1×10⁵/mL，接种于96孔板，6个复孔/组，100μL/孔，置于37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养12小时，待其贴壁生长状态良好后继续后续实验。

1.3AMD对小鼠原代关节软骨细胞存活的影响

待细胞贴壁后，空白组(不加细胞不加AMD)、对照组(加细胞不加AMD)更换无血清培养基(DMEM培养基)，药物组加入下述终浓度AMD的无血清培养基(0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、40mg/mL、60mg/mL、100mg/mL)，分别继续培养24小时、48小时、72小时。于相应时间吸取培养液，DPBS轻洗两遍，每孔加入含MTT(2mg/mL)DMEM培养液20μL，继续培养4小时后弃去上清，加入150μL DMSO，震荡15分钟，使结晶充分溶解。以空白组调零，570nm处测定各孔平均光密度(OD值)，独立重复3次。计算软骨细胞存活率及半数抑制浓度(IC₅₀)。软骨细胞存活率(％)＝[(药物组OD值－空白组OD值)/(对照组OD值－空白组OD值)]×100％。IC₅₀用Graphpad prism软件计算获得，结果见图3中A、B。

2.建立软骨细胞Dnmt3b基因敲减模型，验证AMD通过调控Dnmt3b延缓软骨细胞的退变

2.1条件性Dnmt3b基因敲除小鼠的获得

2.1.1配种策略

Dnmt3b^fx/fx代表Dnmt3b纯合小鼠，Dnmt3b^wt/wt代表Dnmt3b野生小鼠，Dnmt3b^fx/wt代表Dnmt3b杂合小鼠。

2.1.2小鼠基因型鉴定

在小鼠5-7天时，用手术剪剪取待鉴定小鼠鼠尾约2毫米，放入无菌的八连管中待检测。

1)鼠尾DNA提取：将6.25μL组织准备液(tissue preparation solution，#T3073，SIGMA公司，美国)和25μL提取液(extraction solution，#E7526，SIGMA公司，美国)加入放置鼠尾的八连管中，混匀。将八连管放入PCR仪，进行裂解反应。

裂解反应程序：25℃5分钟、98℃10分钟、25℃～分钟。

反应结束后将八连管在常温下放置1分钟以复温，然后加入25μL中和液(neutralization solution，#N3910，SIGMA公司，美国)彻底终止反应。

2)扩增目的基因：取上述反应体系产物(小鼠DNA模板)的DNA样本取3uL加入新的反应体系，短暂离心后每管中滴加一滴矿物油以防止挥发，并将混合物放入PCR仪进行扩增。扩增结束后，取10uL的DNA样本以及5uL DNA Maker进行水平电泳，结束后用ChemiDocTMMP成像系统进行成像。其中Dnmt3b的引物序列上游为：5’-AGA GCA CTG CAC CAC TAC TGCTGGA-3’；下游为：5’-CAG GTC AGA CCT CTC TGG TGA CAA G-3’。

PCR反应体系如下：

cDNA模板3μL、上游引物(10μLM)0.125μL、下游引物(10μLM)0.125μL、REDExtract-N-Amp^TMPCR ReadyMix^TM7.5μL、无RNA酶的水4.5μL。

PCR反应程序如下：

a.95℃4分钟、b.95℃30秒、60℃40秒、72℃1分钟、72℃7分钟(30个循环)、c.4℃～分钟。

3)琼脂糖凝胶电泳鉴定结果：将上述反应体系的产物进行电泳分析。利用1×TAE缓冲液配置2％琼脂糖凝胶，加入DNA SafeStain并充分摇匀，铺胶。待琼脂糖凝胶冷却凝固后，取PCR反应产物进行上样，120-130V恒压电泳30-40分钟，于ChemiDocTM MP成像系统中观察条带，并记录结果。野生型DNA扩增产物270bp，重组DNA扩增产物为406bp，纯合子可见406bp单一条带，杂合子可见406bp、207bp两条条带，野生型可见207bp单一条带，结果见图4所示。

