CH692150A5 - Support d'immobilisation d'enzymes et lipase immobilisée. - Google Patents

Description

La présente invention se rapporte en général aux supports d'immobilisation d'enzymes et à la lipase immobilisée qui sont utilisés comme bioréacteurs, biosenseurs, etc., afin de faciliter des réactions biochimiques variées dans un domaine industriel où des enzymes sont utilisées comme catalyseurs biologiques.

Afin d'exécuter des réactions biochimiques diverses dans l'industrie en utilisant un catalyseur organique, par exemple une enzyme, de nombreuses recherches et études sur des réacteurs et senseurs biologiques sous forme d'enzyme immobilisée ont été effectuées. Par la même occasion, on a développé des études au sujet des supports pour immobiliser des enzymes, à savoir des supports d'immobilisation d'enzymes. Ce réacteur à l'enzyme immobilisée comprend une colonne remplie d'un matériau catalytique organique consistant en un support d'enzyme immobilisée. Plusieurs matériaux peuvent être couramment utilisés en tant que support, par exemple des matières organiques à poids moléculaire élevé et des matières inorganiques telles que du verre poreux, des matières céramiques, etc.

Bien que de tels matériaux inorganiques présentent quelques avantages, par exemple une haute résistance mécanique et une excellente stabilité thermique et chimique au cours d'un traitement de stérilisation, ils présentent néanmoins le désavantage de ne pas pouvoir être utilisés de façon répétée à cause d'une force d'adsorption trop faible à l'égard des enzymes. Quelques solutions ont été propo sées afin d'éliminer ce désavantage. Par exemple, les publications de brevet japonais no. 55-32 357 et 56-15 231 divulguent un procédé typique dans lequel un agent de couplage au silane comportant des radicaux organiques réactifs est combiné avec un support inorganique tel qu'un verre poreux, de l'alumine, de la silice, etc., et puis les groupes fonctionnels de l'enzyme sont fait réagir avec les radicaux organiques réactifs de l'agent de couplage silané afin de réaliser une liaison entre le support inorganique et l'enzyme.

A titre d'exemple typique de telles enzymes immobilisées sur le support inorganique (appelée "enzyme immobilisée" dans ce qui suit) comprenant l'agent de couplage silané, on connaît les enzymes décomposant les hydrates de carbone telles que l' alpha -amylase, la glucoamylase, etc. Cependant, puisque ces enzymes ont une faible activité, à savoir une réactivité médiocre par rapport à l'amidon ou d'autres substrats, en comparaison avec l'enzyme libre et non immobilisée, on a besoin d'une grande quantité d'enzyme immobilisée afin d'obtenir le même degré de réactivité qu'une enzyme non immobilisée. Par conséquent, l'enzyme immobilisée n'est pas adaptée à un procédé de production à l'échelle industrielle. Afin de surmonter cette difficulté, les publications de brevet japonais no. 5-219 952 et 4-51 894 divulguent un support et un procédé nouveaux pour immobiliser une enzyme sur un support.

D'autre côté, une des enzymes typiques aptes à scinder les lipides, à savoir la lipase, a été utilisée depuis longtemps pour différentes méthodes dans le domaine de chimie de synthèse organique, par exemple la décomposition de monoesters, la synthèse d'esters, la résolution optique de modifications racémiques par une réaction d'échange d'esters, etc., ce qui est analogue à une scission d'huiles et de graisses. Néanmoins, on a seulement étudié, en vue de développer un procédé industriel d'immobilisation, l'adsorption physique d'une solution de lipase hautement concentrée sur la diatomite. Afin de fabriquer de la diatomite ayant adsorbé la lipase, il est nécessaire de mélanger la solution concentrée de lipase enzymatique brute avec de la terre à diatomées et puis de sécher le mélange. Cependant, le pouvoir physique adsorbant de la diatomite est limité, et sa force d'adsorption est relativement faible due à l'adsorption physique. Par conséquent, l'activité de la diatomite comportant de la lipase adsorbée diminue graduellement lors des répétitions d'utilisation.

