FI62139C - Foerfarande foer framstaellning av ett vattenoloesligt enzympreparat - Google Patents

Description

. ί

ΓΒΐ m.KUULUTUSIULKAISU ,0i7Q

IBJ Π1) utlAGGNfNGSSKRIFT 6213 9 c Patentti myönnetty TO II 1922 <St) -IV14, 9/02, 9/92 SUOMI—FINLAND (21) ΚΜ«ηΐ^·«*ι·—Piemewetam* 781821 (22) Hakemliptlvt — AraMuiInftdag 07.06.78 ^ ^ (23) AlkupUvi—GlKljh«t*d«f 07.06.78 (41) Tullut JulklMlal — BIMt df«itll( 11,12.78

FaUiiUI- j& rekisteri hali itu· /44) Nlfotvikst panon )a kuut|ulkalaun p»m. —

Patent- och registerstyrelaen Anaekan utlacd och utl.ikrtftan pubifcarad 30.07.82 (32)(33)(31) Pyydetty atuolkaui-Be|«rd prtaritat 10.06.77

Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken lyskland(DE) P 2726188.7 (71) Kali-Chemie Aktiengesellschaft, Postfach 220, D-3000 Hannover,

Saksan Liittotasavalta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (72) Gunter Weidenbach, Hannover, Dirk Bonse, Arpke, Saksan Liittotasa-valta-Förbundsrepubliken Tyskland(DE) (7*0 Oy Borenius & Co Ab (5*0 Menetelmä veteen liukenemattoman entsyymipreparaatin valmistamiseksi _______- Förfarande för framställning av ett vattenolösligt enzympreparat

Keksinnön kohteena on menetelmä veteen liukenemattoman entsyymipre- ~ paraatin valmistamiseksi, jonka menetelmän mukaan epäorgaaninen kan- ( taja, jolla on funktionaalisia ryhmiä kovalenssisidoksen muodostamista varten entsyymin kanssa, saatetaan kosketukseen entsyymiliuoksen kanssa, saatetaan entsyymi sinänsä tunnetulla tavalla sitoutumaan kova-lenttisesti kantajalle ja eristetään saatu entsyymipreparaatti.

On ennestään tunnettua immobilisoida entsyymejä orgaanisiin tai epäorgaanisiin kantajiin siten, että ne tulevat veteen liukenemattomik- 1 si, ja että niitä voidaan käyttää uudelleen jatkuvissa valmistusmenetelmissä. Orgaanisilla materiaaleilla (esim. selluloosalla, ; nylonilla, polyakryyliamidilla) on kantajina huomattavia haittoja, < koska niiden mekaaninen stabiliteetti on riittämätön, liuottimet < voivat vaikuttaa haitallisesti niihin, ne ovat herkkiä vaihteleville > pH-arvoille ja ionipitoisuuksille, ja ne osittain turmeltuvat mik- ’ robien vaikutuksesta niin, että entsyymin sitoutuminen niihin voi heikentyä.

Tästä syystä on kantajina ehdotettu käytettäviksi epäorgaanisia aineita, joihin entsyymi saatetaan sitoutumaan adsorptiivisesti kuten US-patonttijulkaisun 2 717 852 mukaan tai kovalenttisesti kuten US- < i 2 62139 patenttijulkaisussa 3 519 538 on esitetty. Valittu sitomistapa riippuu entsyymin tyypistä ja sen käyttöolosuhteista sekä substraatin laadusta. Jos esim. substraatin suolakonsentraatio on suuri, ei adsorbtiomenetelmää voida käyttää, koska adsorboitunut entsyymimole-kyyli voi desorboitua. Tästä syystä sovelletaan edullisemmin entsyymin kovalenttista sitomista kantajaan. Kantajan pinnassa on tällöin oltava spesifisiä funktionaalisia ryhmiä, jotka mahdollistavat entsyymin sitoutumisen. Koska kantajassa useimmin ei ole tällaisia funktionaalisia ryhmiä, on kantajan pintaa esikäsiteltävä. Niinpä on FR-patenttijulkaisusta 2 020 527 tunnettua päällystää epäorgaaninen materiaali silaaneilla, jolloin pintaan saadaan orgaanisia funktionaalisia ryhmiä (esim. alkyyliamiinia), jotka orgaanisen aineen kanssa muodostavat kovalenssisidoksen. On myös kokeiltu epäorgaanisen kantajan käsittelyä sulfuryylikloridilla, tionyyliklori-dilla tai syanuurikloridilla. Lisäksi on,kuten US-patenttijulkaisusta 3 821 083 ilmenee,mahdollista päällystää kantajan pinta veteen liukenemattomalla polymeerillä, jossa on vapaita funktionaalisia ryhmiä, jolloin voidaan käyttää esim. polyakroleiinia, jossa on 10...70 % vapaita aldehydiryhmiä, monomeeristen molekyylien lukumäärästä laskettuna .