2.2小鼠关节软骨细胞的分离与培养

从2周龄条件性Dnmt3b基因敲除小鼠(Dnmt3b^fx/fx小鼠)的膝关节中分离关节软骨细胞。分离方法方法同实施例1实验1.1。以2.5×10⁵/mL的密度接种至含基础培养基(DMEM培养基+10％FBS+1％P/S)的组织培养板(96孔培养板以及6孔培养板)中。

2.3确定重组酶腺病毒侵染的最佳感染复数(Multiplicity of infection，MOI)

1)步骤2.2培养板中软骨细胞在37℃，5％CO₂中连续培养12小时后，弃去基础培养基，按不同的MOI值(0，10，20，50，100)加入含重组酶腺病毒(购自Vector Development Lab公司，美国)的培养基(DMEM培养基+2％FBS+0.1％Polybrene促感染试剂)。

2)转染24小时后将96孔培养板中的细胞置于显微镜下观察细胞生长状态，并计算GFP阳性细胞数量；6孔培养板中弃去含病毒的培养基，加入正常的基础培养基，继续置于37℃，5％CO₂培养箱中连续培养48小时。

3)利用Real-time PCR检测不同MOI病毒干预下各组软骨细胞中Dnmt3b的敲减效率。关节软骨细胞mRNA的提取、浓度测定、逆转录和Real-time PCR定量分析基因同实施例1中实验2.3，结果见图5所示。

2.4实验分组

(A)WT+Veh组；(B)Dnmt3b ko+Veh组；(C)WT+AMD组；(D)Dnmt3b ko+AMD组，其中WT代表实施例1步骤2.2健康关节软骨细胞，Dnmt3b ko代表2.2Dnmt3b基因敲除小鼠(Dnmt3b^fx/fx小鼠)的膝关节中分离的关节软骨细胞，Veh代表DPBS。

2.5重组酶腺病毒及药物干预

上述软骨细胞在相应MOI重组酶腺病毒(根据实施例2实验方法2.3获得)干预24小时以及正常培养48小时后，分别在C、D组中加入10mg/mL的AMD(作用浓度根据实施例2实验方法1获得)，在A、B组中加入等量的DPBS，在37℃，5％CO₂培养箱中连续培养。

2.6Real-time PCR分析各组软骨细胞中Dnmt3b和软骨退变相关基因的mRNA表达水平

上述软骨细胞在37℃，5％CO₂培养箱中连续培养3天后，利用Real-time PCR检测软骨细胞中Dnmt3b、Mmp13、Adamts5的表达水平。关节软骨细胞mRNA的提取、浓度测定、逆转录和Real-timePCR定量分析基因同实施例1实验方法2.3。本实验选择Dnmt3b、Mmp13、Adamts5为目的基因，β-actin作为内参基因，以目的基因拷贝数/β-actin(引物序列见表1)作为统计值，采用2^-ΔΔCT法分析实时荧光PCR数据，应用Real-time PCR分析Dnmt3b、Mmp13、Adamts5在各组软骨细胞中的表达水平，结果见图6所示。

2、结果

(1)AMD对小鼠关节软骨细胞存活的影响

本实验用MTT法测定不同浓度AMD对软骨细胞存活的影响。小鼠原代关节软骨细胞在不同浓度的AMD作用下细胞的存活率如图3中A所示，小鼠原代关节软骨细胞在不同浓度的AMD作用下细胞的存活率随着药物浓度的升高而降低，利用GraphPad Prism软件计算AMD对软骨细胞的半数抑制浓度(50％inhibitory concentration，IC₅₀)为31.44mg/mL。因此，在后续实验中，我们采用10mg/mL AMD进行后续研究。

(2)小鼠基因型鉴定结果

野生型DNA扩增产物270bp，重组DNA扩增产物为406bp，纯合子可见406bp单一条带，杂合子可见406bp、207bp两条条带，野生型可见207bp单一条带。图4中所示右边为DNAMarker，其200bp、500bp(最亮)位置分别在箭头指出。从左往右，72a鼠笼中小鼠编号依次为79-88号，其中79号、87号小鼠：Dnmt3b^fx/fx；81号、83号、84号、85号、86号、88号小鼠：Dnmt3b^fx/wt；80号、82号小鼠：Dnmt3b^wt/wt。根据上述方法获得足够量的Dnmt3b^fx/fx小鼠，用于后续细胞实验。