Premièrement, un objectif principal de l'utilisation d'une enzyme immobilisée est que, puisque l'enzyme est onéreuse, on puisse l'utiliser plusieurs fois sans devoir la jeter après un seul usage. Ceci diminue les frais de fabrication, et le produit final doit être exempt d'enzyme résiduaire. En d'autres mots, il est souhaité de réaliser une enzyme immobilisée spécifique qui peut être utilisée de façon répétée pendant une longue durée en la quantité la plus petite possible. Lorsque l'activité de l'enzyme immobilisée est augmentée, la grandeur des installations de fabrication diminue ce qui entraîne des coûts initiaux et courants moins élevés.

Il est donc un premier but de la présente invention de fournir un support inorganique amélioré pour l'immobilisation d'enzymes qui obvie les problèmes connus décrits ci-dessus.

Un autre objectif de la présente invention est de trouver un support inorganique amélioré pour l'immobilisation d'enzymes qui facilite l'immobilisation de la lipase.

Un but additionnel de la présente invention est de fournir une lipase immobilisée ayant une activité élevée.

Encore un objectif de la présente invention est de produire une enzyme immobilisée sur un support inorganique et une lipase immobilisée qui peuvent être utilisés plusieurs fois et qui ne perdent pas de leur activité.

Afin d'accomplir les buts et objectifs décrits, on produit un support inorganique perfectionné en combinant un support inorganique avec un agent de couplage comportant une liaison d'ester carboxylique. Un support inorganique amélioré pour supporter de la lipase est fabriqué en combinant le support inorganique avec l'agent de couplage comportant une liaison d'ester carboxylique. L'agent de couplage comportant une liaison d'ester carboxylique est un agent de couplage silané. Le support inorganique est choisi parmi des supports du type kaolinite pour immobiliser les enzymes ou n'importe quel autre support comportant de groupes fonctionnels apte à lier l'agent de couplage au silane, tels que le verre poreux, la bentonite, le gel de silice, l'alumine, la silice, l'hydroxylapatite silice-alumine, le gel de phosphate de calcium, etc.

L'agent de couplage au silane comprenant une liaison d'ester carboxylique est choisi parmi les agents de couplage répondant à la formule générale RCOO(CH2)nSiR min 3 dans laquelle R représente un groupement fonctionnel organique, R min désigne un radical choisi parmi les groupes alkoxy inférieur, phénoxy et halogène, et n est un nombre entier. On peut par exemple utiliser le gamma -méthacryloxypropyl triméthoxysilane, le gamma -acétoxypropyl triméthoxysilane, le gamma -acryloxypropyl triméthoxysilane, etc.

La présente invention fournit encore une lipase immobilisée où les groupes fonctionnels contenus dans la protéine de la lipase sont liés à un ester carboxylique au cours des étapes suivantes: Dans la première étape, on combine le support inorganique avec l'agent de couplage présentant une liaison d'ester carboxylique; dans la seconde étape, on mélange sous agitation le support inorganique provenant de la première étape avec une solution de lipase ayant une concentration prédéterminée; la troisième étape comprend le filtrage du mélange; et la quatrième étape consiste en un séchage du résidu de filtration.

De tels supports inorganiques améliorés pour l'immobilisation d'enzymes et la lipase immobilisée présentent d'extraordinaires avantages. En détail, le support et la lipase immobilisée produits par la présente invention déploient une activité extrêmement élevée même si la quantité de protéine adsorbée sur le support est moins importante par rapport aux méthodes conventionnelles dans lesquelles la lipase est véhiculée par d'autres supports combinés aux agents de couplage silanés mais exempts de liaison d'ester carboxylique, ou aux supports non traités. En d'autres termes, le support et la lipase immobilisée produits par la présente invention ont une activité relativement extrêmement élevée par rapport à la quantité de protéine adsorbée sur le support, et une détérioration extrêmement faible au cours de leur activité. En plus, le procédé selon la présente invention, à savoir la liaison des groupes fonctionnels contenus dans la protéine de la lipase à un ester carboxylique, ne nécessite aucun traitement d'immobilisation compliqué mais seulement des étapes d'immobilisation ordinaires dans lesquelles la solution de la lipase ayant une concentration prédéterminée est mélangée sous agitation avec le support, et le mélange est ensuite filtré et le résidu séché. Le support et la lipase immobilisée produits peuvent être utilisées de façon répétée sans perte sensible d'activité. En particulier, au cours des procédés discontinus par lot, le support et la lipase immobilisée produits selon la présente invention peuvent être utilisés avec avantage sans que l'activité diminue.

