TWI601820B - 促進毛囊生成之醫藥組成物及其製備方法與用途 - Google Patents

Description

促進毛囊生成之醫藥組成物及其製備方法與用途

本發明係有關於一種促進毛囊生成之醫藥組成物及其製備方法與用途，尤指利用結合真皮乳突細胞及脂肪系細胞以共同形成細胞球體，用以達到促進毛囊的生成之目的。

按，造成落髮的因素涵蓋相當廣泛，包含可能是毛囊受到微、巨環境因素影響所致，而如何有效抑制落髮，甚至促進毛囊再生一直是醫界與學界所共同關注的熱門話題。而目前主流治療落髮方式包含使用藥物及植髮兩種，惟藥物治療主要功能係防止進一步落髮，非重建已失去的毛髮，而植髮係將健康毛囊移植到落髮區，若情況較嚴重的落髮就需要更多健康的毛囊來進行移植，因此如何獲取更多健康的毛囊就成為治療上的限制因素。目前科學界研究認為與誘導毛髮有關生長的細胞包含有真皮乳突細胞(dermal papilla cells,DP cells)、真皮鞘細胞(dermal sheath cells)、皮膚衍生前體細胞(skin-derived precursor cells)及間質幹細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)，其中前述真皮乳突細胞更已被報導其產生細胞聚集(aggregation)現象是促使毛囊新生關鍵(M.Ohyama et al.,2013)，且前述真皮乳突細胞經培養聚集為球狀體(spheres)後更強化誘導毛囊生成的能力(B.M.Kang et al.,2012)。

此外，研究亦發現，在毛囊周遭的脂肪組織對於促進毛囊的生長扮演著相當重要的角色(L.S.Hansen et al.,1984)。而更進一步的研究發現，利用培養脂肪幹細胞(Adipose-derived stem cell,ASC)後取得的培養液(conditioned medium,CM)來培養真皮乳突細胞，能夠顯著提高真皮乳突細胞的增殖效果，意味著脂肪幹細胞在培養期間所分泌的一些生長因子，能間接促進真皮乳突細胞的生長(Peipei Zhang et al.,2014)。惟前述研究毛囊再生的研究報導都處於研究階段，對於達到實際產業上利用仍有相當大的差距。

故，本發明之發明人有鑑於上述缺失，乃搜集相關資料，經由多方評估及考量，並以從事於此行業累積之多年經驗，利用先前獲得中華民國發明專利證號I4903375之技術內容中已揭露利用幾丁聚醣(甲殼素，Chitosan)使細胞在培養過程中自成球體狀之方法對真皮乳突細胞及脂肪系細胞進行共同培養之相關研究，經由不斷試作及修改，期許成為發展出有效促進毛囊再生的發明專利者。

爰此，本發明人有鑑於習知利用真皮乳突細胞形成細胞球去促進毛囊生成所致效率及效果不佳的缺點，因此提出一種促進毛囊生成之醫藥組成物及其製備方法與用途，藉由結合真皮乳突細胞及脂肪系細胞以共同形成細胞球體，以達提高促進毛囊生成效果之目的。

本發明提供一種促進毛囊生成之醫藥組成物的製備方法，其包括有下列步驟：步驟(a)提供一真皮乳突細胞種植(seeding)在一培養材料上，以使該真皮乳突細胞自成一球狀體；及步驟(b)提供一脂肪系細胞(adipocyte lineage cells)種植在該培養材料上，以使該脂肪系細胞包裹在該球狀體外，形成包含有至少二層不同細胞的一核殼型球體(core-shell sphere)。

本發明提供再一種促進毛囊生成之醫藥組成物的製備方法，其步驟包括提供一真皮乳突細胞及一脂肪系細胞種植在一培養材料上，以使該真皮乳突細胞及該脂肪系細胞共同形成一混合型球體(Mixed sphere)。