(3)软骨细胞中重组酶腺病毒侵染的MOI值

原代软骨细胞中不同MOI重组酶腺病毒作用24小时后，细胞状态基本正常。不同MOI值(0，10，20，50，100)重组酶腺病毒侵染细胞时，相应的GFP阳性细胞数量百分比分别为0±0％、24.7±2.5％、45.0±3.0％、79.7±4.5％、82.0±4.6％(图5中A、B)。通过Real-time PCR分析其对应的Dnmt3b基因敲减效率(图5中C)，发现病毒MOI50、MOI100时其Dnmt3b基因敲减效率达90％左右，差异无统计学意义(p>0.05)，因此，我们选用MOI50重组酶腺病毒侵染软骨细胞进行后续实验。

(4)AMD干预后软骨细胞中Dnmt3b、Mmp13和Adanmts5的mRNA表达水平

图6表明，Dnmt3b ko+Veh组软骨细胞在MOI50的重组酶腺病毒侵染后，Dnmt3bmRNA表达显著下降，而Adamts5、Mmp13表达量升高，与WT+Veh组相比，差异有统计学意义(p<0.05)。在WT+AMD组原代软骨细胞中，AMD连续作用3天后，Dnmt3b mRNA表达量上调，而Adamts5、Mmp13mRNA表达量较对照组下降，与WT+Veh组相比，差异有统计学意义(p<0.05)；然而，在Dnmt3b ko+AMD组的原代软骨细胞中敲减Dnmt3b基因后，AMD连续作用3天未能下降Adamts5、Mmp13mRNA表达水平，与WT+AMD组相比，差异有统计学意义(p<0.05)。

实施例3苦杏仁苷通过调控p38/MAPK/Dnmt3b信号通路防止软骨细胞退变的体外研究

目的明确AMD在炎症状态下调控软骨细胞中炎症相关通路的变化，阐明AMD防止软骨细胞退变的机制。

一、方法

1.明确AMD在炎症状态下对软骨细胞中炎症相关通路的调控作用

1.1实验分组

(A)Veh组；(B)IL-1β组；(C)AMD组；(D)IL-1β+AMD组。

1.2小鼠关节软骨细胞的分离与培养

从2周龄C57BL/6J小鼠膝关节中分离关节软骨细胞。分离方法方法同实施例2实验方法2.2。以2.5×10⁵/mL的密度接种至含基础培养基(DMEM培养基+10％FBS+1％P/S)组织培养板中。

1.3炎症因子及药物干预

软骨细胞在37℃，5％CO₂培养箱中连续培养12小时后，C、D组加入AMD(10mg/mL)预作用30分钟，A、B组加入等剂量的DPBS预作用30分钟；然后B、D组加入IL-1β(1ng/mL)，A、C组加入等剂量的DPBS，继续置于37℃，5％CO₂培养箱中连续培养30分钟、24小时。

1.4 Real-time PCR检测软骨细胞中Dnmt3b、软骨退变相关基因以及炎症因子的mRNA表达水平

在37℃，5％CO₂培养箱中连续培养24小时后，收集各组软骨细胞mRNA样本进行Real-timePCR检测。关节软骨细胞mRNA的提取、浓度测定、逆转录和Real-time PCR定量分析基因同实施例1实验方法2.3。本实验选择Dnmt3b、Mmp13、Adamts5、Il-1β、Il-6、Tnf-α、Cox2、Nlrp3为目的基因，β-actin作为内参基因(引物序列见表1)，以目的基因拷贝数/β-actin作为统计值，采用2^-ΔΔCT法分析实时荧光PCR数据，应用Real-time PCR分析Dnmt3b、Mmp13、Adamts5、Il-1β、Il-6、Tnf-α、Cox2、Nlrp3在各组软骨细胞中的表达水平，结果见图7。

1.5 Western-Blot检测软骨细胞中炎症相关通路的变化情况

在37℃，5％CO₂培养箱中连续培养30分钟后，收集各组软骨细胞总蛋白样本进行Western-Blot检测NF-κB信号通路、p38/MAPK信号通路的变化。关节软骨细胞总蛋白的提取、定量、电泳、转膜和蛋白免疫印迹同实施例1实验方法3.5，分别检测Phos-p65、p65、IkBa、Phos-p38、p38蛋白的表达水平，结果见图8。