Epäorgaanisen kantajan materiaalina on ehdotettu käytettäväksi alumiinioksidia, nikkelioksidia, rautaoksidia, titaanioksidia, zirko-niumoksidia, hydroksyyliapatiittia, silikaatteja ja huokoista lasia, joiden materiaalien huokosten rakenteen ansiosta entsyymi ja substraatti voivat tunkeutua kantajan sisäpintoihin. Näiden materiaalien muista halutuista ominaisuuksista, esim. huokosten optimaalisesta jakautumasta ja pinnan suuruudesta, on kuitenkin olemassa sangen erilaisia tietoja.

Minkään edellä mainitun kantajan avulla ei ole ollut mahdollista sitoa entsyymejä siten, että niiden spesifinen aktiivisuus olisi samaa suuruusluokkaa kuin niiden spesifinen aktiivisuus vapaina, riippumatta käytetystä sidostyypistä. Julkaisussa D.L.Latique (Immobilized Enzymes for Industrial Reactors, London 1975, s. 27) esitettyjen tietojen perusteella esiintyy parhaimmissakin sitoutu-misoiosuhtoissa enintään vain 80 % kantajaan sijoitetusta entsyymistä aktiivisena.

3 62139

Keksinnön tehtävänä on näin ollen parantaa tunnettuja mentelmiä veteen liukenemattomien entsyymipreparaattien valmistamiseksi siten, että mahdollisimman vähän entsyymiä käyttäen saavutetaan maksimaa-lisesti aktiivinen preparaatti.

Tämä tehtävä ratkaistaan keksinnön mukaan siten, että ensin kantajat, joiden yleisimmät huokosten halkaisijat eroavat toisistaan, saatetaan kosketukseen sellaisten entsyymiliuosten kanssa, joiden entsyymi-konsentraatiot eroavat toisistaan, saatetaan entsyymi sitoutumaan kantajalle, eristetään entsyymipreparaatit, määritetään niiden aktiivisuus ja valitaan käytetyistä erilaisista kantajista se kantaja, jolla on sellainen yleisin huokosten halkaisija, että kantaja huolimatta sille sidotun entsyymin määrästä on tuottanut sen preparaatin, jonka aktiivisuus on suurin, ja tämän jälkeen saatetaan näin valittu kantaja kosketukseen entsyymiliuosten kanssa, joiden entsyymipitoisuudet eroavat toisistaan, saatetaan entsyymi sitoutumaan kantajalle, eristetään entsyymipreparaatit, määritetään niiden aktiivisuus ja spesifinen aktiivisuus ja valitaan käytetyistä erilaisista entsyymi-liuoksista se, joka on tuottanut sen preparaatin, jonka aktiivisuus on suurin ja jonka spesifinen aktiivisuus on sama kuin vapaassa tilassa olevan entsyymin spesifinen aktiivisuus tai lähellä tätä aktiivisuutta .

Keksinnön mukaan varustetaan ensin tunnettuja menetelmiä soveltaen kantajat, joilla on eri suuret yleisimmät huokosten halkaisijat, kytkentäaineilla, jotka sitoutuvat riittävästi kiinni sekä kantajaan, varsinkin muodostaen kantajan kanssa kovalenssisidoksen, että myös kykenevät muodostamaan kovalenssisidoksen entsyymin kanssa. Käyttö-kelpoisimpana menetelmänä on aikaisemmin epäorgaanisten kantajien yhteydessä osoittautunut silanointi, mutta voidaan myös käyttää muita kytkentäaineita, kuten edellä jo mainittiin. Kantajassa olevien kytkentäkohtien lukumäärän on oltava riittävän suuri, ja tärrä lukumäärä riippuu laajalti kantajan pinnasta.

Täten esikäsiteltyjä kantajia käsitellään tämän jälkeen eri suurilla entsyymimäärillä saattamalla kantajat kosketukseen konsentraatiol-taan erilaisten entsyymiliuosten kanssa, minkä jälkeen tunnettuja menetelmiä soveltaen aikaansaadaan entsyymin kovalenttinen sitoutuminen kytkentäkohtaan ja täten kantajaan. Kun täten saatujen preparaattien 4 62139 aktiivisuus on määritetty osoittautuu, että riippumatta preparaattiin sitoutuneesta entsyymimäärästä riippuu aktiviisuus yleisimmin esiintyvästä huokosten halkaisijasta, jolloin aktiivisuuskäyrällä on mak-simikohta. Lisäksi on osoittautunut, että kantajan raekoko ei sanottavasti vaikuta maksimin sijoittumiseen, mutta vaikuttaa mahdollisesti sen absoluuttiseen arvoon. Kantimen raekoolla on näin ollen keksinnön mukaan vain rajoittunut merkitys, ja tämä raekoko riippuu laajalti ajatellusta käyttötarkoituksesta, ja esim. substraatin viskositeetista, menetelmän olosuhteista, jne.

