JP2005337795A - 抗原又は抗体の抽出液の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 抗原または抗体を高濃度に含有する抽出液を、迅速、簡便、且つ再現性良く製造する方法を提供する。
【解決手段】 被濾過液供給室と、内面側と外面側を連通する孔および／または切り込みを有する濾過液排出口とが濾過膜を介して連通しており、被濾過液供給室の上流に陰圧手段を備えた濾過装置により被検体液を濾過し、抗原又は抗体の保持物を濾過膜上に捕捉し、次いで、上記陰圧手段により濾過装置内を陰圧にして、濾過液排出口より抽出用溶液を吸液して該濾過装置内を逆流させることにより、抗原又は抗体抽出液を製造する。
【選択図】 図６

Description

本発明は、抗原または抗体の抽出液の製造方法に関する。

臨床検査、食品分析、環境分析等において、例えば微生物等の抗原又は抗体の保持物を含有する被検体液から、該抗原又は抗体の保持物を抽出し、分析試料とすることが行われている。この被検体液からの抗原又は抗体の保持物の抽出は、濾過法、即ち、被濾過液供給室と濾過液排出口とが濾過膜を介して連通する濾過装置を用い、その被濾過液供給室に被検体液を供給して濾過して、該抗原又は抗体の保持物を濾過膜上に捕捉し、液成分を濾過液排出口から排出させる方法が汎用されている。かかる濾過法は、遠心分離法等と比較して特別な装置を必要とせず、迅速且つ簡便に抗原又は抗体の保持物を捕捉・濃縮できるため大変効率的である。

このようにして捕捉された抗原又は抗体の保持物は、そのまま分析試料として用いても良いが、分析の感度や特異性を向上させるためには、このものに抽出用溶液を作用させ、抗原または抗体のみを分離・回収して用いるのが有効である。その場合、この抽出操作は、前記濾過法により、抗原又は抗体の保持物が捕捉された濾過膜に、抗原又は抗体の抽出用溶液を被濾過液供給室側から流し、濾過液排出口から排出される抽出液を回収する方法が一般的に採用されてきた（例えば特許文献１、特許文献２参照）。

しかし、上記方法は、抽出用溶液と抗原又は抗体の保持物の接触時間が限られる。さらには、濾過膜状に、多量の抗原又は抗体の保持物が保持されていたり、該抗原又は抗体の保持物が粘着質のものであったり、さらには、これら抗原又は抗体の保持物の他に粘着質等の共雑物が含有されている場合には、捕捉されている該抗原又は抗体の保持物の内部まで抽出用溶液が十分に作用し難くなり、満足できる抽出効率が得られない問題があった。このため、上記抽出方法では、抗原又は抗体の抽出用溶液を流す操作を加圧下に行い、その流通性を向上させることが行われているが、根本的な解決に至っていないのが実状である。

しかして、この問題は、特に、ムチン等の粘着性多糖を含有する唾液や、不溶性、粘着性多糖を含有する微生物を含有する試料が被検体液の場合には、特に顕著に発生しており、そのさらなる改善が望まれている。

本発明者らは上記課題を解決する手法として、被濾過液供給室と濾過液排出口とが濾過膜を介して連通しており、被濾過液供給室の上流に陰圧手段を備えた濾過装置により、抗原又は抗体の保持物を含有する被検体液を濾過して、該抗原又は抗体の保持物を濾過膜上に捕捉し、次いで、上記陰圧手段により濾過装置内を陰圧にして、濾過液排出口より抽出用溶液を吸液して該濾過装置内を逆流させ、被濾過液供給室に抗原又は抗体の抽出液を貯留することを特徴とする抗原又は抗体の抽出液の製造方法（以下、陰圧濾過法）を既に提案している（特願２００３−０６８４７１号）。

特表平０８−５０２４１３号公報 特表２００２−５１９６４９号公報

しかしながら本発明者らの更なる検討によれば、上記陰圧濾過法にも未だ改善の余地があることがわかった。即ち、用いる被検体液、抽出用溶液等を同一のものを用いて抽出液を製造し、これを用いて抗原又は抗体の量を測定しても、抽出操作を行う者が異なった場合などに、得られる値が誤差範囲をはずれて大きく異なることがあることが判った。

従って本発明は、効率良く、かつ再現性もまた優れた、抗原または抗体の抽出液の製造方法を提供することを目的とする。

本発明者等は上記課題に鑑み鋭意研究を行った。そして、陰圧濾過法においては、濾過装置の濾過液排出口より抽出用溶液を吸液しているが、その際に、用いる濾過装置と、吸引前に抽出用溶液を計量しためておく容器との組み合わせによっては、必ずしも抽出用溶液が全量吸液できないことを見出した。そして、この抽出用溶液を確実に全量吸液できる方法につき種々検討した結果、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、被濾過液供給室と濾過液排出口とが濾過膜を介して連通しており、被濾過液供給室の上流に陰圧手段を備えた濾過装置により、抗原又は抗体の保持物を含有する被検体液を濾過して、該抗原又は抗体の保持物を濾過膜上に捕捉し、次いで、上記陰圧手段により濾過装置内を陰圧にして、濾過液排出口より抽出用溶液を吸液して該濾過装置内を逆流させ、被濾過液供給室に抗原又は抗体の抽出液を貯留することを特徴とする抗原又は抗体の抽出液の製造方法であって、前記濾過装置における濾過液排出口が該濾過液排出口の内面側と外面側を連通する孔および／または切り込みを有するものであることを特徴とする抗原又は抗体の抽出液の製造方法である。