2.验证p38/MAPK信号通路对软骨细胞中Dnmt3b、软骨退变相关基因以及炎症因子mRNA表达水平的影响

2.1实验分组

(A)Veh组；(B)IL-1β组；(C)SB203580组；(D)IL-1β+SB203580组。

2.2小鼠关节软骨细胞的分离与培养

从2周龄C57BL/6J小鼠膝关节中分离关节软骨细胞。分离方法方法同实施例2实验方法2.2。以2.5×10⁵/mL的密度接种至含基础培养基(DMEM培养基+10％FBS+1％P/S)组织培养板中。

2.3炎症因子及药物干预

软骨细胞在37℃，5％CO₂培养箱中连续培养12小时后，C、D组加入p38抑制剂SB203580(5μM，购自EMD Millipore Corporation公司，美国)预作用30分钟，A、B组加入等剂量的DPBS预作用30分钟；然后B、D组加入IL-1β(1ng/mL)，A、C组加入等剂量的DPBS，继续置于37℃，5％CO₂培养箱中连续培养24小时。

2.4 Western-Blot验证p38抑制剂对p38/MAPK信号通路的作用

关节软骨细胞总蛋白的提取、定量、电泳、转膜和蛋白免疫印迹同实施例1实验方法3.5，分别检测Phos-p38、p38蛋白的表达水平，结果见图9中A和B。

2.5 Real-time PCR检测软骨细胞中Dnmt3b、软骨退变相关基因以及炎症因子的mRNA表达水平

关节软骨细胞mRNA的提取、浓度测定、逆转录和Real-time PCR定量分析基因同第一部分实验方法2.3，本实验选择Dnmt3b、Mmp13、Adamts5、Il-1β、Tnf-α为目的基因，β-actin作为内参基因，以目的基因拷贝数/β-actin(引物序列见表1)，拷贝数表示作为统计值，采用2^-ΔΔCT法分析实时荧光PCR数据，应用Real-time PCR分析Dnmt3b、Mmp13、Adamts5、Il-1β、Tnf-α在各组软骨细胞中的表达水平，结果见图9中C、D、E、F、G。

二、结果

(一)AMD在炎症状态下对软骨细胞中Dnmt3b、软骨退变相关基因以及炎症因子mRNA表达水平的影响

图8表明，与Veh组相比，IL-1β组软骨细胞在IL-1β作用24小时后Dnmt3b mRNA表达量明显下降，而Mmp13、Adamts5mRNA表达量明显上升，而炎症相关因子(Il-1β、Il-6、Tnf-α、Cox2、Nlrp3)的mRNA表达量也显著上升，且差异均有统计学意义(p<0.05)。而IL-1β+AMD组的软骨细胞在AMD预作用30分钟，IL-1β作用24小时后，该组软骨细胞中Dnmt3b mRNA表达量较IL-1β组有所上升，Mmp13、Adamts5以及炎症相关因子(Il-1β、Il-6、Tnf-α、Cox2、Nlrp3)mRNA表达量较其有所下降，且差异有统计学意义(p<0.05)。

(二)AMD在炎症状态下对软骨细胞中炎症相关通路的影响

图9表明，与Veh组相比，IL-1β组软骨细胞在IL-1β作用30分钟后，软骨细胞中p65、p38的磷酸化水平明显升高，而IkBα的表达量明显上升，半定量结果显示Phos-p65/p65比值上升到Veh组的10.5倍，差异有统计学意义(p<0.05)，而Phos-p38/p38比值上升到Veh组的2.5倍，差异有统计学意义(p<0.05)；而IL-1β+AMD组的软骨细胞在AMD预作用30分钟，IL-1β作用30分钟后，该组软骨细胞中p38的磷酸化水平较IL-1β组有所下降，而p65的磷酸化水平未见明显变化，半定量结果显示Phos-p65/p65比值较IL-1β组无明显变化，而Phos-p38/p38比值约下降为IL-1β组的60％，差异有统计学意义(p<0.05)。