La présente invention sera mieux comprise par la discussion suivante d'un mode de réalisation préféré de supports pour immobiliser les enzymes et d'une lipase immobilisée obtenu par l'utilisation du support. Cette description est accompagnée d'un dessin dans lequel:

la fig. 1 est une représentation graphique qui montre la relation entre l'activité initiale et la quantité de protéine adsorbée sur le support selon la présente invention, et les valeurs correspondantes d'exemples comparatifs et d'un support non traité; et la fig. 2 est une représentation graphique qui montre la relation entre le changement de l'activité et le nombre de réactions en discontinu répétées en utilisant le support selon la présente invention, et les valeurs correspondantes d'exemples comparatifs et d'un support non traité.

Selon la présente invention, un support inorganique est combiné avec l'agent de couplage présentant une liaison d'ester carboxylique, et le support pour porter la lipase est produit en combinant l'agent de couplage présentant une liaison d'ester carboxylique avec un support inorganique.

Le Tableau 1 montre plusieurs agents de couplage pouvant être utilisés dans la présente invention ainsi que leur formule structurelle.

Tableau 1

Formules structurelles d'agents de couplage

Dans le tableau 1, les composés no. 1 à 3 représentent les agents de couplage silanés présentant une liaison d'ester carboxylique qui sont utilisés dans le présente invention tandis que les no. 4 à 9 représentent d'autres agents de couplage silanés comme exemples comparatifs. En détail, la présente invention utilise des agents de couplage ayant une liaison d'ester carboxylique qui sont de préférence choisis parmi les agents de couplage silanés représentés par la formule générale RCOO(CH2)nSiR min 3. Dans cette formule, R représente un groupement fonctionnel organique pouvant contenir un groupement fonctionnel inorganique à son extrémité, R min représente un radical choisi parmi les groupes alkoxy inférieur, phénoxy et halogène, et n est un nombre entier.

Le support inorganique à utiliser dans le présente invention est choisi parmi des supports du type kaolinite pour immobiliser l'enzyme ou encore d'autres supports comportant un groupe fonctionnel capable de se fixer sur l'agent de couplage silané tels que du verre poreux, la bentonite, le gel de silice, l'alumine, la silice, l'hydroxylapatite silice-alumine, le gel de phosphate de calcium, etc.

Dans les réalisations de la présente invention décrites ci-après, le support du type kaolinite pour immobiliser l'enzyme sous forme de particules ayant un diamètre moyen de 200 mu m a été utilisé pour fixer différents agents de couplage silanés à la surface du support et puis y attacher de la lipase. Les exemples de support ainsi obtenus ont été soumis à différents essais pour comparer leurs activités réactionnelles. Le résultat de ces essais a clairement démontré que les échantillons basés sur les no. 1 à 3 ont eu une activité plus élevée que les échantillons classiques basés sur les no. 4 à 9 même si la quantité de protéine adsorbée sur les supports produits par la présente invention n'était pas spécialement grande. En détail, le support combiné avec l'agent de couplage au silane ayant une liaison d'ester carboxylique et choisi parmi le gamma -méthacryloxypropyl triméthoxysilane, le gamma -acétoxypropyl triméthoxy silane et le gamma -acryloxypropyl triméthoxysilane a été utilisé pour porter la lipase (dénommée ci-après "lipase immobilisée combinée avec un ester"). D'autre part, le support combiné avec d'autres agents de couplage sans liaison d'ester carboxylique a été utilisé pour porter la lipase (dénommée ci-après "lipase immobilisée combinée avec un autre coupleur au silane").