進一步，該脂肪系細胞係人類脂肪細胞(adipocytes)、人類脂肪幹細胞或其組合。

進一步，該培養材料係包含一基底以及一幾丁聚醣薄膜，該幾丁聚醣薄膜係將1% w/v之一幾丁聚醣溶液塗佈於該基底上而形成。

進一步，該真皮乳突細胞與該脂肪系細胞種植數量比例為2比1。

本發明提供一種促進毛囊生成之醫藥組成物，係包含使用前述促進毛囊生成之醫藥組成物的製備方法所製備出的一核殼型球體。

本發明提供一種包含有如前述之該核殼型球體在製備促進毛囊生成之藥物的用途。

本發明又提供一種促進毛囊生成之醫藥組成物，係包含使用前述促進毛囊生成之醫藥組成物的製備方法所製備出的一混合型球體。

本發明復提供一種包含有如前述之該混合型球體在製備促進毛囊生成之藥物的用途。

本發明之功效在於：

1.藉由利用真皮乳突細胞及脂肪系細胞共同培養所形成之細胞球體，不僅提高真皮乳突細胞誘導毛囊再生的效果，且藉由脂肪系細胞分泌(paracrine)相關生長因子刺激真皮乳突細胞增殖生長，以提高細胞存活率。

2.藉由體外細胞培養技術，以獲得大量所需細胞球體，可應用在大量落髮的皮膚上，促進毛囊的再生，藉此克服習知植髮方式受到無法獲取無限制健康毛囊數量之缺點。

[第一圖]係為本發明中真皮乳突細胞五種種植數量影響誘導能力結果圖。

[第二圖]係為本發明中該核殼型球體與該混合型球體結構螢光標誌示意圖。

[第三A圖]係為本發明中脂肪幹細胞及自脂肪幹細胞分化而來的脂肪細胞經油紅O染色結果示意圖。

[第三B圖]係為本發明中脂肪幹細胞及自脂肪幹細胞分化而來的脂肪細胞定性試驗結果示意圖。

[第三C圖]係為本發明中該核殼型球體或混合型球體免疫螢光染色結果示意圖。

[第四A圖]係為本發明中皮膚組織經鹼性磷酸酶染色結果示意圖。

[第四B圖]係為本發明中皮膚組織毛髮生成數量結果示意圖。

[第四C圖]係為本發明中皮膚組織經蘇木素-伊紅染色結果示意圖。

[第四D圖]係為本發明中經免疫組織化學染色結果示意圖。

為了讓本發明之促進毛囊生成之醫藥組成物及其製備方法與用途的特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合所附圖示，作詳細說明如下：本發明提供一種促進毛囊生成之醫藥組成物的製備方法，其步驟包括有：步驟(a)提供一真皮乳突細胞種植在一培養材料上，以使該真皮乳突細胞自成一球狀體；步驟(b)提供一脂肪系細胞種植在該培養材料上，以使該脂肪系細胞包裹在該球狀體外，形成包含有至少二層不同細胞的一核殼型球體。

前述「脂肪系細胞」一詞係本發明所屬技術領域中具通常知識者皆理解的，即指的是脂肪組織中所包含的兩種主要細胞：成熟的脂肪細胞以及 基質血管細胞(stromal vascular cells)，而基質血管細胞中主要為脂肪前體細胞(adipocyte precursor cells)，也就是所謂的脂肪幹細胞。在本發明實施例中是以使用人類成熟的脂肪細胞以及脂肪幹細胞作為範例說明。

本發明同時提供另一種促進毛囊生成之醫藥組成物的製備方法，其步驟包括提供一真皮乳突細胞及一脂肪系細胞種植在一培養材料上，以使該真皮乳突細胞及該脂肪系細胞共同形成一混合型球體。

較佳的是，該脂肪系細胞係人類脂肪細胞、人類脂肪幹細胞或其組合。

較佳的是，該培養材料係包含一基底以及一幾丁聚醣薄膜，該幾丁聚醣薄膜係將1% w/v之一幾丁聚醣溶液塗佈於該基底上而形成。在本發明實施例中，該基底係使市面上周知的組織培養盤(tissue culture plate,TCPS)，也就是細胞培養皿，當然在培養皿中會添加細胞培養所需的培養液(culture medium)來進行培養。

較佳的是，該真皮乳突細胞與該脂肪系細胞種植數量比例為2比1。

本發明提供再一種促進毛囊生成之醫藥組成物，係包含使用前述促進毛囊生成之醫藥組成物的製備方法所製備出的該核殼型球體或該混合型球體。

本發明復提供一種包含有如前述之該混合型球體或該混合型球體在製備促進毛囊生成之藥物的用途。

本發明也是一種促進毛囊生成之醫藥組成物，包含：一真皮乳突細胞，呈球狀體；一脂肪系細胞，包裹在該球狀體外。其中該脂肪系細胞係人類脂肪細胞、人類脂肪幹細胞或其組合。該真皮乳突細胞與該脂肪系細胞的數量比例為2比1。