本発明の抗原または抗体の製造方法により、被検体液中の抗原または抗体の保持物を濾過、抽出処理することで、該抗原または抗体の抽出液を迅速、簡便、且つ再現性よく製造することができる。該抽出液を各種分析に適用することで、被検体液中の抗原または抗体を高感度に分析できる。特に、齲蝕のリスク診断等が歯科医院等における繁忙な日常現場で実施されることを考慮すれば、本発明で達成される操作の簡便化、抽出時間の短時間化の効果は計り知れない程大きい。

本発明の抗原又は抗体の抽出液の製造方法は、被濾過液供給室と濾過液排出口とが濾過膜を介して連通しており、被濾過液供給室の上流に陰圧手段を備え、かつ該濾過液排出口が該濾過液排出口の内面側と外面側を連通する孔および／または切り込みを有する濾過装置を用いて実施する。該濾過装置に関して、以下で図面を使用し説明する。図１は、本発明で使用する濾過装置の代表的態様を示した斜視図及び濾過液排出口先端の拡大図である。

この濾過装置は、被濾過液供給主室１と濾過液排出口２とを備えている。また、濾過膜３は、濾過膜収納部４内に収納されており、前記被濾過液供給主室１は、接続部５により該濾過膜収納部４に接続されている。したがって、被濾過液供給主室１と濾過液排出口２とは、該濾過膜３を介して互いに連通した構造をしている。この装置は、上記濾過液排出口２と後述する被濾過液供給主室１の上流に設けられる陰圧手段への接続口以外には他に開口部はなく密閉系である。

本発明において、被濾過液供給室は、濾過膜より上流に設けられた、被濾過液の一定量が貯留される空隙の全てをいう。したがって、濾過膜収納部４内において、濾過膜３の上部には、該濾過膜収納部に流入した被検体液を一時的に貯留する小空間６が設けられているが、この小空間６も、本発明における被濾過液供給室の一部をなす。

一方、本発明において濾過液排出口２は、濾過液等の排出及び後述する抽出用溶液の吸液の操作性から、管状等の凸部として形成されているのが好ましい。濾過液排出口２は、抽出用溶液等の吸排液部１２および、この濾過液排出口２の内面側と外面側を連通する孔１１ａを有す。

被濾過液供給主室１の上流には、シリンジ外筒７とプランジャー８で構成されたシリンジ９からなる陰圧手段が設けられている。陰圧手段は、装置内を陰圧にする機能を有するものであれば良いが、このシリンジ９のように加圧機能を備えたものであるのが、被検体液が濾過性の悪い液である場合において、加圧濾過により効率的な濾過を可能にできるため好ましい。

本発明の抗原又は抗体抽出液の製造方法では、上記構造の濾過装置を用い、まず、その被濾過液供給主室１に、抗原又は抗体の保持物を含有する被検体液を供給する。この供給操作は、シリンジ９との接続部を濾過液供給主室１から外した後、ピペット等の器具を使用して、濾過液供給主室１に供給すること等により適宜に行えばよい。

次いで、この被検体液を、濾過膜３まで下方に流し、自然濾過又はシリンジ９において、プランジャー８を押して装置内を加圧することにより加圧濾過する。この濾過により、被検体液に含まれる抗原又は抗体の保持物は、濾過膜３の上面や内部の細孔に捕捉される。他方、濾過膜３を通過し、抗原又は抗体の保持物から分離された濾過液は、濾過液排出口２から装置外へ排出される。なお、濾過膜３上に捕捉された抗原又は抗体の保持物は、必要に応じて適当な洗浄用溶液（例えば純水、緩衝液、酸溶液、アルカリ溶液、界面活性剤溶液等を例示できる）で洗浄することもできる。洗浄は、洗浄用溶液を、自然濾過又は加圧濾過することにより行っても良いし、濾過液排出口２より吸液して、濾過装置内を逆流させた後に排出することにより行っても良い。

そして、本発明では、シリンジ９において、プランジャー８を引いて濾過装置内を陰圧にして、濾過液排出口２より、抗原又は抗体の保持物から該抗原又は抗体を抽出する作用を有する抽出用溶液を吸液して、該濾過装置内を逆流させる。それにより、濾過膜３に捕捉される抗原又は抗体の保持物に、該抽出用溶液が接触し抗原又は抗体が抽出される他、この抽出用溶液の濾過装置内を逆流する流れに随伴して、該濾過膜３に捕捉されていた抗原又は抗体の保持物の多くが、再度、小空間６を経て被濾過液供給主室１に吸い上げられる。この逆流する流れの過程や、被濾過液供給主室１内に貯留された状態で一定時間、好適には１時間以内、より好適には１０秒〜２０分放置することにより、抗原又は抗体の保持物に対して抽出用溶液を十分に作用させることができる。したがって、かかる本発明の方法によれば、抗原又は抗体の抽出効率を大きく向上させることができる。

抽出効率をより高めるためには、被濾過液供給主室１内に抽出用溶液を貯留した後、被濾過液供給主室１を一定時間振動等して、抽出用溶液に液流を生じさせても良い。

本発明では、この被濾過液供給主室１内に貯留され、抗原又は抗体の十分な抽出が終了した抗原又は抗体抽出液を、該被濾過液供給主室１より採取して分析試料として用いても良い。この採取操作は、接続部５を濾過膜収納部４から外して抽出液を排出させたり、シリンジ９との接続部を濾過液供給主室１から外した後、ピペット等の器具を使用して採取すること等により適宜に行えばよい。