Tällä tavoin saatuihin yleisimmin esiintyvän huokosten halkaisijan suhteen optimaalisiin kantajiin lisätään tämän jälkeen jälleen eri suuria entsyymimääriä. Tällöin osoittautuu, että määrättyjä entsyymi-konsentraatioita käytettäessä saadaan preparaatteja, joiden spesifinen aktiivisuus on lähellä entsyymin spesifistä aktiivisuutta vapaana, tai jopa saavuttaa tämän aktiivisuuden, joten toisin sanoen preparaatin suhteellinen aktiivisuus saavuttaa arvon 100 %.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä on siis kysymys kaksivaiheisesta valintamenetelmästä, toisin sanoen menetelmästä, jonka avulla useista huokosten halkaisijaltaan kysymykseen tulevista kantajista ja useista entsyymikonsentraatioltaan kysymykseen tulevista entsyymiliuoksista valitaan se kantaja ja se entsyymikonsentraatio, jotka tuottavat pienimmällä mahdollisella entsyymipanoksella preparaatin, jolla on suurin mahdollinen aktiviteetti.

Jos keksinnön mukaisesti useita kantajia, joiden yleisimmät huokosten halkaisijat eroavat toisistaan,saatetaan erikseen kosketukseen ensin sellaisen entsyymiliuoksen kanssa, jonka konsentraatio on kaikkia kantajia varten sama, ja sitten toistetaan tämä operaatio samoilla kantajilla mutta sellaisten entsyymiliuosten kanssa, joiden konsentraatiot eroavat ensimmäisen liuoksen konsentraatiosta, määritetään entsyymipreparaattien absoluuttinen aktiivisuus toisin sanoen aktiivisuus entsyymipreparaattigrammaa kohti, ja verrataan aktiivisuuksia keskenään, huomataan, että riippumatta käytetyn entsyymiliuoksen konsentraatiosta aina saman yleisimmän huokosten halkaisijan omaava kantaja on tuottanut aktiivisimman preparaatin.

On kuitenkin myös osoittautunut, päinvastoin kuin mitä oli odotetta- 5 62139 vissa nimittäin että entsyymipreparaatin aktiivisuus nousisi entsyymiliuoksen konsentraation noustessa, että todellisuudessa entsyymiliuoksen tietyn konsentraation jälkeen konsentraation nousu ei enää tuota enemmän sitoutunutta entsyymiä eikä välttämättä suurempaa aktiivisuutta.

Tämä seikka on erityisen ilmeistä kun keksinnön mukaisesti saatetaan optimaaliseksi havaittu kantaja kosketukseen eri konsentraation omaavien entsyymiliuosten kanssa, määritetään saatujen entsyymipre-paraattien absoluuttinen aktiivisuus ja spesifinen aktiivisuus, eli aktiivisuus entsyymimilligrammaa kohti, ja verrataan saatuja arvoja keskenään. Tällöin osoittautuu ensin, että preparaattien absoluuttinen aktiivisuus myös nousee, mutta että se tietyn konsentraation jälkeen jää samaksi. Jokainen konsentraation korotus yli tämän näin havaitun arvon on näin ollen entsyymin haaskausta. Tämä on ristiriidassa yleiseen kokemukseen, joka osoittaa että "enemmällä saadaan enemmän".

On edelleen osoittautunut, että entsyymiliuosten alhaisilla konsen-traatioilla sidottu entsyymi on yhtä aktiivinen kuin entsyymi vapaassa tilassa, toisin sanoen sidotun entsyymin spesifinen aktiivisuus on sama kuin vapaan entsyymin ja entsyymipreparaatin suhteellinen aktiivisuus on 100 %. Kun konsentraatiota korotetaan putoaa tietystä konsentraatiosta lähtien spesifinen aktiivisuus nopeasti ja relatiivinen aktiivisuus on pienempi kuin 100 %, t.s. yhä suurempi osa sidotusta entsyymistä on inaktiivisessa muodossa.

Käytettäessä Si02~geelistä valmistettuja kantajia voidaan keksinnön mukaan saada optimaalisia kantajia siten, että sen jälkeen, kun geelin Na20:na laskettu alkalipitoisuus on säädetty arvoon 0.1...0,5 paino-% kuiva-aineen painosta, ja geelin tultua kuivatuksi sitä hehkutetaan 5...10 tuntia vesihöyrypitoisessa ilmavirrassa, jonka lämpötila on 400...850 °C, sopivasti 570 ...750 °C.

Kuivaus tapahtuu edullisimmin vesihöyryn kyllästämässä ilmassa, jonka lämpötila on 180...200 °C. Hehkuttamiseen voidaan puolestaan menestyksellisesti käyttää vesihöyrypitoista ilmavirtaa, jonka suhteellinen kosteus on 40...80 %.

Täten valmistetun kantajan yleisin huokosten halkaisija on 17,5...

6 62139 300 nm, sopivasti 25...60 nm, ja parhaiten noin 34 nm.

Keksinnön mukaista immobilisoimismenetelmää voidaan soveltaa kaikkien teknisesti ja analyyttisesti tärkeiden entsyymien yhteydessä, joista esimerkkeinä mainittakoon hydrolaasit (esim. amylaasi, glykosidaasi, proteaasi), eksidoreduktaasit (glukoosioksidaasi, katalaasi), iso-meraasit (glukoosi-isomeraasi), transferaasit (dekstraanisakkaraasi).