(三)p38抑制剂SB203580对软骨细胞中Dnmt3b、软骨退变相关基因以及炎症因子mRNA表达水平的影响

图9表明，与Veh组相比，IL-1β组软骨细胞在IL-1β作用24小时后，软骨细胞中p38的磷酸化水平明显升高，半定量结果显示Phos-p38/p38比值上升到Veh组的1.5倍，差异有统计学意义(p<0.05)，而IL-1β+SB203580组的软骨细胞在p38抑制剂SB203580预先作用30分钟，IL-1β作用24小时后，该组软骨细胞中p38的磷酸化水平较仅仅IL-1β组明显有所下降，半定量结果显示Phos-p38/p38比值约下降为IL-1β组的33％，差异有统计学意义(p<0.05)。与Veh组相比，IL-1β组软骨细胞在IL-1β作用24小时下，软骨细胞中Dnmt3b mRNA表达量明显下降，Mmp13、Adamts5mRNA表达量明显上升，而炎症相关因子(Il-1β、Tnf-α)的mRNA表达量也显著上升，差异有统计学意义(p<0.05)。而IL-1β+SB203580组的软骨细胞在SB203580预先作用30分钟，IL-1β作用24小时后，该组软骨细胞中Dnmt3b mRNA表达量较IL-1β组有所上升，Mmp13、Adamts5以及而炎症相关因子(Il-1β、Tnf-α)mRNA表达量较其有所下降，差异有统计学意义(p<0.05)。

三、结论

1.在炎症状态下，AMD通过调控Dnmt3b来防止软骨细胞退变。

2.在炎症状态下，AMD通过抑制p38/MAPK信号通路来调控Dnmt3b，从而延缓软骨细胞的退变。

实施例4苦杏仁苷通过调控p38/MAPK/Dnmt3b信号通路延缓OA退变的体内研究

目的体内验证AMD通过调控软骨细胞p38/MAPK/Dnmt3b信号通路延缓OA退变，进一步明确AMD防治OA的机制。

方法

1.实验分组

(A)对照组(Veh组)；(B)药物干预组(AMD组)。每组各10只。

2.建立半月板韧带损伤(Meniscus ligament injury，MLI)小鼠模型

半月板损伤小鼠模型构建方法如下：选用12周龄成年C57BL/6J小鼠，右下肢采用半月板-韧带联合损伤改良方法，切断内侧副韧带并切除内侧半月板前角，3个月后，可诱发OA。术前30分钟腹腔注射丁丙诺啡SR(1.0mg/Kg)，术前用氯胺酮/甲苯噻嗪混合液(氯胺酮，86.98mg/Kg；甲苯噻嗪，13.40mg/Kg)麻醉，手术方法如下：消毒后，小心切开皮肤，切断内侧副韧带，暴露部分关节腔并切除内侧半月板前角，生理盐水冲洗组织碎片后，缝合皮肤切口。术中注意避免损伤软骨。

3.药物干预

在MLI模型建立后一天，AMD组小鼠用中药单体成分AMD(0.5mg/Kg，PBS配制)通过腹腔每天注射对其进行连续干预8周、12周，Veh(Vlechle)组给予等剂量PBS腹腔注射。

4.指标检测

4.1一般项目观察

连续给药过程中，观察各组小鼠毛发光泽度、精神、活动状态、睡眠、饮食、二便等情况；在药物干预8周、12周后，记录其各组小鼠的体重(结果见图10)。此外，处死各组小鼠并解剖其重要脏器进行观察。

4.2 Micro-CT检测

在药物干预8周、12周后，收集各组小鼠右侧膝关节样本放置于10％NBF(中性福尔马林固定液)中浸泡3日(每个时间点各5只/组)。达到充分固定后，用去离子水冲洗6次(15分钟/次)，利用Micro-CT分析各组小鼠的膝关节显微结构改变。膝关节扫描利用高分辨率的X射线能量(10.5μm)，参数设置为55kVp，145μA和300ms。每组图片在同一条件下利用Metlab2017软件以及OsiriX软件进行3D重建，并用Metlab2017软件进行软骨下骨的形态计量学分析(结果见图11)。3D形态计量参数包括：骨小梁相对体积(Bone volume/totalvolume，BV/TV)、骨密度(Bone mineral density，BMD)。