一方向のみから、１回の吸引操作により抽出用溶液を濾過膜に通過させる方法では、被検体液に含有されていた抗原又は抗体の保持物が粘着質のものであったり、さらには、これら抗原又は抗体の保持物の他に粘着質等の共雑物が含有されている場合等においては、これらが濾過膜３内部の細孔を閉塞し、その奥に詰まった抗原又は抗体の保持物にまで上記抽出用溶液が十分に作用しないことがある。したがって、このような場合には、被濾過液供給主室１及び小空間６に貯留された抗原又は抗体の抽出液を、貯留後すぐにまたは一定時間保持後、自然濾過又は加圧濾過し、反対方向からの液流を作用させ、濾過液排出口２から排出される抽出液を分析試料として用いるのが好ましい。なお、このように濾過液排出口２から排出される抽出液を分析試料として用いれば、抗原又は抗体が抽出された後のこれらの保持物の残渣や共雑物が濾過により取り除かれるため、これらが分析時の抗原抗体反応に悪影響を及ぼすおそれがある場合には有意義である。

さらに、上記操作でも、満足できるだけの抽出が行えない場合には、上記により濾過液排出口２から排出された抽出液を再度、濾過液排出口より吸液して濾過装置内を逆流させ、被濾過液供給室１に貯留すればよく、本発明では、所望の抽出効率が達成されるまで、該抽出液の濾過、吸液操作を必要回数、通常は濾過を１〜１０回、吸液を０〜１０回繰り返して行えばよい。

さらに、他の方法としては、前記被濾過液供給主室１及び小空間６に貯留された抗原又は抗体の抽出液を、自然濾過又は加圧濾過して、抗原又は抗体の保持物を再度、濾過膜３上に捕捉した後、一定時間放置し、膜に残存する抽出液により十分な抽出を遂行することもできる。この場合、抗原又は抗体の保持物は、抽出液と混ざり合った状態で、濾過膜３上の内部細孔に捕捉されていくので、微細部分に捕捉されたものまで抗原又は抗体の保持物は抽出液に良く浸っており、抗原又は抗体の抽出は、効果的に進行する。濾過膜３に含まれる抗原または抗体の抽出液は、（１）使用した抽出用溶液と同じ組成液等の回収用溶液を、被濾過液供給主室１に供給して自然濾過、加圧濾過したり、濾過液排出口２か吸液して逆流させることにより回収するか、（２）濾過膜収納部４を解体して濾過膜３を取り出し、抽出液を回収する等の方法により採取すればよい。このような方法によれば、抽出液量を必要最小限にできる、または、回収用溶液を適宜選択することで抽出液の組成を適宜に調整することができる。上記方法では、好適には１時間以内、より好適には１０秒〜２０分放置することにより、抗原又は抗体の保持物に対して抽出用溶液を十分に作用させることができる。

図２は、本発明で使用する濾過装置の別の態様を示した側面図である。この濾過装置は、濾過膜収納部４の上面に直接、陰圧手段であるシリンジ９の先端部が脱着可能に接続されたものであり、被濾過液供給室はシリンジ外筒７の内空部に形成される。このような装置は、構造が簡単である他、吸液された抗原又は抗体の抽出液のほぼ全てが、該シリンジ外筒７の内空部に貯留されるため、これを分析試料として用いる場合には、操作上効率的である。また図２に示す濾過装置では、濾過液排出口の先端部には切り込み１１ｂが設けられている。

勿論、濾過装置の形状は図１、図２に限定されない。

以上のような構造の、本発明で用いる濾過装置において、濾過液排出口２には、濾過液排出口２の内面側と外面側を連通する孔および／または切り込み１１ａ又は１１ｂ（以下、併せて１１）を設ける。例えば、抽出用溶液等の全量を正確に吸液する場合には、濾過液排出口２の吸排液部１２を、この抽出用溶液等を入れた容器の底面に近接させて吸液する。このような場合に、濾過液排出口２にこのような孔および／または切り込み１１が無い場合は、抽出用溶液等を吸液する際に、濾過液排出口２の吸排液部１２が抽出用溶液等を入れた容器の底等に吸い付く、或いは濾過液排出口２の吸排液部１２と抽出用溶液等を入れた容器の底との隙間が小さくなりすぎることがある。このような場合は、抽出用溶液等の全量を吸液できなくなる、吸液量を確認しながら吸液する必要が生じ操作が煩雑となる、または、吸液速度が低くなり吸液操作に時間を要す等の問題を生じる。また、所定の量の抽出用溶液等を吸液できない場合は、抽出が不完全になる等により得られた抽出液中の抗原または抗体の量や濃度が測定者毎にばらつくといった問題を生じる。濾過液排出口２に、濾過液排出口２の内面側と外面側を連通する孔および／または切り込み１１を設けた場合は、濾過液排出口２の吸排液部１２が抽出用溶液等を入れた容器の底等に近接した場合も、吸液時の液や空気の流路を確保できるので、液量が少量の場合も、抽出用溶液等の全量を迅速、簡便、且つ確実に吸液することができる。このため、迅速、簡便、且つ再現性良く抗原または抗体の抽出液を製造することができる。そのため、抗原または抗体の抽出液を製造後に、例えば抗原または抗体の量や濃度を測定した場合に、再現性の高い測定結果を得ることができるようになる。

濾過液排出口２の内面側と外面側を連通する孔および／または切り込み１１の形状、数、大きさ、位置等は、抽出用溶液等を入れた容器の底と吸排液部１２が近接した場合も液や空気の流路を確保でき、所望の量の抽出用溶液等が吸液できるように、抽出用溶液等を入れた容器の底の形状に応じて適宜設定すればよい。この孔および／または切り込み１１の形状としては、円形、楕円形、半円形等の曲面形状や、三角形、四角形等の多角形状、またはスリット等の形状を例示できる。

