JPS60232090A - 固定化酵素、その製造方法およびその使用方法 - Google Patents

固定化酵素、その製造方法およびその使用方法

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JPS60232090A
JPS60232090A JP60078243A JP7824385A JPS60232090A JP S60232090 A JPS60232090 A JP S60232090A JP 60078243 A JP60078243 A JP 60078243A JP 7824385 A JP7824385 A JP 7824385A JP S60232090 A JPS60232090 A JP S60232090A
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glucose
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ロベール・クリヒトン
ジヤン・ピエール・ランデル
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Redco NV SA
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の分野］ 本発明は、アミノ基および二官能性スペーサーを介して
無機キャリアーに共有結合している固定化酵素、その製
造方法およびその使用方法に関するものである。
［発明の背景］ 固定化酵素は数回使用でき、そして反応媒体から容易に
分離できるので、製造および分析の分野でその重要性が
増大してきた。酵素は様々なキャリアーに異なる方法で
固定することができる。共有結合を介して酵素に結合さ
れるキャリアーは特に有用である。様々な有機重合体お
よび無機物質が既に使用されてきており、既知のキャリ
アー物質の例は多糖類（例、セファローズ、セファデッ
クス、澱粉等）、合成重合体（例、ポリアクリルアミド
、フェノール−ホルムアルデヒド樹脂）および無機物質
（例、ガラス、酸化アルミニウム、シリケート）である
。
酵素をキャリアー（ｃａｒｒｉｅｒ　）に共有結合させ
為には、ある場合にはキャリアーのアミノ基を二官能性
スペーサーを介して酵素のアミン基に共有結合させるこ
とによって行なうことができる。キャリアー物質がその
性質上その表面に遊離のアミノ基を有していない場合に
は、まずアミン基を化学反応によって導入する。この目
的のために、無機キャリアーの場合には特に珪素化合物
（シリケート）、なかでも３−アミノプロピルトリメト
キシシラン（ＡＰＴＳ）が有用であることが知られてい
る。酵素は二官能性スペーサーを介して共有結合によっ
てアミノ基に結合する。さらに、［３−（２−アミノエ
チル）アミノプロピルトリメトキシシランを用いること
もできる。
他の物質の中では、グルタルアルデヒドがキャリアーの
アミノ基および酵素のアミン基と反応することができる
のでスペーサーとして特に有用である。
有機キャリアー物質に固有の欠点は、有機溶剤および高
温度に影響され易く、ある場合には高価格であることで
ある。有機重合体に対して、無機キャリアー物質（例、
ガラス、アルミネート、シリケート）は比較的少ない反
応性表面しか有していないので、比較的少量の酵素しか
保持しない。
よって、実質的に多量に使用しなければならない。
［発明の詳細な記述］ 本発明の目的は、無機キャリアーに共有結合されている
改良固定化酵素、特に改良された活性度および安定度を
有する固定化酵素を提供することにある。
本発明者は無機キャリアーとして、オフタビアン・アン
ト７　（Ｏｃｔａｖｉａｎ　Ａｎｔｏｎ）　、ビニール
・ヤコブス（Ｐｉｅｒｒｅ　Ｊａｃｏｂｓ　）　、ジョ