4.3组织学与骨形态计量学分析

4.3.1小鼠组织(膝关节组织及重要器官组织)的获取与切片的制备

完成Micro-CT扫描后，取出各组小鼠右侧膝关节样本，用去离子水冲洗6次(15分钟/次)，然后用14％EDTA溶液脱钙处理10天，每天换液。脱钙完成后，用1×PBS冲洗3次(15分钟/次)，去离子水冲洗3次(15分钟/次)，酒精(30％，50％，70％)逐级脱水各15分钟，然后经全自动组织脱水机处理后用石蜡包埋制备蜡块。切片时，以5μm厚度切片，每个样本切30张。

此外，收集药物干预12周后各组小鼠的重要脏器(心、肝、脾、肺、肾)放置于10％NBF中浸泡3日。达到充分固定后，用去离子水冲洗6次(15分钟/次)，酒精(30％，50％，70％)逐级脱水各15分钟，然后经全自动组织脱水机处理后用石蜡包埋制备蜡块。切片时，以5μm厚度切片，每个样本切30张。

4.3.2 ABH/OG染色

1)取各组膝关节组织的切片(各样本1、10、20、30号切片)，60℃烤片过夜；

2)次日，取出切片，待其恢复至室温后逐级脱蜡复水(二甲苯脱蜡3次，5分钟/次；100％、95％酒精各2次，5分钟/次；70％酒精1次，5分钟/次；去离子水2次，1分钟/次)；

3)将切片放入盐酸酒精中分化30秒，在纸上短暂沥去多余水分；

4)将切片放入阿利辛蓝苏木精溶液中染45分钟后，用去离子水冲洗数次，直至水澄清(大约3次)；

5)将切片放入盐酸酒精中分化3秒后，用去离子水洗涤3次，1分钟/次；

6)将切片放入0.5％氨水中15秒后，用去离子水洗涤2次，1分钟/次；

7)将切片放入95％酒精中1分钟后，转移至Eosin/Orange G工作液中染色1分钟30秒；

8)逐级脱水透明(95％酒精3次，1分钟/次；100％酒精2次，1分钟/次；二甲苯脱蜡3次，1分钟/次)，封片剂完成封片。在蔡司正置显微镜下观察并完成采片，结果见图12中A。

4.3.3骨形态计量学检测

观察比较各组膝关节软骨的形态学变化，并进行骨组织形态计量学分析。取各组膝关节组织的切片图片(各样本1、10、20、30号切片)，通过Image J 1.46r软件对各膝关节样本的软骨面积进行测量，结果见图12中B。

4.3.4根据OA严重程度分级进行OARSI评分

取各组膝关节组织的切片图片(各样本1、10、20、30号切片)，通过国际骨关节炎研究学会(Osteoarthritis Research Society International，OARSI)制定的组织学评分系统对OA软骨损伤的严重程度进行评估(OARSI评分见表2)。由两名本项目组成员以外的人员进行定级，并取其平均，结果见图12中C。

4.3.5苏木精-伊红(Hematoxylin and Eosin，HE)染色

1)取各组小鼠心、肝、脾、肾、肺样本的切片(各样本1、10、20、30号切片)，60℃烤片2-3小时；

2)取出切片，待其恢复至室温后逐级脱蜡复水(二甲苯脱蜡2次，5分钟/次；100％酒精各2次，5分钟/次；70％酒精1次，5分钟/次；去离子水2次，1分钟/次)；

3)将切片放入1×Gill苏木精溶液中染2分钟后，用去离子水冲洗数次，直至水澄清；

4)将切片放入返蓝染色液中染30秒后，用去离子水冲洗数次，直至水澄清；

5)将切片放入70％酒精中1分钟后，转移至Eosin Y溶液中染色5分钟；

6)逐级脱水透明(70％酒精1次，1分钟；100％酒精2次，1分钟/次；二甲苯脱蜡2次，1分钟/次)，封片剂完成封片。在蔡司正置显微镜下观察并完成采片，结果见图13。