本發明也是一種促進毛囊生成之醫藥組成物，包含：一真皮乳突細胞；一脂肪系細胞；該真皮乳突細胞及該脂肪系細胞共同形成一混合型球體。其中該脂肪系細胞係人類脂肪細胞、人類脂肪幹細胞或其組合。該真皮乳突細胞與該脂肪系細胞的數量比例為2比1。

以下係藉由具體實施例說明本發明之實施方式，熟習此技藝之人士可由本說明書所揭示之內容輕易地了解本發明之其他優點與功效。此外，本發明亦可藉由其他不同具體實施例加以施行或應用，在不悖離本發明之精神下進行各種修飾與變更。

以下實施例之數據皆係將每一時間點及每一樣品之三重複實驗數據平均後，正負其標準差而獲得，所有的值皆係藉由單變量變異數分析(one-way ANOVA)而分析，且p值小於0.05表為有意義之數據。

實施例1-細胞之分離及體外培養

本試驗所用之人類脂肪系細胞係經成大醫院內部審查委員會(Internal Review Board,IRB)認可同意，取自自願病患，將經由抽脂手術獲得的脂肪組織進行更進一步的分離、培養，以獲取實驗所需的人類脂肪幹細胞，並細胞培養於含有10%胎牛血清(FBS)及1%盤尼西林/鏈黴素之DMEM(Dulbecco,s modified Eagle,s medium,Invitrogen Inc.,Carlsbad,CA)培養液中，且於37℃及5%二氧化碳條件下培養，以利接下來的實驗使用。在此所使用之人類脂肪幹細胞皆為10次繼代以內之幹細胞，仍保持良好的分化能力。本次試驗有關細胞分離、培養的詳細流程方法係依照本案發明人實驗室先前已建立的技術方法(Y.Y.Hsueh et al.,2012,2014)來進行，且為本發明所屬技術領域中具通常知識者所能理解，而因非本案重點，故不在此詳述。

此外，我們亦將所獲得的人類脂肪幹細胞培養在可誘導分化成脂肪細胞的培養液中進行培養，以獲得成熟的脂肪細胞，目的在於比較脂肪幹細 胞或脂肪細胞與真皮乳突細胞共同培養所形成的細胞球體對於誘導毛囊再生能力的比較。當然，本試驗所用可誘導分化成脂肪細胞的培養液主要是加入以下藥品：0.5mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(isobutylmethylxanthine,IBMX；Sigma)、1M地塞米松(dexamethasone；Sigma)、10g/ml胰島素(insulin；Sigma)以及1M吲哚美辛(indomethacin；Sigma)等進行誘導分化，此方法已然是所屬技術領域中具通常知識者皆理解的技術背景，詳細流程在此便不再詳述。

本試驗所用動物細胞之取得皆經過成功大學動物中心的動物照顧及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee,IACUC)審核批准，其中真皮乳突細胞係取自週齡6至8週的大鼠(SD rats)的觸鬚毛囊組織，取下的毛囊組織放置在濃度2.5mg/ml的第一型膠原蛋白酶容液中，在37℃下進行消化處理3小時，然後以800r.p.m轉速離心10分鐘以獲得細胞沉澱團塊，移除上清液，再利用DMEM培養液將細胞沉澱團塊緩慢沖散，然後在顯微鏡下觀察挑選出真皮乳突細胞群集(clusters)，並將其轉移至另一培養燒瓶中以含有20%胎牛血清(FBS；Hyclone)和1%青黴素/鏈黴素(P/S；Invitrogen)的DMEM中進行培養5天，在真皮乳突細胞群集有向外擴增時，即可先以磷酸鹽緩衝溶液(PBS)清洗過一次後，再以0.5%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(Trypsin-EDTA,Invitrogen)溶液於37℃作用適當時間後分離出真皮乳突細胞進行繼代，並以含有10%胎牛血清和1%青黴素/鏈黴素的DMEM進行培養，此後的繼代培養方式皆為如此。雖然本發明試驗中因取得較容易的關係，以來自大鼠的真皮乳突細胞作為範例說明，但不以此限定，依照本發明之精神，可以使用來自人體的真皮乳突細胞進行相同試驗，獲得相同效果。