ージ・ポンセレット（Ｇｅｏｒｇｅｓ　Ｐａｎｃｅｌｅ
ｔ）およびフイリツペ・ジ’ｒ−／クス（Ｐｈｉｌｌｉ
ｐｐｅ　Ｊａｃｑｕｅｓ　）が発明者であるドイツ国特
許願第Ｐ３４１４２３２号に、基づく日本国出願［本件
出願と同日付けにて提出した特許出願（１）］の明細書
記載の無定型シリカ粒子が特に好適であることを発見し
た。このシリカ粒子は、２０乃至１２０ＩＬｍの粒度の
略球状の合成珪酸カルシウムを酸で加水分解して得られ
た、１５乃至８０川ｍの平均粒度、１．３乃至３Ｃゴ／
ｇの見掛粒子容積および２５０乃至８００ｍ″／ｇの比
表面積を有する略球状の無定型シリカ粒子である。ｒ見
掛粒子容積ｊ　（ｃｍ″／ｇ）なる語は見掛嵩密度（ｇ
／ｃｒｎ’）の逆であり、粉体技術の分野では既知であ
る。見掛粒子容積は、実験に際して一定重量の粉体の容
積を比較するために用いられる。これらのシリカ粒子は
゛その外部表面上に連続した均一なミクロ粒状構造を有
し、その内部には出発原料の厚計状結晶構造を僅かに留
める構造を有する。このシリカ粒子は、触媒の担体とし
て好適に用いることができる。驚くべきことには、酵素
を共有結合するキャリアーとしてこれらのシリカ粒子を
用いる時に良好な結果が得られた。この目的のために、
シリカ粒子の表面にまず遊離の７ミノ基を導入する。そ
のための薬剤としては、３−アミノプロピルトリエトキ
シシラン（ＡＰＴＳ）が特に好適である。酵素を二官能
性スペーサーを介してこれらの７ミノ基に共有結合によ
って結合させる。二官能性スペーサーとしては、グルタ
ルアルデヒドが非常に有用であることが認められた。こ
のようにして得られた予備活性化シリカ粒子に酵素を既
知の方法にて共有結合せしめる。
酵素の中で、セロビアーゼおよびグルコースイソメラー
ゼが徹底的な調査の対象となり、驚くべき良好な結果が
得られた。しかし基本的には、製造および分析の分野に
おいて高い活性度および高い安定度に固定化形状にて使
用し得る全ての酵素が対象である。これらの酵素の例と
しては、ペニシリンアミダーゼ、プロテアーゼ、グルコ
ースオキシダーゼ、リパーゼ、コレステロールエステラ
ーゼ、コレステロールオキシダーゼ、シアナイドとドロ
ラーゼ、キモトリプシン、トリプシン、セルラーゼ（エ
ンド形およびエキソ形）、ウレアーゼ、アミノ酸オキシ
ダーゼ、クレアチナーゼ、ペルオキシダーゼおよびβ−
ガラクトシダーゼを挙げることができる。ただし、これ
らに限定されるものではない。
新規酵素キャリアーの一つの長所は、蛋白質を結合する
容量が大きいので比較的不純な酵素も使用できる点であ
る。固定化酵素はキャリアーに結合されており、高い活
性度および高い安定度を示本発明の固定化酵素はいくつ
かの異なった目的に使用することができる。酵素として
セロビアーゼを用いる時には、固定化酵素を用いること
によって優れた方法にてグルコースをセロビオースから
製造することができる。グルコースイソメラーゼを用い
る時には、フルクトースをグルコースから製造すること
ができる。さらに、この固定化酵素は過剰量のグルコー
スの存在下でフルクトースの分析定量のためにも用いる
ことができる。
新規固定化酵素の研究中に、遊離の酵素と比較して結合
酵素は、熱劣化に対して高い抵抗性を有し、最適温度よ
り２〜３℃上昇してもよいことが認められた。さらに、
予備活性化キャリアーは、水溶液中の有効蛋白質と定量
的に反応することができるので、余分の過剰量の酵素を
使用する必要がないことが認められた。本発明によると
、活性表面積が大きいので、キャリアーの単位重量当り
好ましい酵素活性度条件が得られる。
固定化酵素、その製造方法およびその使用方法を実施例
にて示す。ただし、本発明はその実施例に示すところに
限定されるものではない。比較試験結果は本発明の固定
化酵素が驚くべき優れた性状を有することを示している
。