Mikäli entsyyminä on amyloglukosidaasi, jonka spesifinen aktiivisuus vapaana on 10...15 yksikköä/mg, saadaan optimaalinen preparaatti saattamalla optimaalinen kantaja kosketukseen liuoksen kanssa, joka sisältää 25...75 mg, sopivasti 50 mg amyloglukosidaasia kantajan grammaa kohden.

Mikäli entsyyminä on glukoosi-isomeraasi, jonka spesifinen aktiivisuus vapaana on 50...70 yksikköä/mg, saadaan optimaalinen preparaatti saattamalla optimaalinen kantaja kosketukseen liuoksen kanssa, joka kantajan grammaa kohden sisältää 20...50 mg, sopivasti 25 mg glukoosi-isomeraas ia.

Seuraavat esimerkit havainnollistavat keksintöä.

Esimerkki 1

Kantajan 1 valmistamiseksi kuivattiin 180 °C:ssa kolme tuntia vesihöyryn kyllästämässä ilmassa natriumsilikaattiliuoksesta rikkihapon avulla saostettua SiC^-geeliä, jonka Na20-pitoisuus oli 0,3 paino-%.

1 kg tätä materiaalia hehkutettiin kuusi tuntia 730 °C:ssa 2 1/min suuruisen ilmavirran avulla, jonka suhteellinen kosteus oli 80 %.

Tämän käsittelyn jälkeen oli SiC^n yleisin huokosten halkaisija 140 nm. Kantaja 1 jaettiin seulomalla fraktioihin. Jatkovalmistuk-sessa käytettiin fraktioita, jonka partikkelikoko oli 0,25...0,5 mm.

150 g tätä kantajafraktiota keitettiin 8 tuntia palautustislausta käyttäen 4 l:ssa liuosta, jossa oli 10 % )f - aminopropyylitrietoksi-silaania bentseenissä, minkä jälkeen jäähdytettiin ja pestiin kolmasti kulloinkin 1000 ml :11a bentseeniä ja 1000 ml :11a asetonia. Liuotin haihdutettiin huoneenlämmössä ja alipaineessa, minkä jälkeen kantaja pestiin kahdesti 0,05 m fosfaattipuskurilla (pH = 7) ja kolmasti 7 62139 kahteen kertaan tislatulla vedellä. Tämän jälkeen kuivattiin P20,-:n avulla alipaineessa. C- ja N-määrityksen keskiarvon perusteella laskettuna oli kantajassa 1 0,13 m.ekv. silaania/g.

lOg tätä kantajaa suspendoitiin 20 ml:aan 0,05 m fosfaattipuskuri-liuosta (pH = 7), jossa oli 1 g amyloglukosidaasia (Merck 1330). Amyloglugosidaasin aktiivisuus oli 11,75 U/mg, jolloin aktiivisuuden yksikkömittana U pidettiin entsyymimäärä, jonka avulla muodostuu 1 yU moolia glukoosia/min 25 °C:ssa. Suspensio pidettiin 20 minuuttia alipaineessa, minkä jälkeen ilmastettiin uudelleen ja 2 tunnin kuluttua pidettiin vielä 20 minuuttia alipaineessa. Kantaja erotettiin suodattamalla liuoksesta 4 tunnin kuluttua, minkä jälkeen pestiin kolmasti kahteen kertaan tislatulla vedellä ja lopuksi kolmasti 0,01 m fosfaattipuskurilla (pH = 5). Valmista tuotetta 1.1 säilytettiin fosfaattipuskurissa (pH = 5) 4 °C:ssa. C-N-analyysin perusteella proteiinipitoisuus oli 16,5 mg/g.

Näytteen 1.2 valmistamiseksi suspendoitiin 10 g silanoitua kantajaa 1 20 ml:aan 0,05 m fosfaattipuskuriliuosta (pH = 7), jossa oli 0,5 g amyloglukosidaasia (Merck 1330). Tämän jälkeen käsittelyä jatkettiin samalla tavoin kuin näytettä 1.1 käsiteltäessä. Valmiin näytteen 1.2 C-N-analyysin mukaan proteiinipitoisuus oli 9,0 mg/g.

Esimerkki 2

Kantajan 2 valmistamiseksi kuivattiin esimerkissä 1 selitetyllä tavalla natriumsilikaattiliuoksesta rikkihapon avulla saostettua Si02~geeliä, jonka Na20-pitoisuus oli 0,3 paino-%. 1 kg tätä materiaalia hehkutettiin kuusi tuntia 680 °C:ssa 2 1/min suuruisen ilmavirran avulla, jonka suhteellinen kosteus oli 80 %. Tämän käsittelyn jälkeen oli Si02:n yleisin huokosten halkaisija 34 nm.

Kantaja 2 jaettiin seulomalla fraktioihin. Valmistusta jatkettiin käyttämällä fraktiota 0,25...0,5 mm.

150 g tätä kantajafraktiota käsiteltiin' esimerkissä 1 selitetyllä tavalla 4 1:11a^-aminopropyylitrietoksisilaanin 10 % bentseeni-liuosta.

Kantajassa 2 oli C- ja N-määritysten keskiarvon perusteella lasket- 8 62139 tuna 0,19 m.ekv. silaania/g.