濾過膜３は、材質、孔径、形状等は特に限定されず、従来公知の濾過膜を使用することができる。被検体液中の抗原又は抗体の保持物に対し実用上十分な捕捉能が得られるように、孔径や材質の異なる複数の膜を組み合わせて使用することも可能である。抗原又は抗体の保持物が微生物である場合には、孔径は０．１μｍ〜５μｍであるのが好ましい。尚、本発明における孔径とは、濾過膜３が多孔質膜である場合は、バブルポイント法（ＪＩＳ Ｋ ３８３２に記載の方法）により測定される孔径を、また、濾過膜３が濾紙等である場合は、硫酸バリウム等を自然濾過した際の漏洩粒子経を求める方法（ＪＩＳ Ｐ ３８０１に記載の方法）により測定される保留粒子径を指す。

濾過膜３の材質としては、被検体液や抽出用溶液に対する耐薬品性等を考慮し、ガラス繊維；ポリビニリデンフルオライド（ＰＶＤＦ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリサルフォン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド等のプラスチック類；セルロース、ニトロセルロース、アセチルセルロース等のセルロース類等を使用することができる。また、ガラス繊維濾紙の細片や活性炭等の集合体も使用することができる。

濾過膜収納部４の形状は特に限定されず、濾過膜３の形状に応じて適宜選択すればよい。濾過膜収納部４の材質は特に限定されず、量産の容易さや耐薬品性等を考慮し、ポリプロピレンやポリエチレン等のプラスチック材料を使用することができる。吸液や濾過時の濾過膜３の変形や破損を防止する目的で、濾過膜３の上面又は下面には、放射状、格子状、点状等の各種パターン構造を有す板状構造体；ナイロンネット等の網目状材料；多孔性材料；ガラス繊維やポリプロピレン不織布等の繊維材料等を介在させても良い。また、濾過膜３の上面には、濾過を容易にする目的で活性炭や濾紙粉末等の濾過助剤を添加することもできるし、或いはガラスフィルター、ポリプロピレン不織布等のプレフィルターを設置することもできる。

小空間６は、形状、体積等は特に限定されない。濾過膜３の有効濾過面の全面に適当な体積の小空間６を設けた場合は、濾過膜３の全面を有効に利用することができるので被濾過液等の濾過効率が向上する、或いは、洗浄用溶液および／または抽出用溶液を濾過膜３の全面に有効に作用させることができるので洗浄効率や抽出効率が向上する場合があり好ましい。

陰圧手段としては、濾過装置内部を装置外部に対して陰圧状態とすることができる手段であれば、従来公知の陰圧手段を使用することができる。このような陰圧手段としては、シリンジ、スポイト、ゴム球等の各種手動器具や、真空ポンプ、アスピレーター等の各種装置を使用することができる。このうちシリンジ、スポイト等は、前記した図２の濾過装置のように、被濾過液供給室の機能を兼ねることができるため特に有用である。被検体の濾過を加圧下に行う場合において、加圧を陰圧手段とは別の独立した手段で行うことも適宜に可能である。こうした加圧手段としては、ボンベ、加圧用ポンプ等が挙げられる。

次に、本発明において被検体液は、抗原または抗体の保持物を懸濁状態で含む液体であれば特に限定されず、従来公知の懸濁液を使用できる。このような懸濁液としては、微生物（酵母、カビ、キノコ、細菌、放線菌、単細胞藻類、ウイルス、原生動物、動物または植物の分化してない細胞及び組織培養物等を例示できる）の培養液；飲食物；咽頭ぬぐい液、唾液、血漿、血清、尿等の体液；河川水、下水、工業用水等の環境水；或いは微生物、飲食物、糞便、歯垢等の固形物を水性液体（純水、生理食塩水等の塩溶液、リン酸緩衝液等の緩衝溶液等を例示できる）に適宜懸濁した懸濁液等が挙げられる。

上記抗原または抗体は、公知のものが制限無く対象になる。例えば、抗原としては、細胞膜タンパク質、細胞壁タンパク質、リポ多糖等のタンパク質や糖タンパク質或いは脂質タンパク質；グリコシルトランスフェラーゼ等の酵素タンパク質；莢膜多糖や血清型多糖等の各種糖類；核酸；レセプター等が例示される。また、抗体としてはＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ等の免疫グロブリンが例示される。

特に好適な被検体液としては、唾液や歯垢等の口腔内試料を含む被検体液を例示できる。該口腔内試料を含む被検体液には、口腔内細菌等の微生物、及び唾液ムチンや口腔内細菌の産生する不溶性・粘着性グルカン等の粘着性物質が含まれるため、濾過時に濾過膜が閉塞し易い。このような被検体液を抽出処理する場合には、本発明の製造方法を使用することで特に迅速且つ簡便に高濃度の抗原抽出液を製造することができる。

近年、歯牙の齲蝕のリスクを診断するために、口腔内より採取した唾液や歯垢を含む中に存在する齲蝕関連菌の濃度を測定することが試みられている。このような齲蝕関連菌を例示すれば、ミュータンスレンサ球菌に属する細菌（ストレプトコッカス・ミュータンスやストレプトコッカス・ソブリヌスを例示できる）、ラクトバチルス属に属する細菌、アクチノミセス属に属する細菌を例示できる。これらの齲蝕関連菌の多くは、糖鎖抗原（血清型多糖抗原）を有する微生物であるが、唾液や歯垢中に１０^４〜１０^７個／ｍｌ程度に微量にしか含まれておらず、さらに通常は、不溶性グルカンに覆われた凝集状態で存在しているため、該齲蝕関連菌を直接分析する方法は限定される。このような状況にあって、本発明の方法は、かかる唾液や歯垢中に存在する齲蝕関連菌を高精度で分析するに際して、糖鎖抗原を抽出する方法として適用できる。