［実施例１］ （ａ）表面への７ミノ基の導入： ドイツ国特許願第Ｐ３４１４２３２号に基づく日本国出
願［本件出願と同日付けにて提出した特許出願（１）］
の明細書の実施例１に記載の方法により製造した、３０
乃至７０ｐＬｍの直径、３ｃ　ｍ’　／　ｇの見掛粒子
容積、３９０ｒｎ’／ｇの比表面積および５ｉ０２含有
９９．５％以上の化学組成を有する球状シリカ粒子３０
ｇをアセトン１００ｍ１づつを用いて５回洗浄し、つい
でアセトン中の３−アミノプロピルトリエトキシシラン
（ＡＰＴＳ）の５％溶液２００ｍＭと共に一夜攪拌した
。
比較の目的で、濃硝酸を用いて精製した純珪砂をアセト
ンで洗浄し、ついでＡＰＴＳと反応させた。
（ｂ）アミノ基とグルタルアルデヒドとの反応二アミノ
基を有する該キャリアー各５ｇと０．１Ｍ燐酸カリウム
緩衝液（ｐＨ７，）中のグルタルアルデヒドの２．５％
溶液５０ｍＪｌとを攪拌しながら３時間反応させた。つ
いで、得られたキャリアーをホスフェート緩衝液５０ｍ
Ｊｌづつを用いて３回洗浄した。このようにして得られ
たキャリアーは酵素と直接反応させることができる。
（ｅ）酵素との反応： 蛋白質含有量２．７ｍｇ／ｍ文および５．４ｍｇ　／　
ｍ　ｌの二種類の溶液２ＳｚｎＱ中にて４℃で、−夜反
応させた。結果を下記第１表に示す。
以下余白 第１表 キャリアー　キャリアーの量　Ａ　Ｂ　Ｃ（ｇ　）　（
＋ｎｇ）　（ｍｇ）　、（＋ａｇ）本発明品　５　Ｂ？
、５　１．３５　１３．２本発明品　５　１３５　［ｉ
［１，５１３，８珪　砂　５　６７．５　８０　１．５
幸珪　砂　５　１３５　１３２．５　０．５ヰただし第
１表において、Ａ、ＢおよびＣは下記の蛋白質量である
。
Ａ；使用した蛋白質量 Ｂ：上澄み液中の蛋白質量 Ｃ；キャリアー１ｇ当り結合した蛋白質量また本を付し
た値はセロビアーゼの酵素濃度を測定することにより定
量した。
本発明のキャリアーは珪砂よりもかなり多量の酵素を結
合することができることを上記データは示している。セ
ロビアーゼの活性は、ｐＨ４、７５で０．１Ｍ酢酸ナト
リウム緩衝液中Ｐ−二トリフェニルーβ−Ｄ−グルコピ
ラノシドの８ミリモルの溶液中で測定した。加水分解に
よるｐ−ニトロフェノール生成物は、アルカリ性媒体中
４２０ｎｍで分光測光によって直接測定した。
酵素とキャリアー間の結合の強さを測定するために、固
定化酵素を同じ基質を用いて４０℃で１．０分間インキ
ュベートした。上澄み液の試料を採取し、試料および上
澄み液中のｐ−ニトロフェノールの量を時間の関数とし
て測定した。酵素活性は上澄み液中には存在しないこと
、および固定化酵素はその全活性を発揮し続けているこ
とを実験結果は示した。
他の実験においては、固定化酵素を四種の基質試料を用
いて連続的に処理し、ついでそれぞれの残留活性を測定
した。結果は活性は一定のままであることを示した。
本発明の固定化酵素と非結合酵素との最適温度の比較試
験を行った。この目的のために、試料をｐＨ４、７５で
０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液中のｐ−ニトロフェニル
−β−Ｄ　−グルコピラノシドの８ミリモルの溶液中で
４０乃至８０℃の温度で１５分間インキュベートした。
固定化酵素の至適活性は遊離の酵素の至適活性よりも７
℃高い温度にあることが認められた。
固定化酵素と非固定化酵素との熱的安定度の比較をアセ
テート緩衝液中７０°Ｃで加熱することによって試験し
た。試料を一定間隔で採取し、その活性を調べた。固定
化酵素は１時間後にその初期活性の１９％を示したが、
非結合活性は２０分後に実質的に活性を示さなかった。
さらに、固定化酵素と非結合酵素との比較試験を生成条
件下で行なった。この目的のために、０．１Ｍ酢酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ４、７５）中のセロビオースの１０