Le support du type kaolinite décrit ci-dessus pour l'immobilisation d'une enzyme a été produit par un procédé dans lequel un minéral de kaolin est soumis à un traitement hydrothermique avec un acide fort, un lavage avec l'eau pour former une boue ou une matière poudreuse, et à un chauffage à une température comprise entre 350 DEG et 1000 DEG C. Ce support du type kaolinite ainsi obtenu présente une distribution de pores bien définie et uniforme et un rapport de porosité élevé.

Ce procédé de préparation du support du type kaolinite présente des avantages. Le traitement hydrothermique avec un acide fort enlève des impuretés formées par des composés alcalins du kaolin minéral par dissolution de sorte que la boue ou la matière poudreuse deviennent sensiblement exemptes de composés alcalins. Il en résulte que la stabilité chimique du kaolin minéral se trouve fortement accrue.

Il est à noter que, dans le cas du support combiné avec le gamma -aminopropyl triméthoxysilane (No. 8 dans le Tableau 1) qui est connu d'être très efficace pour d'autres enzymes que la lipase, un tel support immobilise une petite quantité de lipase seulement, et le support immobilisé ne présente qu'une faible activité.

En général, puisque la lipase du commerce contient une grande proportion de poudre d'enzyme brute contenant égale ment des substances protéiques autre que la protéine de la lipase pure, il est impossible de fixer de manière sélective la protéine de la lipase pure au support. Afin d'augmenter l'activité, il est donc nécessaire d'utiliser une grande quantité de lipase enzymatique brute hautement concentrée afin de pouvoir adsorber une quantité suffisante de protéine sur le support. Cela entraîne une opération d'immobilisation difficile et nécessite un support présentant un pouvoir adsorbant extrêmement grand. Par contre, si l'on utilise le support combiné avec l'agent de couplage au silane et comportant une liaison d'ester carboxylique, il devient possible de fabriquer la lipase immobilisée combinée avec un ester ayant une activité remarquablement élevée même si le support n'adsorbe pas beaucoup de protéine.

Par conséquent, la présente invention ne nécessite pas l'utilisation du procédé d'immobilisation classique difficile décrit ci-dessus pour obtenir de la diatomite ayant adsorbé de la lipase, procédé dans lequel on doit mélanger la solution très concentrée d'une lipase enzymatique brute avec de la diatomite et puis sécher le mélange mais elle se contente d'un procédé d'immobilisation couramment utilisé, à savoir que le support est mélangé et agité avec une solution de lipase ayant une concentration prédéterminée, et le mélange est filtré et séché. Bien que les raisons de ce phénomène ne soient pas complètement comprises, elles peuvent être anticipées comme suit. Il est bien connu que l'enzyme est une protéine spécifique agissant comme catalyseur biologique, et ses 20 sortes d'acides aminés comportent différents groupes fonctionnels tels qu'amino, carboxyle, etc. Dans le cas de la protéine de lipase, l'un de ces groupes se fixe facilement à l'ester carboxylique de sorte que la protéine de lipase puisse être sélectivement liée à l'ester carboxylique du support plutôt que d'autres protéines.

Les essais comparatifs pour comparer la détérioration de l'activité au cours des réactions répétées indiquent que la lipase immobilisée combinée avec un ester selon la présente invention déploie une grande force adsorbante donnant une activité élevée et une détérioration de cette dernière très basse, comparées à d'autres échantillons de lipase immobilisée obtenus en utilisant les autres agents de couplage avec ou sans silane.

Afin de faciliter la compréhension de la présente invention, on décrira dans ce qui suit un mode de réalisation typique.

A titre d'exemple d'une réaction de résolution optique d'une modification racémique, on a mélangé du DL-1-phénéthylalcool avec de l'acétate de vinyle comme donneur d'acyle afin d'effectuer une estérification de la modification racémique en utilisant de la lipase comme catalyseur. La lipase qu'on a utilisée était de la lipase PS (pseudomonas cepacia provenant de l'Amano Seiyaku Co., Ltd.) en s'assurant que cette lipase peut catalyser une réaction sélective d'une modification racémique, en particulier en ce qui concerne la réaction décrite ci-dessus, et que la lipase PS possède une sélectivité extrêmement élevée. On a utilisé une lipase PS immobilisée sur un support.