抗原または抗体の保持物に対して使用する抽出用溶液は、中島暉躬等編（１９８８年）：抽出・精製・分析Ｉ：１４−３８．新基礎生化学実験法２．丸善株式会社、小川智也等編（１９９２）：糖鎖工学：２８２−３２１．株式会社産業調査会等に記載されている従来公知の可溶化法や溶媒抽出法において使用される抽出用溶液や、その他、化学的或いは生物学的切断・分解方法において使用される抽出用溶液が制限なく使用できる。具体的には、可溶化法や溶媒抽出法に使用する、塩化マグネシウム水溶液、チオシアン酸ナトリウム水溶液、グアニジン塩酸水溶液等の塩溶液；塩酸等の酸溶液；水酸化ナトリウム水溶液等のアルカリ溶液；デオキシコール酸ナトリウム水溶液、オクチルグルコシド水溶液、セチルトリメチルアンモニウムブロミド水溶液、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸水溶液等の界面活性剤溶液；ｎ−ブタノール等の有機溶媒；グリシン塩酸緩衝液等の緩衝溶液等が、また、化学的或いは生物学的切断・分解方法に使用する、亜硝酸水溶液；塩酸等の酸溶液；水酸化ナトリウム水溶液等のアルカリ溶液、プロテアーゼ、ホスホリパーゼ等の酵素を含む溶液等が例示できる。

前記した唾液や歯垢等の口腔内試料を含む被検体液から齲蝕関連菌の糖鎖抗原を抽出する場合においては、いわゆる亜硝酸抽出法で使用される抽出用溶液が使用される。亜硝酸抽出法は、短時間に且つ高い効率で、微生物から血清型多糖抗原等の特異性の高い糖鎖抗原を抽出できる（武井勉．阪大医学雑誌．３５：９３−１０９，１９９０．）。しかしながら、微生物を捕捉した濾過膜上に亜硝酸溶液を添加し流下させる方法では、亜硝酸溶液を濾過膜の細部に浸透させることが困難であるため、十分な抽出効率が達成されない場合があり、本発明の方法を適用するのに特に適している。

上記亜硝酸抽出法を実施する場合において抽出用溶液となる亜硝酸溶液は、一般的には亜硝酸塩溶液と酸溶液とを適宜混合することで調製できる。亜硝酸塩溶液としては、亜硝酸ナトリウムや亜硝酸カリウム等の水溶液が使用でき、酸溶液としては酢酸、プロピオン酸、クエン酸等の有機酸水溶液や硝酸、塩酸等の無機酸水溶液が使用できる。亜硝酸塩溶液と酸溶液との混合時において、亜硝酸塩の濃度は、０．１〜８Ｍになる濃度であり、酸の濃度は０．１〜１６Ｍになる量であるのが好ましい。

上記亜硝酸溶液の液温は、通常、１０〜６０℃が好ましい。また、抽出操作全体を通じて、かかる亜硝酸溶液と抗原または抗体の保持物が接触している時間は、少なくとも０．５分以上、好適には０．５〜１０分であるのが好ましい。

亜硝酸抽出法により得られた抽出液は、残留する酸により酸性を呈しているため、該抽出液を免疫学的測定方法等に適用する場合は、塩基性溶液により中和して分析試料として使用することが好ましい。該塩基性溶液としては、水酸化ナトリウム水溶液やトリス水溶液等の各種塩基を含む水溶液、或いはトリス−塩酸緩衝液等の各種緩衝液を使用することができる。これら中和用溶液は、被濾過液供給室に直接的に供給して抽出液に混合したり、濾過装置外に取り出した抽出液に加えて混合しても良いが、濾過液排出口２より吸液して混合するのが好ましい。なお、前記したように、抗原又は抗体の保持物を濾過膜３上に捕捉した後、膜に残存する抽出液により十分な抽出を遂行する場合は、この中和用溶液を、該抽出液の回収用溶液として利用すればよい。

図３は、図２に記載の濾過装置を使用し、容器１３に予め添加しておいた抽出用溶液等を吸排液する操作を図示したものである。容器１３には、図２の濾過装置の濾過膜収納部４等を収納・設置する為の設置部１４と、濾過液排出口２の長さと同等の深さを有す曲面状の抽出用溶液等の器部１５ａ、１５ｂ、１５ｃが設けられている。図３に示すような、本発明の濾過装置と容器１３を併用する方法は、特に少量の抽出用溶液等を迅速、簡便、且つ確実に吸液することができるので好適である。図３では、器部１５ａに洗浄用溶液、１５ｂに抽出用溶液、１５ｃに回収用溶液を添加する方法を想定し、３個の器部を有す容器１３を例示したが、器部１５は、使用する溶液の種類や数に応じて必要数を設置すればよい。また、器部１５の容積、深さ、形状は吸液する溶液の量や濾過液排出口２の長さに応じて適宜に選択すれば良い。本発明の濾過装置を使用した場合は、器部１５に吸排液部１２が近接した場合も、孔および／または切り込み１１が液または空気の流路となるので、溶液の確実な吸液が可能となる。

以上により得られた抗原又は抗体の抽出液から該抗原量または抗体量を測定する方法は、抗原又は抗体の化学的、物理的、生物学的、或いは免疫学的性質を利用した公知の測定方法が適宜に採用される。具体的には、抗原または抗体を構成する元素を分析する方法としては、放射化学分析法、有機元素分析法、原子スペクトル分析法、蛍光X線分析法等が例示できる。官能基や分子の化学的性質を利用する方法としては、ｐH測定法、イオン電極法、電気化学分析法、固定化酵素法、化学修飾による各種官能基の分析法が例示できる。またマススペクトロメトリー法やNMR法が例示できる。また、固定相と移動相との交換反応を利用した各種クロマトグラフィー法が例示できる。また、分子量や荷電状態といった性質を利用する電気泳動法が例示できる。