4.4免疫组织化学染色

取各组膝关节组织切片标本，60℃烤片过夜。次日，取出切片，待其恢复至室温后逐级脱蜡复水(二甲苯脱蜡3次，5分钟/次；100％、95％酒精2次，5分钟/次；70％酒精1次，5分钟/次；去离子水2次，1分钟/次)。Col10a1使用胃蛋白酶修复，方法如下：使用前胃蛋白酶修复液在37℃恒温水浴锅中预热至37℃，结束后，将切片放入胃蛋白酶修复液，在37℃恒温水浴锅中孵育10分钟后用去离子水洗涤3次，5分钟/次。Dnmt3b使用热修复，方法如下：用Dako Target修复液(pH 6.0)进行高压修复(温度107℃)，当压强至3Pa停止修复(一般7分钟左右)，流水冲洗高压锅直至恢复室温后用1×PBS洗涤3次，5分钟/次。两者完成修复后，均用PeroxAbolish(50-100uL)淬灭内源性过氧化物酶10-15分钟，1×PBS洗涤3次，5分钟/次；用Background Punisher(50-100uL)阻断非特异性结合点10分钟，1×PBS洗涤3次，5分钟/次；分别滴加Col10a1(1:200)、Dnmt3b(1:200)一抗(用含5％NGS和0.1％Triton X-100洗涤剂的PBS分别稀释)，后将切片置于湿盒，4℃孵育过夜。次日，取出湿盒，自然恢复至室温后1×PBS洗涤切片3次，5分钟/次；滴加相应的二抗(1×PBS以1:1000稀释)，室温孵育1小时后，1×PBS洗涤3次，5分钟/次；用S-HRP(1×PBS以1:1000稀释)室温孵育20-30分钟后，PBST洗涤3次，5分钟/次，1×PBS洗涤3-5次，5分钟/次；HRP底物试剂盒进行呈色(约5分钟)，去离子水洗涤3次终止反应；Hematoxylin进行核复染10秒，去离子水洗涤3次，5分钟/次(Dnmt3b不用核复染)；逐级脱水透明(95％酒精3次，1分钟/次；100％酒精2次，1分钟/次；二甲苯脱蜡3次，1分钟/次)，封片剂完成封片。在蔡司正置微镜下观察并完成采片，进行对照分析，结果见图14。

4.5免疫荧光检测

取各组膝关节组织切片标本，60℃烤片过夜。次日，取出切片，待其恢复至室温后逐级脱蜡复水(二甲苯脱蜡3次，5分钟/次；100％、95％酒精2次，5分钟/次；70％酒精1次，5分钟/次；去离子水2次，1分钟/次)；用Dako Target修复液(pH 6.0)进行高压修复(温度107℃)，当压强至3Pa停止修复(一般7分钟左右)，流水冲洗高压锅直至恢复室温后用1×PBS洗涤3次，5分钟/次；用PeroxAbolish(50-100uL)淬灭内源性过氧化物酶10-15分钟，1×PBS洗涤3次，5分钟/次；用Background Punisher(50-100uL)阻断非特异性结合点10分钟，1×PBS洗涤3次，5分钟/次；分别滴加Phos-p38一抗(用含5％NGS和0.1％Triton X-100洗涤剂的PBS以1:800稀释)后将切片置于湿盒，4℃孵育过夜。次日，取出湿盒，自然恢复至室温后1×PBS洗涤切片3次，5分钟/次；滴加山羊抗兔IgG二抗(1×PBS以1:1000稀释)，室温孵育1小时后，1×PBS洗涤3次，5分钟/次；用S-HRP(1×PBS以1:1000稀释)室温孵育20-30分钟后，PBST洗涤3次，5分钟/次，1×PBS洗涤3-5次，5分钟/次；利用酪胺信号放大TSA试剂盒进行显色(室温约5分钟，需避光)，PBS洗涤3次终止反应；带DAPI的封片剂完成封片。在蔡司荧光微镜下观察并完成采片，进行对照分析，结果见图15。

结果

(一)一般项目观察结果

连续给药8周、12周后，各组小鼠毛发光亮柔顺，精神良好，活动灵活，无激惹，饮食、饮水量正常，排便未见异常，无死亡。在药物干预8周、12周时，处死各组小鼠并解剖其重要脏器进行观察，发现与Veh组相比，AMD组小鼠的重要脏器大小质地等无明显异常表现。此外，给药前后小鼠体重变化见图10所示，同一时间点各组小鼠的体重未见明显差异。