Exemples 1 à 3

Le support a été préparé comme suit. 0,2 g des agents de couplage silanés no. 1 à 3 du tableau 1, présentant une liaison d'ester carboxylique, ont été dilués avec 1,8 g de toluène. On a ajouté 1,5 g de support du type kaolinite pour immobiliser l'enzyme, à la solution diluée de l'agent de couplage au silane et on a mélangé le tout pendant une heure. La solution a été séparée en une partie solide et une partie liquide. La partie solide a été séchée pendant 30 min à 110 DEG C.

Ensuite, 2,5 g de lipase enzymatique brute (lipase PS, fabriquée par Amano Seiyaku Co., Ltd.) ont été dissous dans 25 ml de tampon à l'acide phosphorique (pH 7,0). Cette solution a été filtrée pour enlever des résidus insolubles. 0,5 g du support préparé comme décrit ci-dessus a été ajouté à la solution, et le mélange a été agité pendant un jour pour obtenir l'immobilisation. Le mélange a été filtré pour récupérer la lipase immobilisée.

Exemples comparatifs 4 à 9

Le support a été préparé comme suit. 0,2 g des agents de couplage silanés no. 4 à 9 du tableau 1 ont été dilués avec 1,8 g de toluène. On a ajouté 1,5 g de support du type kaolinite pour immobiliser l'enzyme, à la solution toluénique diluée de l'agent de couplage au silane et on a mélangé le tout pendant une heure. La solution a été séparée en une partie solide et une partie liquide. La partie solide a été séchée pendant 30 min à 110 DEG C.

Ensuite, 2,5 g de lipase enzymatique brute (lipase PS, fabriquée par Amano Seiyaku Co., Ltd.) ont été dissous dans 25 ml de tampon à l'acide phosphorique (pH 7,0). Cette solution a été filtrée pour enlever des résidus insolubles. 0,5 g du support préparé comme décrit ci-dessus a été ajouté à la solution, et le mélange a été agité pendant un jour pour obtenir l'immobilisation. Le mélange a été filtré pour récupérer la lipase immobilisée.

Essai d'activité

120 mg de chacun des échantillons de lipase immobilisée selon les exemples 1 à 3 et des exemples comparatifs 4 à 9 ont été ajoutés dans des solutions de 1,2 ml de DL-1-phénéthyl alcool dans 4,6 ml d'acétate de vinyle afin d'effectuer une réaction d'estérification. Le rapport entre l'activité initiale en unités (U) par gramme et la quantité de protéine adsorbée sur les supports en mg/g de support) après 20 min à compter depuis le début de l'estérification est représenté dans la fig. 1. Une unité (U) d'activité représente la quantité de l'enzyme qui produit 1 mu mol d'ester phénéthylique par minute.

Dans la fig. 1, les activités initiales de trois matériaux encerclés A correspond aux trois exemples selon l'invention, utilisant la lipase immobilisée et combinée à l'ester et dans lesquels la lipase est véhiculée par le support combiné à l'agent de couplage au silane et ayant une liaison d'ester carboxylique, exemples 1 à 3, à savoir le gamma -méthacryloxypropyl triméthoxysilane, le gamma -acétoxypropyl triméthoxysilane, ou le gamma -acryloxypropyl triméthoxysilane. Ces trois exemples fournissent une activité initiale extrêmement élevée par rapport aux six exemples comparatifs qui sont produits en utilisant les autres agents de couplage silanés, no. 4 à no. 9, et à l'exemple non traité sans agent de couplage au silane, sans égard à la quantité de protéine adsorbé sur le support. Par exemple, si l'on compare les exemples 1 à 3 avec l'exemple comparatif 9 dans lequel on observe substantiellement la même quantité de protéine adsorbée, les valeurs d'activité des trois exemples 1 à 3 encerclés A sont extrêmement plus élevées que celle de l'exemple comparatif 9, traité avec du phénéthyl triméthoxysilane. D'autre part, si l'on met en rapport les exemples 1 à 3 avec l'exemple comparatif 4 présentant une plus grande quantité de protéine adsorbée que les exemples 1 à 3, les valeurs d'activité des trois exemples 1 à 3 sont extrêmement plus élevées que celle de l'exemple comparatif 4, traité avec de l'allyl triméthoxysilane.