生化学的性質を利用する方法としては、各種酵素活性測定法やPCR（ポリメラーゼ鎖反応）法等が例示できる。免疫学的性質を利用する方法としては、ラテックス法等の凝集法、放射免疫測定法、酵素免疫測定法、標識抗体法、ウエスタンブロット法等の各種イムノブロット法、イムノクロマトグラフィー法等が例示できる。（中島暉躬等編（１９８８年）：抽出・精製・分析Ｉ．新基礎生化学実験法２．丸善株式会社、中島暉躬等編（１９８８年）：抽出・精製・分析ＩＩ．新基礎生化学実験法２．丸善株式会社、大沢利昭等編（１９９２年）：分子免疫学ＩＩＩ．新生化学実験講座１２．株式会社東京化学同人）。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例により限定されるものではない。

製造例１［ストレプトコッカス・ミュータンスに対する精製ポリクローナル抗体の作製］
（１）［菌体試料懸濁液の調製］
ブレインハートインフュージョン（以下「ＢＨＩ」と略すこともある）（ＤＩＦＣＯ社）３．７ｇを１００ｍｌの純水に溶解後、オートクレーブ処理し、ＢＨＩ液体培地を調製した。ＢＨＩ液体培地２ｍｌ中でＩｎｇｂｒｉｔｔ（ストレプトコッカス・ミュータンス、血清型ｃ）を３７℃、５時間、嫌気条件下（Ｎ_２：Ｈ_２：ＣＯ_２＝８０：１０：１０）で培養した後、培養液を４０００ｇ、５分遠心処理し、上清の培地成分を除去し菌体沈殿を回収した。

次いで、沈殿物を５ｍｌのリン酸生理食塩緩衝液（ｐＨ７．４）（以下ＰＢＳと略すこともある）に懸濁し、同様の遠心分離をする操作を３回行い、沈殿物を洗浄した。その後得られた菌体沈殿をＰＢＳに懸濁し、Ａ_６００＝１．０に調整しＩｎｇｂｒｉｔｔ菌体試料懸濁液とした。なお、該菌体試料懸濁液を超音波処理後、適宜希釈した後にＢＨＩ培地プレート上に添加し、生じたコロニー数を計数し菌体試料懸濁液の希釈倍率を乗じることで該菌体試料懸濁液の菌体濃度を求めたところ、約１×１０^９個／ｍｌであった。

（２）〔ストレプトコッカス・ミュータンスに対する抗血清の作製〕
免疫は以下のように実施した。

第１週は０．５ｍｌのＩｎｇｂｒｉｔｔ菌体試料懸濁液を、５日連続で５回ウサギに対し耳介静脈注射した。第２週は１．０ｍｌの該菌体試料懸濁液を、５日連続で５回ウサギに対し耳介静脈注射した。第３週は２．０ｍｌの該菌体試料懸濁液を、５日連続で５回ウサギに対し耳介静脈注射した。第４週は第３週と同様に免疫した。力価の上昇をスライドグラスを利用した菌体の凝集反応の程度により確認後、最終免疫より１週間後に、定法に従い採血しストレプトコッカス・ミュータンスに対する抗血清を得た。

（３）〔ストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体の精製〕
オートクレーブ処理したＢＨＩ液体培地１Ｌ中でＩｎｇｂｒｉｔｔを３７℃、１２時間、嫌気条件下で培養した。培養液を４０００ｇ、５分遠心処理し、上清の培地成分を除去し菌体沈殿を回収した。次いで、沈殿物を１００ｍｌのＰＢＳに懸濁させて、同様の遠心分離をする操作を３回行い、沈殿物を洗浄した。

Ｉｎｇｂｒｉｔｔ菌体を洗浄した後、０．１Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁しＡ_６００＝１５に調整した。ここにプロナーゼ（和光純薬社）を５ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で１時間保温した。反応終了後、遠心分離し菌体沈殿を回収した。次いで、沈殿物を２０ｍｌのＰＢＳに懸濁して、同様の遠心分離をする操作を３回行い、沈殿物を洗浄した。次いで２０ｍｌの０．１Ｍ グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．０）で３回洗浄し、更に２０ｍｌのＰＢＳで３回洗浄し、プロテアーゼ処理菌体懸濁液（Ａ_６００＝１２．５）を調製した。

次いで、該プロテアーゼ処理菌体懸濁液と（２）で調製した抗血清０．５ｍｌとを混合し、４℃、６０分反応させた。混合液を４０００ｇ、５分遠心分離し、菌体を回収した。この菌体を１０ｍｌのＰＢＳに懸濁し、同様の遠心分離をする操作を３回行い洗浄した。

次いで、０．５ｍｌの０．１Ｍ グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．０）に菌体を懸濁し、吸着した抗体を溶出し、遠心分離により上清を回収し、１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ９．０）を添加しｐＨ７．４に調整した。同様の溶出操作を４回行い、各画分のタンパク質量を２８０ｎｍの吸光度により測定した。

次いで、あらかじめＰＢＳで平衡化した１ｍｌのプロテインＡ−セファロース（アマシャムファルマシアバイオテク社）を充填したカラムに上記溶出液を添加し、５ｍｌ洗浄後、５ｍｌの０．１Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ３．０）にて溶出し、直ちに１Ｍトリス−塩酸（ｐＨ９．０）を添加しｐＨ７．４に調整した。ＩｇＧの溶出画分は、Ａ_２８０を測定することで確認した。

以上により、抗血清（０．５ｍｌ）をプロテアーゼ処理菌体により精製したポリクローナル抗体を１ｍｇ得た。

製造例２〔ストレプトコッカス・ミュータンス測定用免疫クロマトグラフィー法テストストリップの作製〕
（１）〔金コロイド標識されたストレプトコッカス・ミュータンスに対する精製ポリクローナル抗体の調製〕
コロイド粒径が４０ｎｍの市販金コロイド溶液（Ｂｒｉｔｉｓｈ ＢｉｏＣｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）１０ｍｌに１００ｍＭＫ_２ＣＯ_３を２μｌ添加し、ｐＨを９．０に調製後、０．２２μｍフィルター処理した。金コロイド溶液の５２０ｎｍの吸光度を測定したところ、Ａ_５２０＝１．０であった。