10 g tätä kantajaa suspendoitiin 20 ml: aan 0,05 m fosfaattipus-kuriliuosta (pH = 7), jossa oli 1 g amyloglukosidaasia (Merck 1330), minkä jälkeen valmistusta jatkettiin esimerkissä 1 selitetyllä tavalla. Valmiin näytteen 2.1 proteiinipitoisuus oli C-N-analyysin perusteella 30,8 mg/g.

Toinen 10 g suuruinen erä silanoitua kantajaa 2 suspendoitiin 20 ml:aan 0,05 m fosfaattipuskuriliuosta (pH = 7), jossa oli 0,5 g amyloglukosidaasia (Merck 1330) ja käsittelyä jatkettiin esimerkissä 1 näytteen 1.2 yhteydessä selitetyllä tavalla.

Valmiin näytteen 2.2 C-N-analyysin perusteella proteiinipitoisuus 011 17,4 mg/g.

Esimerkki 3

Kantajan 3 valmistamiseksi kuivattiin esimerkissä 1 selitetyllä tavalla natriumsilikaattiliuoksesta rikkihapon avulla saostettua Si02~geeliä, jonka Na^O-pitoisuus oli 0,3 paino-%. 1 kg tätä materiaalia hehkutettiin 6 tuntia 640 °C:ssa 2 1/min suuruisen ilmavirran avulla, jonka suhteellinen kosteuspitoisuus oli 60 %.

Tämän käsittelyn jälkeen SiOjtn yleisin huokosten halkaisija oli 18 nm. Kantaja 3 jaettiin seulomalla fraktioihin. Jatkovalmistuk-sessa käytettiin fraktiota 0,25...0,50 mm.

150 g tätä kantajafraktiota käsiteltiin esimerkissä 1 selitetyllä tavalla kahdeksan tuntia 4 1:11a -aminopropyylitrietoksisilaanin 10 % bentseeniliuosta.

Kantajassa 3 oli C- ja N-määritysten keskiarvon perusteella laskettuna 0,51 m.ekv. silaania/g.

10 g tätä kantajaa suspendoitiin 20 mlraan 0,05 m fosfaattipuskuri-liuosta (pH = 7), jossa oli 1 g amyloglukosidaasia (Merck 1330), minkä jälkeen käsittelyä jatkettiin esimerkissä 1 selitetyllä tavalla.

Valmiin näytteen 3.1 proteiinipitoisuus oli C-N-analyysin perus- 9 62139 teella 26,2 mg/g.

Toinen 10 g suuruinen erä silanoitua kantajaa 3 suspendoitiin 20 ml:aan 0,05 fosfaattipuskuriliuosta (pH = 7), jossa oli 0,5 g amyloglukosidaasia (Merck 1330), ja käsittelyä jatkettiin esimerkin 1 näytteen 1.2 yhteydessä selitetyllä tavalla.

Valmiin näytteen 3.2 C-N-analyysin perusteella proteiinipitoisuus oli 12,7 mg/g.

Esimerkki 4

Sen havainnon todistamiseksi, että kytkentäaineella ei ole mitään vaikutusta preparaatin aktiivisuuteen, erotettiin seulomalla kantajasta 2, jonka yleisin huokosten halkaisija oli 34 nm, fraktio 0,25...0,5 mm, minkä jälkeen 50 g tätä fraktiota sekoitettiin 5 minuuttia 500 ml:ssa glutaaridialdehydin 12,5-prosenttisessa vesiliuoksessa huoneenlämmössä. Tämän jälkeen lisättiin 500 ml kyllästettyä NH^Cl-liuosta. Sekoitettiin 4 tuntia huoneenlämmössä, minkä jälkeen näyte pestiin vedellä puhtaaksi kloridista ja kuivattiin P^O^in avulla alipaineessa.

10 g tätä kantajaa suspendoitiin 20 ml:aan 0,05 n fosfaattipuskuri-liuosta (pH = 7), jossa oli 1 g amyloglukosidaasia (Merck 1330), - minkä jälkeen käsittelyä jatkettiin esimerkissä 1 selitetyllä tavalla.

Valmiin näytteen 4.1 proteiinipitoisuus oli C-N- analyysin perus-„ teella 29,8 mg/g.

Toinen 10 g suuruinen erä kantajaa 1 suspendoitiin 20 ml:aan 0,05 m fosfaattipuskuriliuosta (pH = 7), jossa oli 0,5 g amyloglukosidiaa-sia (Merck 1330), minkä jälkeen käsittelyä jatkettiin esimerkissä 1 näytteen 1.2 yhteydessä selitetyllä tavalla.

Valmiin tuotteen 4.2 proteiinipitoisuus oli C-N-analyysin perusteella 17,9 mg.

Esimerkki 5 10 g kantajaa 1, jonka yleisin huokosten halkaisija oli 140 nm, 10 62139 suspendoitiin 40 ml:aan 0,05 m fosfaattipuskuriliuosta (pH = 7), jossa oli 0,5 g glukoosi-isomeraasiaCY.Takasaki, Agr.Biol.Chem. 33, nr 11 , 1527-1534 ( 1969 ) .