Essai de réactions en discontinu

Une réaction utilisant le support de l'exemple 1, traité au gamma -méthacryloxypropyl triméthoxysilane, no. 1, a été répétée 30 fois. A titre de référence, deux réactions en discontinu dans lesquelles on a utilisé un support traité à l'allyl trimethoxysilane, no. 4, et un support non traité, ont également été répétées 30 fois. Les résultats de cet essai de réactions répétées sont représentés dans la fig. 2 qui montre la relation entre le changement d'activité (en U/g) et le nombre de réactions répétées, en utilisant les supports selon la présente invention, le support d'un exemple comparatif, et un support non traité.

Dans la fig. 2, l'exemple selon la présente invention, représenté par "A", montre que l'activité décroît légèrement jusqu'après 10 réactions et reste pratiquement au même niveau jusqu'à 30 fois. Par contre, l'exemple comparatif 4 et l'exemple au support non traité montrent une activité remarquablement faible au départ et qui diminue graduellement lors des répétitions de la réaction en discontinu.

Ensuite, le support à la kaolinite pour immobiliser l'enzyme utilisé dans les exemples 1 à 3, et un autre support inorganique, à savoir des perles de verre du commerce (diamètre moyen des particules: 500 mu m) ont été traités respectivement avec du gamma -méthacryloxypropyl triméthoxysilane, no. 1, et du allyl triméthoxysilane, no. 4, à titre d'exemples comparatifs. Ces échantillons ont été soumis au traitement d'immobilisation pour la lipase et le traitement d'estérification de la même façon que celle décrite dans les exemples 1 à 3. Le Tableau 2 montre les résultats représentant la quantité de protéine adsorbée (mg/g), l'activité initiale (U/g) et l'activité relative (U/mg) (activité initiale divisée par la quantité de protéine adsorbée) pour ces trois échantillons. <TABLE> Columns=5 Tableau 2 Comparaison entre le support du type kaolinite pour immobiliser l'enzyme, et les perles de verre Head Col 1: Échantillon Head Col 2: Agent de couplage au silane Head Col 3: Quantité de protéine adsorbée (mg/g) Head Col 4: Activité initiale (U/g) Head Col 5: Activité relative (U/mg) Support à la kaolinite non traité 39,5 254 6,4 allyl triméthoxysilane<CEL AL=L>39,1 348 8,9 gamma -méthacryloxy-propyltriméthoxysilane 33,2 873<CEL AL=L>26,3 Perles de verre non traitées 7,6 48 6,3 allyl triméthoxysilane 7,2<CEL AL=L>64 8,9 gamma -méthacryloxy-propyltriméthoxysilane 5,7 150 26,3 </TABLE>

Comme il ressort des données reprises dans le Tableau 2, l'échantillon selon la présente invention déploie une activité initiale très élevée bien que la quantité de protéine adsorbée sur le support soit inférieure aux échantillons comparatifs. En détail, dans le cas du support du type kaolinite pour immobiliser l'enzyme, la quantité de protéine adsorbée sur le support non traité est de 39,5 mg/g, sur l'échantillon comparatif (traité avec l'allyl triméthoxysilane), elle est de 39,1 mg/g, et sur l'échantillon de l'invention (traité avec le gamma -méthacryloxypropyl triméthoxysilane), de 33,2 mg/g. Les valeurs relatives à l'échantillon non traité et à l'échantillon comparatif sont plus élevées que celle de la présente invention. Par contre, l'activité initiale de l'échantillon selon l'invention est de 873 U/g, celle de l'échantillon non traité est de 254 U/g, et celle de l'échantillon comparatif, 348 U/g. Le premier échantillon montre une valeur très élevée. L'activité relative de l'échantillon non traité est de 6,4 U/mg, celle de l'échantillon comparatif, 8,9 U/mg, et celle de l'échantillon selon l'invention est de 26,3 U/mg. L'échantillon selon l'invention présente une valeur extrêmement élevée.