次いで、１ｍｇ／ｍｌに調整した製造例１の（３）で調製したポリクローナル抗体の２ｍＭホウ酸緩衝溶液（ｐＨ９．０）６４μｌを、上記金コロイド溶液に撹拌しながら添加し、室温下５分放置した。次いで、１０％スキムミルク−２ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９．０）を１．１ｍｌ撹拌しながら添加し（スキムミルク終濃度１％）、室温下３０分放置した。次いで、反応溶液を１０℃、１００００ｇ、３０分遠心処理し、上清を除去後、２ｍｌの２ｍＭＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加し、下層の金コロイド画分を再懸濁した。該再懸濁した画分の５２０ｎｍの吸光度を測定したところ、Ａ_５２０＝４．９であった。得られた金コロイド画分（以下、「金コロイド標識抗体」と表記することもある）は、４℃にて保存した。

（２）〔免疫クロマトグラフィー法テストストリップの作製〕
以下の方法に従い、図４、図５に示す免疫クロマトグラフィー法テストストリップを作製した。

ニトロセルロースメンブレン１６（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、Ｈｉ−Ｆｌｏｗ Ｐｌｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ、ＨＦ１８０、２５ｍｍ×６ｍｍ）上の検出部位２０及びコントロール判定部位２１上に、それぞれ１ｍｇ／ｍｌの製造例１の（３）で調製した精製ポリクローナル抗体及び抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体（ＩＣＮファーマシューティカルズ社）１μｌをスポットし、インキュベーター内で３７℃、６０分乾燥し抗体を固定化した。該抗体固定化メンブレン１６を１％スキムミルク−０．０１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００水溶液中で室温下、５分振とうした。次いで、該メンブレン１６を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で室温下、１０分振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。

また、コンジュゲートパッド１７（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、７．５ｍｍ×６ｍｍ）を０．５％ＰＶＡ−０．５％ショ糖水溶液中で１分間振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。該コンジュゲートパッド１７にＡ_５２０＝１．０に調整した製造例２の（１）で調製した金コロイド標識抗体を２５μｌ添加し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。更に、サンプルパッド１８（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、１７ｍｍ×６ｍｍ）を１％Ｔｗｅｅｎ２０−ＰＢＳ水溶液中で１分間振とう後取り出し、真空ポンプで吸引しながら６０分間デシケーター中で乾燥した。尚、展開終了後の被検液を保持するための吸収パッド１９（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社、２０ｍｍ×６ｍｍ）は未処理のまま用いた。

このように調製した、図４に示すような免疫クロマトグラフィーテストストリップの各構成部分をプラスチックの支持台上に配置し、図５に示すような免疫クロマトグラフィーテストストリップを組み立てた。

実施例１〔ストレプトコッカス・ミュータンスの糖鎖抗原抽出液の調製と免疫クロマトグラフィー法テストストリップを使用したストレプトコッカス・ミュータンスの検出（１）〕
（１）〔唾液の採取と培養法による唾液中のストレプトコッカス・ミュータンス濃度の測定〕
異なる１７人の被験者にパラフィンペレットを５分間噛ませ、分泌された唾液を滅菌容器に吐き出させることで回収した。

得られた唾液を４０Ｗ、１０秒間超音波処理した後、適宜希釈して、１００μｌをミチス・サリバリウス・バシトラシン（以下、「ＭＳＢ」と表記することもある。）固体培地上に添加し、３７℃、嫌気条件下、４８時間培養した。ＭＳＢ固体培地上に生じるコロニー数を計数し、唾液の希釈率から、ストレプトコッカス・ミュータンス濃度を個／ｍｌとして算出した。ＭＳＢ固体培地上には主としてストレプトコッカス・ミュータンスとストレプトコッカス・ソブリヌスが、また、一部の口腔内細菌が生育する。

コロニーの形態学的分類、及び形態学的に識別不可能なコロニーに関しては、該コロニーを純粋培養後、ミュータンスレンサ球菌の血清型特異的な抗体を利用した免疫学的測定方法及び、糖発酵試験等の生化学的方法により、ストレプトコッカス・ミュータンスをストレプトコッカス・ソブリヌス及び他の口腔内細菌と識別し、ストレプトコッカス・ミュータンス濃度を測定した。

（２）〔濾過装置を使用した抗原抽出液の調製〕
１３ｍｍシリンジフィルタ（ワットマン社、ガラス繊維濾紙ＧＦ／Ｃ、粒子保持能１．２μｍ）の濾過液排出口２の先端部に、図６に示すような濾過液排出口の内面側と外面側を連通する０．５ｍｍ×０．５ｍｍの正方形の切り込み１１ｂを２箇所設け、シリンジフィルター１０を作製した。このシリンジフィルター１０にシリンジ９（テルモ社、２．５ｍｌ）をセットし、図２の構造の濾過装置を作製した。

図３に示した容器１３を作成した。この容器１３は、下記に示す液の全量を吸液するために、器部１５の底に吸排液部１２が接するように器部１５の深さを設定した。

プランジャー８を濾過装置より引き抜き、実施例１の（１）で採取した唾液０．５ｍｌをシリンジ外筒７内に添加し、プランジャー８を装着後、該プランジャー８を押し下げ加圧することで唾液を濾過した。濾過液排出口２から排出された濾過液は廃棄した。