此外，我們也自出生後一天的新生小鼠(C57BL/6)皮膚分離取得角質細胞(keratinocytes,KCs)，其方法流程為取得小鼠皮膚後剪小塊置入含有0.5%中性蛋白酶(dispase,Invitrogen)的漢克平衡鹽緩衝溶液(Hank's Balanced Salt Solution,HBSS；Invitrogen)中，於4℃搖晃過夜進行消化，將表皮自真皮層分離，再把表皮取出以HBSS沖洗過並剪碎加入0.1%胰蛋白酶溶液，於37℃下進行20分鐘消化，於加入DMEM終止消化反應後，將整體溶液通過70微米孔徑的細胞過濾器(cell strainer,BD,USA)進行過濾，再將濾液以1200r.p.m轉速5分鐘離心以取得沉澱的角質細胞做為後續建立體內毛囊生成實驗使用。因為角質細胞是毛髮再生所必要的成分之一，會與真皮乳突細胞交互作用後誘導毛髮再生，因此在建立動物體內毛囊再生試驗時就需要使用到角質細胞(A.Osada,et al.,2007)。

實施例2-製備幾丁聚醣培養基以及形成細胞球體

本實驗係利用塗佈有一層幾丁聚醣的組織培養皿來培養細胞，使原本貼附組織培養皿生長的細胞因而無法貼附，即產生細胞相互群聚成球體狀懸浮在培養液中生長的現象。製備方法係使用1% w/v的幾丁聚醣粉末(85%去乙醯化度；Sigma-Aldrich)溶解在1體積莫爾濃度(M)的醋酸中，攪拌24小時後，再過濾兩次去除雜質，形成幾丁聚醣塗佈溶液，再取10毫升塗佈於10cm組織培養皿或200微升(μl)塗佈於96孔盤培養皿每一孔內，於70℃下烘乾24小時，最後形成幾丁聚醣薄膜，接下來，利用1當量濃度(N)之氫氧化鈉(NaOH)溶液中和幾丁聚醣薄膜之酸鹼值，再以蒸餾水清洗後，曝露於紫外燈下12小時殺菌，以得到本實施例之幾丁聚醣培養基。要使培養的細胞形成球體，可種植適當密度的細胞數量在含有培養液的幾丁聚醣培養基中，同時放置在具搖晃功能的細胞培養箱中，以130r.p.m轉速、37℃下搖晃培養3天，就可獲得聚集的細胞球體。

實施例3-細胞球體培養條件測試

3.1本試驗探討前述真皮乳突細胞及脂肪系細胞進行共同培養時，較佳的細胞種植數量。首先探討於96孔盤培養真皮乳突細胞以不同種植數量形成細胞球體後，對於有關誘導毛囊生成相關蛋白(例如HEY1及versican)表 現的影響。本試驗各以0.5×10⁴、1×10⁴、2×10⁴、5×10⁴及1×10⁵個細胞種植在前述幾丁聚醣培養基上，並加入含有10%胎牛血清和1%青黴素/鏈黴素的DMEM進行前述搖晃培養3天，然後收獲各條件下形成的細胞球體，進行免疫螢光染色來比較HEY1(1：250,Thermo)、versican(VCAN；1：100；Santa Cruz)及vimentin(VIM；1：250,Abcam)等標誌蛋白的表現量。此處所用免疫螢光染色技術係本發明所屬技術領域中具通常知識者皆能理解常見的標誌蛋白表現分析方法，能藉由倒立顯微鏡或多光共軛焦顯微鏡搭配螢光分析軟體來進行定量比較，惟因非本案重點，故詳細流程不在贅述。

3.2實驗結果

請參閱第一圖所示，是本試驗的結果示意圖。橫軸表示5種細胞種植數量，縱軸表示上述各標誌蛋白的相對表現量，由結果可以發現當真皮乳突細胞種植數量在5×10⁴及1×10⁵個/孔時，標誌蛋白HEY1及versican有相對較高的表現量，也就是說，以5×10⁴至1×10⁵個範圍內的細胞數量進行種植所獲得的細胞球團能表現較佳的促毛囊生成的能力。最佳的是，真皮乳突細胞的種植數量為5×10⁴個細胞數。此外，前述脂肪系細胞的種植數量為2.5×10⁴個/孔時，與真皮乳突細胞共同培養有較佳效果。因此，較佳的是，前述真皮乳突細胞與脂肪系細胞的種植數量為2比1。另vimentin是一種間質細胞標誌蛋白(mesenchymal marker)，只是用來表示種植細胞數的多寡並不影響其蛋白質的表現，做為對照參考。