％の溶液中で反応させた。
６０時間反応後に、非結合セロビオースはもはや活性を
示さなかったが、本発明のキャリアーに結合した固定化
酵素はその初期活性の９５％を保持した。キャリアーと
して珪砂に結合した固定化酵素は非結合酵素と同じ活性
挙動を示した。１１８時間の反応後に、天然酵素はグル
コースをり、Ｓｇ／ｌ生成したが、本発明の固定化酵素
はグルコースな２４．２ｇ／ｆＬ生成した。また珪砂に
結合した酵素はグルコースを２　、６　ｇ／ｌ生成した
。
さらに、ポリアクリルオキシランを主成分とする酵素用
の市販のキャリアー［ニーパーキット（Ｅｕｐｅｒｇｉ
ｔ）　Ｃ］に結合した同じ酵素を用いて比較実験を実施
した。なお、該キャリアーのエポキシ官能基は酵素と直
接結合することができる。酵素と新規キャリアーとの結
合は、過剰の酵素を加えない場合には蛋白質濃度とは関
係なしに９０乃至９５％に達した。これに反して、エポ
キシ官能基を有する市販の製品の場合には、結合する酵
素の割合は酵素の濃度に依存する。本発明のキャリアー
の場合にはキャリアー１ｇ当り蛋白質１８０ｍｇまで結
合することができるが、市販品の場４合にはキャリアー
１ｇ当り酵素４０ｍｇＬか結合できない。さらに、市販
のキャリアーに結合された酵素の活性は初期活性のわず
か６０％であるが、本発明のキャリアーを用いた場合に
は初期活性が実質的に減少しないことが観察された。
［実施例２］ 実施例１記載の方法により前処理され活性化されたシリ
カ粒子を０．１Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）中の
様々な量のグルコースイソメラーゼと反応させた。この
目的のために、キャリアー０．５ｇと酵素溶液５ｍＭと
をそれぞれ反応させ、−夜機械的に攪拌した。酵素溶液
は未知源からの不活性蛋白質で汚染されていた。使用量
および測定結果を下記第２表に示す。
第２表 試験　キャリアーの量　Ａ　Ｂ　Ｃ 番号　（ｇ　）　（ｍｇ）　（ｍｇ）　（＋ｏｇ）１　
０．５　２５　１．２　２３．８ ２　０．５　１００　３８　８４ ３　０．５　１５０　８４　８８　１ ４　０．５　３００　１９７　１０３ ただし第２表において、Ａ、Ｂおよびｃ　ｔ−ｈ下記の
蛋白質量である。
Ａ；総蛋白質 Ｂ；上澄み液中の蛋白質 Ｃ；キャリアー上結合した蛋白質 上澄み液およびそれぞれの固定化酵素の活性を定量した
。測定結果を下記第３表に示す。
第３表 試験　（Ａ）　（Ｂ）　（Ａ−Ｂ）　（Ｃ）　残留活性
番号　値（％） １　４．５　０　４．５　４．８　１０８２　１８　Ｂ
、３　１１．７　１０．８　９２３　２７　１１．８　
１５．４　１４．０　９１４　５４　３４．８　１９．
２　１４．３　７５ただし第３表において、（Ａ）、Ｃ
Ｂ）、（Ａ　−Ｂ）、（Ｃ）およびｒ残留活性値１は下
記の値を意味する。
（Ａ）；使用単位 （Ｂ）；上澄み液中の単位 （Ａ−Ｂ）；理論的に結合した単位 （Ｃ）；キャリアー上の単位 残留活性値；（Ｃ）Ｘ１００ （Ａ）−（Ｂ） なお、上記単位は１０分以内に４０’（！で蛋白質１ｇ
当り生成したグルコースのミリモルと定義する。
上記結果は、キャリアーは外来の蛋白質をかなりの量含
んでいたが、各試料の残留活性値は７５％以上であるこ
とを示した。このことは、蛋白質は新規キャリアーによ
って不活性化されることなく、基質に対して有効に残存
すること、および酵素が非活性蛋白質で高度に汚染され
ていたにもかかわらず、良好な結果が得られたことを示
す。試料番号３は、活性と残留活性値間の最良の妥協値
を示すものであるので試料番号３を用し）てさらに実験
を実施した。
固定化酵素の活性を実質的に過剰量のフルクト−ス中に
生成したグルコースの量を測定することによって決定し
た。グルコースオキシダーゼを用いてグルコースを酸化
してグルコネートを生成さ−せ、生成した過酸化水素を