Reaktioaika huoneenlämmössä oli 60 minuuttia. Joka kymmenes minuutti reaktioastia evakuoitiin ja reaktion päätyttyä poistettiin jäljellä oleva liuos imemällä. Tämän jälkeen pestiin kolmasti vedellä ja 0,05 m fosfaattipuskurilla (pH = 7).

Valmiin näytteen 5.1 proteiinipitoisuus oli C-N-analyysin perusteella 4,8 mg/g.

Näytteen 5.2 valmistamiseksi suspendoitiin toinen 10 g suuruinen erä kantajaa 1 40 ml:aan 0,05 m fosfaattipuskuriliuosta (pH = 7), jossa oli 0,25 g glukoosi-isomeraasia. Tämän jälkeen käsittelyä jatkettiin samalla tavalla kuin näytettä 5.1 valmistettaessa.

Valmiin näytteen 5.2 proteiinipitoisuus oli C-N-analyysin perusteella 2,0 mg.

Esimerkki 6 10 g kantajaa 2, jonka yleisin huokosten halkaisija oli 34 nm, suspendoitiin 40 ml:aan 0,05 m fosfaattipuskuriliuosta (pH = 7), jossa 011 0,5 g glukoosi-isomeraasia.

Tämän jälkeen käsittelyä jatkettiin esimerkissä 5 selitetyllä tavalla. Valmiin näytteen 6.1 proteiinipitoisuus oli C-N-analyysin perusteella 22,0 mg.

Näytteen 6.2 valmistamiseksi suspendoitiin toinen 10 g suuruinen erä kantajaa 2 40 ml:aan 0,05 m fosfaattipuskuriliuosta (pH = 7), jossa oli 0,25 g glukoosi-isomeraasia. Tämän jälkeen käsittelyä jatkettiin esimerkissä 5 selitetyllä tavalla.

Valmiin näytteen 6.2 proteiinipitoisuus oli C-N-analyysin perusteella 10,2 mg/g.

62139 n

Esimerkki 7 10 g kantajaa 3, jonka yleisin huokosten halkaisija oli 18 nm, suspendoitiin 40 ml:aan 0,05 m fosfaattipuskuriliuosta (pH = 7), jossa oli 0,5 g glukoosi-isomeraasia.

Tämän jälkeen käsittelyä jatkettiin esimerkissä 5 selitetyllä tavalla. Valmiin näytteen 7.1 proteiinipitoisuus oli C-N-analyysin perusteella 11,2 mg/g.

Näytteen 7.2 valmistamiseksi suspendoitiin toinen 10 g suuruinen erä kantajaa 3 40 ml:aan 0,05 m fosfaattipuskuriliuosta (pH = 7), jossa 011 0,25 g glukoosi-isomeraasia.

Tämän jälkeen käsittelyä jatkettiin samalla tavalla kuin näytteen 5.1 yhteydessä on selitetty.

Valmiin näytteen 7.2 proteiinipitoisuus oli C-N-analyysin perusteella 5.1 mg/g.

Esimerkki 8 10 g esimerkin 4 mukaista kantajaa, jonka yleisin huokosten halkaisija oli 34 nm, ja joka oli käsitelty glutaaridialdehydin vesiliuoksella, suspendoitiin 40 ml:aan 0,05 m fosfaattipuskuriliuosta (pH = 7), jossa oli 0,5 g glukoosi-isomeraasia, minkä jälkeen käsittelyä jatkettiin esimerkissä 5 selitetyllä tavalla.

Valmiin näytteen 8.1 proteiinipitoisuus oli C-N-analyysin perusteella 21,3 mg/g.

Näytteen 8.2 valmistamiseksi suspendoitiin toinen 10 g suuruinen erä samaa kantajaa 40 mlraan 0,05 m fosfaattipuskuriliuosta (pH = 7), jossa oli 0,25 g glukoosi-isomeraasia, minkä jälkeen käsittelyä jatkettiin näytteen 5.1 yhteydessä selitetyllä tavalla.

Valmiin näytteen 8.2 proteiinipitoisuus oli C-N-analyysin perusteella 9,8 mg/g.

12 62139

Esimerkki 9

Esimerkeissä 1. ..4 selitettyjen näytteiden 1.1, 1.2; 2.1, 2.2; 3.1, 3.2; 4.1, 4.2 samoin kuin käytetyn entsyymin (amyloglukosidaasi,

Merck 1330) aktiivisuus määritettiin dinitrosalisyylihappomenetelmän mukaan (vrt. Rick,'W., Stegbauer, H.P. julkaisussa: Bergmeyer, H.U. "Methoden der Enzymatischen Analyse", Verlag.Chemie 1970, s. .848 ja seur.). Yksi aktiivisuusyksikkö (U) vastaa .sitä entsyymimäärää, joka inkubointiolosuhteissa vapauttaa 1/^ ekvivalentin pelkistäviä ryhmiä minuutissa (laskettu glukoosina).

Inkubointiolosuhteet 2 % substraattiliuosta (Zulkowsky-tärkkelys Merck 1257) 0,1 m ase-taattipuskurissa, pH = 5,0, 30 minuuttia, 25 °C.