實施例4-真皮乳突細胞與脂肪幹細胞共同培養形成細胞球體

4.1形成核殼型球體

本試驗提供一種將真皮乳突細胞與人類脂肪幹細胞共同培養形成核殼型球體的方法，係一種連續種植(sequential seeding)細胞的技術，其步驟為：先將5×10⁴個真皮乳突細胞種植在前述96孔幾丁聚醣培養基上，加入含有10 %胎牛血清和1%青黴素/鏈黴素的DMEM進行培養48小時，以形成核殼型球體的核心部分，接著再加入2.5×10⁴個人類脂肪幹細胞進行共同培養，使脂肪幹細胞聚集包覆在由真皮乳突細胞形成的球體外周圍，從而形成至少包含有核心與核殼二層的核殼型球體。依照本發明的精神，不以此二層結構之細胞球體之範例為限，而是可以依照需求連續加入不同細胞進行共同培養以形成多層結構的細胞球體。

4.2形成混合型球體

本試驗提供一種將真皮乳突細胞與人類脂肪幹細胞共同培養形成核殼型球體的方法，係先將5×10⁴個真皮乳突細胞與2.5×10⁴個人類脂肪幹細胞充分混合後，再種植在前述96孔幾丁聚醣培養基上，加入含有10%胎牛血清和1%青黴素/鏈黴素的DMEM進行培養3天，以形成混合型球體。

4.3核殼型球體與混合型球體結構確認

本試驗係利用螢光免疫染色方法來對核殼型球體與混合型球體結構進行確認。在前述脂肪幹細胞種植前，已先利用DiI(紅色螢光細胞染劑；Invitrogen)處理30分鐘進行標誌，目的在使DiI結合上脂肪幹細胞之細胞膜上，作為追蹤使用。另再利用真皮乳突細胞具誘導毛囊生成相關標誌蛋白HEY1及versican(VCAN)的抗體去標誌出其表現情形(綠色螢光)，然後經由共軛焦顯微鏡(spinning disc confocal microscopy,DSU IX81,Olympus或multi-photon confocal microscope,FV1000MPE,Olympus)搭配螢光分析軟體(ImageJ software)分析結果。

請參閱第二圖所示，係本發明中核殼型球體與混合型球體結構螢光標誌示意圖，尺標為100微米(μm)。由圖中結果可發現混合型球體中的確出現有被標誌綠色螢光(VCAN、HEY1)的真皮乳突細胞以及被標誌紅色螢光(DiI)的脂肪幹細胞，且兩種細胞在球體空間中是均勻分布的。另在核殼型球體中也 確實出現有被標誌綠色螢光(VCAN、HEY1)的真皮乳突細胞以及被標誌紅色螢光(DiI)的脂肪幹細胞，且確實為以真皮乳突細胞為核心，脂肪幹細胞為外殼的二層核殼結構。經由上述結果證實本發明所提供的細胞球體製備方法是可行的。

實施例5-脂肪幹細胞及自脂肪幹細胞分化而來的脂肪細胞分別與真皮乳突細胞共同培養形成細胞球體之比較

5.1脂肪幹細胞誘導分化為脂肪細胞

本試驗如前述實施例1所述，將獲得的脂肪幹細胞誘導分化為脂肪細胞。請參閱第三A圖所示，係脂肪幹細胞及自脂肪幹細胞分化而來的脂肪細胞在顯微鏡下細胞型態以及進行油紅O(Oil-Red O)染色的結果。由結果可知，僅有自脂肪幹細胞分化而來的脂肪細胞因產生油滴而被染成紅色，可證實其已是成熟的脂肪細胞。再請參閱第三B圖所示，係利用反轉錄聚合酶鏈鎖反應(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)技術針對具幹細胞標誌基因(stem cell markers)例如CD34、SCA1，以及脂肪細胞特別表現的標誌基因例如過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)、脂聯素(adiponectin)等進行基因表現分析。RT-PCR的技術已是相當常見的基因表現分析方法，在此不再詳述，有關RT-PCR的詳細方法流程可參考本案發明人先前建立的技術資料(Y.Y.Hsueh et al.,2012)。實驗結果如序列表顯示，脂肪幹細胞仍保有CD34、SCA1基因的表現，相較下，脂肪細胞已不再表現CD34、SCA1，代表脂肪細胞已不具有幹細胞的特性了，圖中GAPDH係作為控制組基因。另外，可以觀察到脂肪細胞有大量表現PPARγ、adiponectin，也就更證實本試驗確實已將脂肪幹細胞誘導分化成為脂肪細胞。