０．５ｍｌの０．１Ｍ ＮａＯＨ水溶液を容器１３の器部１５ａに添加した。同様に０．１２ｍｌの１Ｍ亜硝酸ナトリウム−０．５Ｍ酢酸水溶液を器部１５ｂに、０．３８ｍｌの０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を器部１５ｃに添加した。

３人の測定者に、器部１５ａの上方の設置部１４にシリンジフィルター１０を、器部１５ａの底に吸排液部１２が接するように設置させた。プランジャー８を引き上げ陰圧とすることで、シリンジフィルター１０の濾過液排出口２より、器部１５ａ内の溶液を吸液させた。そのままシリンジ外筒７内まで溶液を流入させ、直ちにプランジャー８を押し下げ加圧することで濾過させ、濾過液を廃棄させた。次いで、同様に器部１５ｂ内の溶液を吸液させ、シリンジ外筒７内まで流入した溶液をそのまま室温下、２分間保持させた。次いで、０．３８ｍｌの０．５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）を、同様に濾過液排出口２より吸液させ、シリンジ外筒７内に抽出液（約０．５ｍｌ）を回収させた。

（３）〔免疫クロマトグラフィー法テストストリップによるストレプトコッカス・ミュータンスの測定〕
上記（２）で使用したシリンジ９からシリンジフィルター１０を外した。製造例２の（２）で作製した免疫クロマトグラフィー法テストストリップのサンプルパッド１８に、該シリンジ９内の抽出液を０．１５ｍｌ添加し、１０分後の検出部位２０及びコントロール判定部位２１の発色の有無と強度を判定した。判定は、検出部位２０の発色強度を４段階（＋＋＋：発色強度が強い、＋＋：発色強度が中程度、＋：発色強度が弱い、−：発色しない）に目視で識別した。尚、コントロール判定部位２１が発色しない場合は、金コロイド標識抗体の展開が不良であることを示すので、再度分析した。

免疫クロマトグラフィー法テストストリップの判定結果と、実施例１の（１）の培養法により得られた唾液中のストレプトコッカス・ミュータンス濃度とを比較した。結果を表１に示す。

表１に示したように、３人の測定者において、培養法により得られたストレプトコッカス・ミュータンスの濃度と相関する判定結果が得られた。本発明の抽出液の製造方法を使用することで、糖鎖抗原を含む抽出液を迅速（抽出処理に要する時間は５分以内）、且つ簡便に調製できた。容器１３の器部１５の液残りは見られなかった。

比較例１
先端部に切り込みを入れていないシリンジフィルタをそのまま用いた以外は、実施例１の（１）〜（３）の手順と同様の操作を行った。なお、用いた唾液は、実施例１で採取したものと同一である。

免疫クロマトグラフィー法テストストリップの判定結果と、実施例１の（１）の培養法により得られた唾液中のストレプトコッカス・ミュータンス濃度とを比較した。結果を表２に示す。

表２に示したように、１３ｍｍシリンジフィルタ（ワットマン社）をそのまま使用した場合は、３人の測定者の測定結果が異なっていた。また、培養法により得られたストレプトコッカス・ミュータンスの濃度と相関しない判定結果が得られた場合があった。測定者Ｂや測定者Ｃでは容器１３の器部１５に液残りが見られたことから、試薬の吸液が不完全であったために、容器１３の器部１５の溶液をシリンジフィルター内の濾過膜に十分に作用できず、このような測定者間差を生じたと考えられた。

本図は、本発明に使用する濾過装置の代表的態様を示す斜視図である。 本図は、本発明に使用する濾過装置の別の態様を示す側面図である。 本図は、本発明に使用する濾過装置を抽出用溶液等を保持しておく容器と組み合わせて使用する方法の一態様を示す側面図である。 本図は、実施例で使用した免疫クロマトグラフィー法テストリップの各部材の概略図である。 本図は、実施例で使用した免疫クロマトグラフィー法テストリップの側面図である。 本図は、本発明で使用する濾過装置の濾過液排出口の切れ込み部の拡大図である。

符号の説明

１・・・被濾過液供給主室
２・・・濾過液排出口
３・・・濾過膜
４・・・濾過膜収納部
５・・・接続部
６・・・小空間
７・・・シリンジ外筒
８・・・プランジャー
９・・・シリンジ
１０・・・シリンジフィルター
１１ａ・・・孔
１１ｂ・・・切り込み
１２・・・吸排液部
１３・・・特殊容器
１４・・・設置部
１５ａ・・・器部
１５ｂ・・・器部
１５ｃ・・・器部
１６・・・ニトロセルロースメンブレン
１７・・・コンジュゲートパッド
１８・・・サンプルパッド
１９・・・吸収パッド
２０・・・検出部位
２１・・・コントロール判定部位

Claims (2)

1. 被濾過液供給室と濾過液排出口とが濾過膜を介して連通しており、被濾過液供給室の上流に陰圧手段を備えた濾過装置により、抗原又は抗体の保持物を含有する被検体液を濾過して、該抗原又は抗体の保持物を濾過膜上に捕捉し、次いで、上記陰圧手段により濾過装置内を陰圧にして、濾過液排出口より抽出用溶液を吸液して該濾過装置内を逆流させ、被濾過液供給室に抗原又は抗体の抽出液を貯留することを特徴とする抗原又は抗体の抽出液の製造方法であって、前記濾過装置における濾過液排出口が該濾過液排出口の内面側と外面側を連通する孔および／または切り込みを有するものであることを特徴とする抗原又は抗体の抽出液の製造方法。
2. 被濾過液供給室と濾過液排出口とが濾過膜を介して連通しており、被濾過液供給室の上流に陰圧手段を備え、かつ、該濾過液排出口が該濾過液排出口の内面側と外面側を連通する孔および／または切り込みを有する抗原又は抗体の抽出液の濾過装置。
   

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