(二)Micro-CT检测结果

Micro-CT的3D重建结果显示，造模8周、12周后Veh组膝关节周围出现明显的骨赘，而AMD组膝关节周围出现骨赘明显减少，此外，其内侧软骨下骨钙化相对较轻(图11中A)。3D形态计量学分析显示，AMD组膝关节内侧软骨下骨的BV/TV及BMD较模型组下降，且差异有统计学意义(p<0.05)(图11中B、C)。

(三)组织学与骨形态计量学分析结果

ABH/OG染色结果显示，造模8周后Veh组小鼠的关节软骨破坏，软骨层变薄，12周后其软骨破坏更加严重，而AMD组小鼠在AMD干预8周、12周后其软骨有部分破坏，但相对完整，且软骨层相对Veh组明显增加(图12中A)。此外，骨组织形态计量学分析显示，在AMD干预8周、12周后AMD组膝关节软骨面积较Veh组明显增加，且差异有统计学意义(p<0.05)(图12中B)。OARSI评分系统结果显示，AMD组小鼠在AMD干预8周、12周后膝关节软骨OARSI评分较Veh组明显减少，且差异有统计学意义(p<0.05)(图12中C)。

此外，HE染色结果显示，与Veh组相比，小鼠在AMD干预12周后心、肝、脾、肺、肾各组织未见明显病理性异常。AMD组小鼠心脏心肌纤维束排列整齐，未见萎缩、肥大、空泡变性、坏死，未见心肌纤维化，间质未见水肿、充血、出血及炎性细胞浸润(图13)；肝脏肝小叶结构清晰，肝细胞索状排列，肝细胞未见变性、坏死，未见纤维化及炎性细胞浸润(图13)；脾脏红、白髓结构清晰，脾小体分布、形态正常，脾窦未见出血(图13)；肺脏细、小支气管周淋巴细胞浸润；肺泡结构清晰，肺泡未见扩张、萎陷，肺泡壁毛细血管未见扩张、充血，肺泡间隔未见增厚，肺泡腔清晰，未见肺水肿和肺出血，肺泡内未见巨噬细胞聚集(图13)；肾脏皮、髓结构清晰，肾小球未见明显增大、萎缩、空泡化、玻璃样变，肾小管未见萎缩、肥大、增生、空泡化、凝固性坏死，肾小管管腔未见扩张，未见透明管型，间质未见炎性细胞浸润、纤维组织增生(图14)。

(四)免疫组织化学染色及免疫荧光检测结果

Col10al免疫组织化学染色结果显示，Veh组在造模8周后，Col10al阳性主要表达在软骨的表层，而AMD组小鼠在AMD干预8周后，Col10al阳性主要表达在软骨的下层既软骨肥大区域，部分表达在软骨的表层(图14中A)。Dnmt3b免疫组织化学染色结果显示，Veh组在造模8周后，软骨层的软骨细胞中Dnmt3b的阳性表达明显减弱，而AMD组小鼠在AMD干预8周后，软骨细胞中Dnmt3b的表达有所上升(图14中B)。另外，磷酸化的p38免疫荧光检测发现，Veh组在造模8周后，软骨细胞中磷酸化的p38表达量较高，而AMD组小鼠在AMD干预8周后，软骨细胞中磷酸化的p38表达有所下降，半定量结果显示AMD组关节软骨中磷酸化p38阳性细胞数百分比相对Veh组明显下降，差异有统计学意义(p<0.05)(图15中A、B)。

结论

1.AMD能够有效改善软骨及软骨下骨的退变，延缓OA的进展。

2.AMD通过调控p38/MAPK/Dnmt3b信号通路来调节软骨细胞的代谢，从而延缓OA的退变。

表2 OARSI评分细则

Claims (3)

1.一种苦杏仁苷在制备退行性膝骨性关节炎抗炎药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物为治疗软骨细胞退变的药物。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述药物为提高软骨细胞DNA甲基转移酶Dnmt3b表达的药物。

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