5.2脂肪幹細胞及自脂肪幹細胞分化而來的脂肪細胞分別與真皮乳突細胞共同培養形成細胞球體對versican(VCAN)表現的影響

本試驗欲探討利用脂肪細胞替代脂肪幹細胞與真皮乳突細胞共同培養形成細胞球體後，對於真皮乳突細胞表現VCAN標誌蛋白的情形比較。本試驗使用脂肪細胞與真皮乳突細胞共同培養形成細胞球體之方法與前述利用脂肪幹細胞與真皮乳突細胞共同培養形成細胞球體之方法相同，同樣形成核殼型球體以及混合型球體，細節便不再贅述。同樣的，脂肪幹細胞與脂肪細胞在種植前先以DiI處理30分鐘進行標誌，以利追蹤。然後再針對形成細胞球體後的真皮乳突細胞進行VCAN蛋白(標誌綠色螢光)的螢光免疫染色，並在前述共軛焦顯微鏡下進行觀察。從第三C圖中可觀察到，利用脂肪細胞與真皮乳突細胞共同培養形成的核殼型球體或混合型球體，皆有表現出VCAN蛋白，惟表現量明顯較脂肪幹細胞與真皮乳突細胞共同培養形成核殼型球體或混合型球體來得弱，表示以脂肪幹細胞與真皮乳突細胞共同培養形成細胞球體為較佳的模式。當然，依照本發明之精神，亦可以組合脂肪幹細胞及脂肪細胞的方式進一步與真皮乳突細胞共同培養形成細胞球體的方式來達成。

實施例6-皮下培養法(Patch assay)

本試驗係將5組不同的細胞組合型態例如：1.真皮乳突細胞；2.真皮乳突細胞球體；3.真皮乳突細胞球體+脂肪幹細胞；4.混合型球體；5.核殼型球體，同時每一組會在加入2.5×10⁶個角質細胞，利用注射的方式注射到公裸鼠(male athymic nude mice)的皮下，藉由裸鼠體內的環境提供細胞存活，並於四週後手術切下注射區域的全厚皮膚組織(full thickness skin)，進行鹼性磷酸酶染色(Alkaline phosphatase staining)、蘇木素-伊紅染色[hematoxylin and eosin(H&E)stain]以及免疫組織化學染色(immunohistochemistry；IHC)等檢測方法，以比較上述各組毛囊生成的情形。而上述鹼性磷酸酶染色、蘇木素-伊紅染色以及免疫組織化學染色等技術皆為本發明所屬技術領域中具通常知識者所能理解的常見染色分析方法，在此就不再詳述其方法流程。

6.1鹼性磷酸酶染色

鹼性磷酸酶是目前被用來檢測真皮乳頭細胞誘導毛囊生成能力的常用指標，而本試驗係使用市面上販售的試劑套組(FAST BCIP/NBT(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate/nitro blue tetrazolium；Sigma)來進行檢測，操作方法也依循使用手冊所教導之方式進行，因非本案發明之重點，就不再詳述其方法流程。毛髮影像藉由具拍攝功能之光學顯微鏡進行拍攝記錄。請參閱第四A圖，係本試驗鹼性磷酸酶染色前後示意圖，可觀察到在染色前的核殼型球體那一組，其毛囊色素沉澱的情形較其他四組明顯，且核殼型球體那一組在經鹼性磷酸酶染色後發現，褐色的染色程度同樣有著較其他四組明顯的表現。再請參閱第四B圖所示，為上述五組經組織掃描顯微鏡(tissue scanning microscopy,BX51；Olympus)計算毛髮數量後的統計結果，可以看到核殼型球體那一組同樣有著較多數量的毛髮生成，即證實使用脂肪幹細胞與真皮乳突細胞共同培養形成核殼型球體具有顯著促進毛囊生成的能力，此意味著以核殼型球體作為促進毛囊生成之醫藥組合物為最佳的策略。此外，我們也觀察到，與1.真皮乳突細胞這組相比，其他第2~4組也都有較高的促毛囊生成效果。

6.2蘇木素-伊紅染色(H&E stain)