Kantajaan sidotut näytteet suspendoitiin edellä mainituissa olosuhteissa 40 ml:n reaktoriin, jonka sekoitusnopeus oli 600 kierr/min (tuotteen muodostumisnopeus riippumaton sekoittamisnopeudesta).

Näytteiden proteiinipitoisuus määritettiin C-N-analyysin keskiarvojen perusteella. Kantajan yleisin huokosten halkaisija määritettiin huokosten jakautumasta, joka mitattiin suurpaineporosimetrin avulla.

Näytteiden 1...4 tulokset on yhteenvetona esitetty seuraavassa taulukossa 1. Käytetyt tunnusomaiset suureet määritellään seuraavasti:

Yleisin halkaisija D (nm)

Sitoutunut entsyymimäärä CE (mg entsyymiä/g kanninta)

Aktiivisuus U (yksiköitä/g/näytettä)

Spesifinen aktiivisuus immobili- u = U/pr/yksiköitä/mg entsyy- soidussa tilassa naiay

Spesifinen aktiivisuus vapaana Ugp (yksiköitä/mg entsyymiä)

Suhteellinen aktiivisuus Usuht = 100 Us TJ—

USF

13 62139

Taulukko 1 / Immobilisoitu amyloglukosidaasi

Yleisin Sitoutunut Aktiivisuus

Ns„rp huokos- entsyymi- y halkaisija määrä D CP U U U . . Ucr

E s suht SF

1.1 1400 16,5 98,4 5,96 51 11,75 1.2 9,0 100,5 11,16 95 2.1 340 30,8 208,8 6,77 58 2.2 17,4 203,9 11,71 100 3.1 180 26,2 150,0 5,72 49 3.2 12,7 149,5 11,77 100 4.1 340 29,8 199,7 6,70 57 4.2 17,9 209,4 11,70 100

Esimerkki 10

Esimerkeissä 5...8 kuvattujen näytteiden 5.1, 5.2; 6.1, 6.2; 7.1, 7.2; 8.1, 8.2 sekä käytetyn glukoosi-isomeraasin aktiivisuus määritettiin Takasaki-menetelmän mukaan (vrt. Y. Takasaki:

Agr. Biol. Chem. Voi.30, nr 12, 1247-1253, 1966 ja Z. Dische ja E. Borenfreund: J. Biol.Chem. 192, 583, 1951). Aktiivisuusyksikkö (U) on määritelty entsyymimääräksi, joka inkuboimisolosuhteissa muodostaa 1 mg fruktoosia.

Inkubointiolosuhteet

- Lämpötila 65 °C

Reaktioaika 1 h

Substraatti 0,1 m glukoosia x i^O (Merck 8342) 0,05 m fosfaatti- puskurissa, pH 8,0, jossa 0,0004 m MgSO^. ψ

Kantajaan sidotut näytteet suspendoitiin esimerkissä 9 selitetyllä tavalla standardiolosuhteiden vallitessa sekoitusreaktorin avulla.

Näytteiden proteiinipitoisuus määritettiin C-N-analyysin keskiarvojen perusteella.

Näytteiden 5...8 tulokset on yhteenvetona esitetty seuraavassa taulukossa 2. Käytettyjen tunnussuureiden määritelmä on esitetty esimerkissä 9.

14 62139

Taulukko 2 / Immobilisoitu glukoosi-isomeraasi

Yleisin Sitoutunut Aktiivisuus huokos- entsyymi- y halkaisija määrä D Cr U U U . .

E s suht Ugp 5.1 1400 4,8 115,4 24,0 41 58,9 5.2 2,0 117,3 58,7 99 6.1 340 22,0 558,5 25,4 43 6.2 10,2 556,1 54,5 93 7.1 180 11,2 291,0 26,0 44 7.2 5,1 292,3 57,3 97 8.1 340 21,2 543,2 25,5 43 8.2 9,8 544,0 55,5 94

Tulokset osoittavat: 1. Tutkittujen näytteiden aktiivisuus U läpäisee maksimin, joka riippuu kantajan yleisimmästä huokosten halkaisijasta.

2. Spesifinen aktiivisuus Ug riippuu sitoutuneesta entsyymimäärästä ja saavuttaa entsyymien määrätyllä konsentraatiolla Cp vapaana olevan entsyymin spesifisen aktiivisuuden Ugp niin, että Usuht = 100. Jos tämä entsyymimäärä ylitetään, laskee spesifinen aktiivisuus, jolloin tulo

Us x Cp pysyy vakiona.

3. Kantajan sitoma entsyymimäärä on yleisimmän huokosten halkaisijan funktio. Entsyymin ja kantajan muodostamalla järjestelmällä on maksimaalinen aktiivisuus mahdollisimman pienellä määrällä entsyymiä siinä tapauksessa, että optimaaliseen kantajaan, jonka yleisin huokosten halkaisija on 34 nm, on sitoutunut 17,4 mg amuloglukosidaasia/g, vast. 10,2 mg glukoosi-isomeraasia/g (näytteet 2.2, vast. 6.2).