カタラーゼによって分解した。酸素を１時間試料中を通
過させ、ついで生成したグルコン酸を水酸化ナトリウム
溶液で中和した。ついで、試料をＡＴＰの存在下で燐酸
化し、酵素グルコースイソメラーゼの作用により異性化
した。生成したグルコース−６−燐酸をグルコース−６
−燐酸脱水素酵素により酸化し、ベーリンガーｅ　マフ
　ハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　
）のグルコース−フルクトース用ＵＶ法によって、ＮＡ
ＤＰの存在量から定量した。
出　願　人　レドコ◆エヌ・ブイ 化　理　人　弁理士　柳川泰男

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １０２０乃至１２０ｇｍの粒度をもつ略球状の合成珪酸
    カルシウムを酸で加水分解して得られた１、５乃至８０
    　ｐｍ＋７）平均粒度、１．３乃至３ｃｒｎ″／ｇの見
    掛粒子容積および２５０乃至８００ｒｎ’／ｇの比表面
    積をもつ略球状の無定形シリカ粒子よりなる無機キャリ
    アーに二官能性スペーサーを介してアミノ基によって共
    有結合している固定化酵素。 ２゜前記キャリアーが３−アミノプロピルトリエトキシ
    シラン（ＡＰＴＳ）で処理されたシリカ粒子よりなるこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の固定化酵素
    。 ３゜前記キャリアーがグルタルアルデヒドで処理された
    シリカ粒子よりなることを特徴とする特許請求の範囲第
    １項記載記載の固定化酵素。 ４゜２０乃至１２０７ｈｍの粒度なもつ略球状の合成珪
    酸カルシウムを酸で加水分解して得られた１５乃至８０
    ｐｍの平均粒度、１．３乃至３ｃｍ’／ｇの見掛粒子容
    積および２５０乃至８００ｒｎ’／ｇの比表面積を有す
    る略球状の無定形シリカ粒子を用意し、次いで上記シリ
    カ粒子を３−アミノプロピルトリエトキシシラン（△Ｐ
    ＴＳ）、グルタルアルデヒドおよび酵素で処理すること
    を特徴とする二官能性スペーサーを介してアミン基によ
    って無機担体に共有結合された固定化酵素の製造方法。 ５゜前記酵素がセロビアーゼまたはグルコースイソメラ
    ーゼであることを特徴とする特許請求の範囲第４項記載
    の製造方法。 ６．２０乃至１２０４ｍの粒度をもつ略球状の合成珪酸
    カルシウムを酸で加水分解して得られた１５乃至８０ｐ
    ｍの平均粒度、１．３乃至３ｃｒｎ”７ｇの見掛粒子容
    積および２５０乃至８００ｒｎ’／ｇの比表面積をもつ
    略球状の無定型シリカ粒子よりなる無機キャリアーに二
    官能性スペーサーを介してアミン基によって共有結合さ
    れている固定化セロビアーゼを用意し、該固定化セロビ
    アーゼを処理してグルコースを生成させ、次いで該グル
    コースな回収することを特徴とするセロビオースからグ
    ルコースの製造方法。 ７゜２０乃至１２０７Ｌｍの粒度をもっ略球状の合成珪
    酸カルシウムを酸で加水分解して得られた１、５乃至８
    ０ｇｍの平均粒度、１．３乃至３ｃｍ’／ｇの見掛粒子
    容積および２５０乃至８００ｒｎ’／ｇの比表面積を有
    する略球状の無定型シリカ粒子よりなる無機キャリアー
    に二官能性スペーサーを介してアミノ基によって共有結
    合された固定化グルコースイソメラーゼを用意し、該固
    定化グルコースイソメラーゼを処理してフルクトースを
    生成させ、次いで該フルクトースを回収することを特徴
    とするグルコースからフルクトースの製、遣方法。
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