藉由H&E stain可以觀察到前述各組皮下毛髮結構生成的情形。請參閱第四C圖所示，圖中尺標為500微米(μm)，其中除了1.真皮乳突細胞這組僅在皮下形成囊腫(cyst)而無毛髮生成外，其他四組都有不同的毛髮生成情形，尤其是以5.核殼型球體這組所觀察到的毛髮結構生成情形最為顯著。

6.3免疫組織化學染色(IHC stain)

本試驗目的係進一步檢測看看前述5.核殼型球體這組所誘導生成的毛髮結構是否更包含有其他正常毛囊該有的結構。所使用的毛囊結構專一性抗體有角蛋白(keratin 5,K5,1：200,Abcam)用來染毛囊中的外毛根鞘(outer root sheath)以及毛透明蛋白(Trichohyalin,AE15,1：200,Abcam)用來染毛囊中的內毛根鞘(inner root sheath)與髓質(medulla)。此試驗使用的免疫組織化學染色技術亦屬於相當普遍的組織染色分析分法，原理係利用1級抗體與組織中專一性蛋白抗原結合，再利用帶有訊號的2級抗體去跟前述1級抗體結合，再清洗掉未結合上的2級抗體後偵測前述訊號，當組織中有被前述1級抗體專一性結合的區域就會訊號反應，其詳細流程就不在此詳述。

請參閱第四D圖所示，圖中尺標為100微米(μm)，係前述2.真皮乳突細胞球體與5.核殼型球體這兩組經由IHC stain檢測角蛋白(K5)及毛透明蛋白(AE15)的表現情形，由圖中可觀察出僅5.核殼型球體這組在K5及AE15皆有深褐色的呈色區域(參圖中箭頭所指)，也就表示使用脂肪幹細胞與真皮乳突細胞共同培養形成的核殼型球體所誘導生成的毛囊結構是完整的，證實本發明中利用肪幹細胞與真皮乳突細胞共同培養形成的核殼型球體確實具有促進毛囊生成的功效與用途。

綜上所述，本發明係利用真皮乳突細胞與脂肪系細胞(尤其是脂肪幹細胞)共同培養以形成混合型球體或是連續種植以形成核殼型球體，確實具有誘導毛囊生成的功效，尤其核殼型球體的型態誘導的效果更是顯著，藉此能製備出大量促進毛囊生成之醫藥組成物，做為促進毛囊生成之用途。

雖然本發明已以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作些許之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

<110> 國立成功大學 國立成功大學醫學院附設醫院

<120> 促進毛囊生成之醫藥組成物及其製備方法與用途

<140> 105106691

<141> 2016-03-04

<160> 10

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD34順向引子

<400> 1

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CD34反向引子

<400> 2

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SCA1順向引子

<400> 3

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SCA1反向引子

<400> 4

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PPARγ順向引子

<400> 5

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PPARγ反向引子

<400> 6

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> adiponectin順向引子

<400> 7

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> adiponectin反向引子

<400> 8

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH順向引子

<400> 9

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH反向引子

<400> 10

Claims (6)

1. 一種促進毛囊生成之醫藥組成物的製備方法，其包括有下列步驟：步驟(a)提供一真皮乳突細胞種植在一培養材料上，以使該真皮乳突細胞自成一球狀體；及步驟(b)提供一脂肪系細胞種植在該培養材料上，以使該脂肪系細胞包裹在該球狀體外，形成包含有至少二層不同細胞的一核殼型球體。
2. 如申請專利範圍第1項所述之促進毛囊生成之醫藥組成物的製備方法，其中，該脂肪系細胞係人類脂肪細胞、人類脂肪幹細胞或其組合。
3. 如申請專利範圍第1項所述之促進毛囊生成之醫藥組成物的製備方法，其中，該培養材料係包含一基底以及一幾丁聚醣薄膜，該幾丁聚醣薄膜係將1% w/v之一幾丁聚醣溶液塗佈於該基底上而形成。
4. 如申請專利範圍第1項所述之促進毛囊生成之醫藥組成物的製備方法，其中，該真皮乳突細胞與該脂肪系細胞種植數量比例為2比1。
5. 一種促進毛囊生成之醫藥組成物，係包含使用如申請專利範圍第1項至第4項中任一項所述之促進毛囊生成之醫藥組成物的製備方法所製備出的該核殼型球體。
6. 一種包含有如申請專利範圍第5項所述之核殼型球體在製備促進毛囊生成之藥物的用途。