4. Tutkittujen näytteiden sitoma entsyymimäärä ja aktiivisuus ovat riippumattomat kytkentäaineesta.

Entsyymin aiheuttamat kustannukset ovat huomattavan suuret ja nousevat erittäin voimakkaasti vaaditun puhtausasteen mukaan, joten näillä kustannuksilla on taloudelliselta kannalta huomattavan suuri merkitys. Keksinnön mukaisen menetelmän avulla on ensimmäisen kerran tullut mahdolliseksi käyttää teknisessä mittakaavassa myös kalliita entsyymejä, koska keksinnön mukaisen menetelmän ansiosta voidaan, käyttämällä keksinnön mukaista kantajaa optimoida maksimaalista aktiivisuutta varten tarvittava entsyymimäärä.

Claims (10)

15 62139

1. Menetelmä veteen liukenemattoman entsyymipreparaatin valmistamiseksi, jonka menetelmän mukaan epäorgaaninen kantaja, jolla on funktionaalisia ryhmiä kovalenssisidoksen muodostamista varten entsyymin kanssa, saatetaan kosketukseen entsyymiliuoksen kanssa, saatetaan entsyymi sinänsä tunnetulla tavalla sitoutumaan kovalenttisesti kantajalle ja eristetään saatu entsyymipreparaatti, tunnettu t siitä, että ensin kantajat, joiden yleisimmät huokosten halkaisijat eroavat toisistaan, saatetaan kosketukseen sellaisten entsyymiliuos-ten kanssa, joiden entsyymikonsentraatiot eroavat toisistaan, saatetaan entsyymi sitoutumaan kantajalle, eristetään entsyymipreparaa-tit, määritetään niiden aktiivisuus ja valitaan käytetyistä erilaisista kantajista se kantaja, jolla on sellainen yleisin huokosten halkaisija, että kantaja huolimatta sille sidotun entsyymin määrästä on tuottanut sen preparaatin, jonka aktiivisuus on suurin, ja tämän jälkeen saatetaan näin valittu kantaja kosketukseen entsyymiliuosten kanssa, joiden entsyymipitoisuudet eroavat toisistaan, saatetaan entsyymi sitoutumaan kantajalle, eristetään entsyymipreparaatit, määritetään niiden aktiivisuus ja spesifinen aktiivisuus ja valitaan käytetyistä erilaisista entsyymiliuoksista se, joka on tuottanut sen preparaatin, jonka aktiivisuus on suurin ja jonka spesifinen aktiivisuus on sama kuin vapaassa tilassa olevan entsyymin spesifinen aktiivisuus tai lähellä tätä aktiivisuutta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kantajana käytetään Si02-geeliä, jota sen jälkeen, kun geelin alkalipitoisuus laskettuna Na^Osna on säädetty 0,1...0,5 paino-prosenttiin ja geeli on kuivattu, hehkutetaan 5...10 tuntia vesihöyrypitoisessa ilmavirrassa, jonka lämpötila on 400...850 oc, edullisesti 570...750 OC.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kuivaus suoritetaan vesihöyryn kyllästämässä ilmassa, jonka lämpötila on 180...200 <>C.

4. Patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hehkuttaminen suoritetaan vesihöyrypitoisessa ilmavirrassa, jonka suhteellinen kosteus on 40...80%. 62139 16

5. Patenttivaatimuksen 1...4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyyminä käytetään amyloglukosidaasia.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytettäessä amyloglukosidaasia, jonka spesifinen aktiivisuus vapaana on noin 10...15 yksikköä/mg, saatetaan kantaja kosketukseen liuoksen kanssa, joka sisältää 25...75 mg, edullisesti 50 mg amyloglukosidaasia/g kantajaa.

7. Patenttivaatimusten 1...4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyyminä käytetään glukoosi-isomeraasia.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytettäessä glukoosi-isomeraasia, jonka spesifinen aktiivisuus vapaana on noin 50...70 yksikköä/mg, saatetaan kantaja kosketukseen liuoksen kanssa, joka sisältää 20...50 mg, edullisesti 25 mg glukoosi-isomeraasia/g kantajaa. %

1. Förfarande för framställning av ett vattenolösligt enzymprepa-rat, enligt vilket man bringar en oorganisk bärare, som har funktio-nella grupper för kovalent bindning av ett enzym, i kontakt med en enzymlösning, bringar enzymet att bindas kovalent vid bäraren pä i och för sig känt sätt samt isolerar det erhällna enzympreparatet, kännetecknat därav, att man först bringar bärare, vilkas allmännaste pordiametrar skiljer sig frän varandra, i kontakt med enzymlösningar, vilkas enzymkoncentrationer skiljer sig frin varandra, bringar enzymet att bindas vid bäraren, isolerar enzymprepa-raten, bestämmer deras aktivitet och väljer av de använda olika bärarna den bärare, som har en s&dan allmännaste pordiameter att bäraren oberoende av mängden enzym, som bund its vid densamma, har givit det preparat som har den högsta aktiviteten, och därefter bringar den sä valda bäraren i kontakt med enzymlösningar, vilkas enzymhalter skiljer sig frän varandra, bringar enzymet att bindas vid bäraren, isolerar enzympreparaten, bestämmer deras aktivitet och