Lorsqu'on utilise des perles de verre disponibles dans le commerce comme support inorganique, l'échantillon selon l'invention montre une très haute activité initiale, à savoir de 150 U/g bien que la quantité de protéine adsorbée soit inférieure à celle de l'échantillon comparatif et de l'échantillon non traité. En plus, l'activité relative de l'échantillon selon l'invention est de 26,3 U/mg et donc bien plus élevée que celle des autres échantillons. Cette valeur élevée correspond à celle du support du type kaolinite. Indépendamment de la nature du matériel du support, on a la conformation que l'agent de couplage présentant une liaison d'ester carboxylique confère au support une haute activité bien que la quantité de protéine adsorbée au support soit moins élevée que celle des échantillons classiques. En d'autres termes, tandis que le support à base de perles de verre du commerce a une faible activité par rapport au support du type kaolinite, les valeurs de leurs activités relatives sont équivalentes et plus élevées que dans les échantillons comparatif et non traité. Cela veut encore dire que l'effet attribué à l'agent de couplage au silane et présentant une liaison d'ester carboxylique n'est pas limité à un support inorganique particulier.

Comme on l'a expliqué ci-dessus, le support et la lipase immobilisée produits par la présente invention montrent une activité extrêmement élevée (activité relative) même si la quantité de protéine adsorbée sur le support n'est pas si importante que selon les propositions connues où la lipase est supportée sur d'autres supports combinés avec des agents de couplage aux silanes exempts de liaison d'ester carboxylique, ou sur des supports non traités. En plus, les supports et la lipase immobilisée produits par la présente invention peuvent être utilisés de façon répétée sans perte notable de leur activité. En particulier, lorsqu'un répète des réaction en discontinu, le support et la lipase immobilisée produits par la présente invention peuvent être utilisés pendant une période prolongée.

La pratique de la présente invention peut être modifiée dans le cadre de ce qui est revendiqué, et l'invention n'est en particulier pas limitée aux réalisations décrites ci-dessus.

Claims (8)

1. Support d'immobilisation pour immobiliser une enzyme, caractérisé par un support inorganique combiné avec un agent de couplage comportant une liaison d'ester carboxylique.

2. Support d'immobilisation pour immobiliser une enzyme selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le support inorganique porte une lipase.

3. Support d'immobilisation d'enzyme selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'agent de couplage comportant une liaison d'ester carboxylique est un agent de couplage au silane.

4. Support d'immobilisation d'enzyme selon la revendication 3, caractérisé en ce que l'agent de couplage au silane comportant une liaison d'ester carboxylique est représenté par la formule générale RCOO(CH2)nSiR min 3, dans laquelle R est un groupe fonctionnel organique, R min désigne un radical choisi parmi alkoxy inférieur, phénoxy et halogène, et n est un nombre entier.

5. Support d'immobilisation d'enzyme selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que l'agent de couplage au silane comportant une liaison d'ester carboxylique est choisi parmi le gamma -méthacryloxypropyl triméthoxysilane, le gamma -acétoxypropyl triméthoxysilane et le gamma -acryloxypropyl triméthoxysilane.

6. Support d'immobilisation d'enzyme selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le support inorganique est choisi parmi des supports comprenant un groupe fonctionnel apte à se combiner avec l'agent de couplage au silane tels que les supports kaolinitiques pour l'immobilisation d'enzymes, le verre poreux, la bentonite, le gel de silice, l'alumine, la silice, l'hydroxylapatite silice-alumine, et le gel de phosphate de calcium.

7. Lipase immobilisée comprenant un support d'immobilisation selon la revendication 2.

8. Procédé d'obtention de lipase immobilisée, ledit procédé comprenant la combinaison d'un support selon la revendication 1 avec l'agent de couplage comportant une liaison d'ester carboxylique comme première étape, le mélange et l'agitation du support inorganique avec une solution de lipase à concentration prédéterminée comme seconde étape, la filtration du mélange comme troisième étape, et le séchage du matériel filtré comme quatrième étape, liant ainsi les groupements fonctionnels de la protéine de lipase à l'ester carboxylique.