DE2726188B1 - Verfahren zur Herstellung eines wasserunloeslichen Enzympraeparats - Google Patents

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen Enzympräparates.

Es ist bekannt Enzyme durch Bindung an organische oder anorganische Träger zu immobilisieren, d. h. bo wasserunlöslich zu machen, so daß diese wiederverwendbar sind und in kontinuierlich arbeitenden Verfahren eingesetzt werden können.

Organische Materialien (z. B. Zellulose, Nylon, Polyacrylamid) weisen als Träger erhebliche Nachteile auf, da sie keine ausreichende mechanische Stabilität besitzen, vom Lösungsmittel angegriffen werden können, gegenüber wechselnden pH-Werten und Ionenstärken empfindlich sind und teilweise zum Mikrobenbefall neigen, wodurch die Bindung zum Enyzm gelöst werden kann.

Deshalb wurden anorganische Substanzen als Träger vorgeschlagen, auf denen Enzyme adsorptiv oder kovalent gebunden werden. Die bevorzugte Art der Bindung hängt von der Art und den Einsatzbedingungen des Enzyms und der Beschaffenheit des Substrates ab. Liegt das Substrat beispielsweise in einer starken Salzkonzentration vor, ist die Adsorptionsmethode nicht anwendbar, da eine Desorption der adsorbierten Enzymmoleküle möglich ist Deshalb wird die kovalente Bindung des Enzyms an den Träger vorgezogen. Die Trägeroberfläche muß dann spezifische funktioneile Gruppen enthalten, die eine Bindung des Enzyms gewährleisten. Da der Träger diese funktionellen Gruppen in den meisten Fällen nicht besitzt ist eine Vorbehandlung der Oberfläche erforderlich. Bekannt ist beispielsweise die Belegung von anorganischem Material mit Silanen, wodurch die Oberfläche organisch funktioneile Gruppen (z. B. Alkylamin) erhält die mit organischer Substanz eine kovalente Bindung eingehen. Weiterhin ist die Behandlung anorganischer Träger mit Sulfurylchlorid, Thionylchlorid oder Cyanurchlorid erprobt worden. Außerdem ist es möglich, die Trägeroberfläche mit einem wasserunlöslichen Polymer zu überziehen, das freie funktioneile Gruppen aufweist wie z. B. Polyacrolein, das zwischen 10 und 70% freie Aldehydgruppen, bezogen auf die Anzahl der monomeren Moleküle, besitzt.

Als Material für anorganische Träger wurden Aluminiumoxide, Nickeloxid, Eisenoxid, Titanoxid, Zirkonoxid, Hydroxylapatit Silikate und poröses Glas vorgeschlagen, deren Porenstruktur die Zugänglichkeit des Enzyms und des Substrates zur inneren Oberfläche gewährleistet, über deren weitere wünschenswerte Eigenschaften, wie z. B. optimale Porenverteilung und Oberflächengröße jedoch sehr unterschiedliche Angaben vorliegen.

Mit keinem der genannten Träger gelang es, unabhängig von der angewandten Bindungsart Enzyme so zu immobilisieren, daß ihre spezifische Aktivität der spezifischen Aktivität im freien Zustand nahekommt Nach Angaben von D.L Latigue (Immobilized Enzymes for Industrial Reactors, London 1975, S. 127) liegen auch unter besten Immobilisierungsbedingungen nur maximal 80% des auf dem Träger aufgebrachten Enzyms in aktiver Form vor.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die bekannten Verfahren zur Herstellung wasserunlöslicher Enzympräparate, bei denen man einen anorganischen Träger mit funktionellen Gruppen zur kovalenten Bindung mit einer Enzymlösung in Berührung bringt so zu verbessern, daß bei minimalem Enzymaufwand ein maximal aktives Präparat erhalten wird.

Die Lösung dieser Aufgabe gelingt gemäß der Erfindung dadurch, daß man einen Träger mit einem solchen häufigsten Porendurchmesser auswählt der ungeachtet der an ihn gebundenen Enzymmenge ein Präparat mit maximaler Aktivität ergibt und daß man den so ausgewählten Träger mit einer Enzymlösung in Berührung bringt die nur so viel Enzym enthält daß die spezifische Aktivität des damit hergestellten Präparats die spezifische Aktivität des Enzyms in freiem Zustand erreicht oder ihr nahekommt

Bei der Lehre nach der Erfindung werden zunächst Träger mit unterschiedlichen häufigsten Porendurchmessern nach bekannten Methoden mit Kupplungsmit-

teln versehen, die sowohl ausreichend fest am Träger haften, insbesondere eine kovalente Bindung zum Träger eingehen, als auch zu einer kovalenten Bindung mit dem Enzym befähigt sind. Als gebräuchlichste Methode hat sich in der Vergangenheit für anorganische Träger die Silanisierung durchgesetzt, es sind aber, wie schon ausgeführt, auch andere Kupplungsmittel einsetzbar. Die Anzahl der Kupplungsglieder am Träger muß hinreichend groß sein und hängt weitgehend von der Oberfläche des Trägers ab.

Den so vorbehandelten Trägern werden dann unterschiedliche Enzymmengen angeboten, indem man sie mit Enzymlösungen unterschiedlicher Konzentration in Berührung bringt und nach bekannten Methoden eine kovalente Bindung des Enzyms zum Kupplungsglied und damit zum Träger herstellt Nach Bestimmung der Aktivität der so erhaltenen Präparate zeigt sich, daß die Aktivität der Präparate ungeachtet der an sie gebundenen Enzymmenge von dem häufigsten Porendurchmesser abhängt und ein Maximum durchläuft. Es hat sich dabei außerdem gezeigt, daß die Korngröße des Trägers für die Lage des Maximums unerheblich ist und allenfalls dessen Absolutwert beeinflußt Die Korngröße des Trägers hat daher für die Lehre nach der Erfindung nur eine untergeordnete Bedeutung und richtet sich weitgehend nach dem vorgesehenen Einsatzzweck, beispielsweise der Viskosität des Substrats, der Verfahrensführung und dgl.

Dem auf diese Weise hinsichtlich des häufigsten Porendurchmessers ermittelten optimalen Träger werden dann wiederum unterschiedliche Mengen Enzym angeboten. Dabei zeigt sich, daß bei bestimmten Enzymkonzentrationen Präparate erhalten werden, deren spezifische Aktivität der spezifischen Aktivität des Enzyms im freien Zustand nahekommt oder diese erreicht, d.h. die relative Aktivität des Präparats erreicht einen Wert von 100%.

Bei Trägern, die aus einem SiO₂-GeI hergestellt sind, läßt sich gemäß Weiterbildung der Erfindung der optimale Träger erhalten, wenn man das Gel nach Einstellung eines Alkaligehalts, berechnet als Na₂O und bezogen auf Trockensubstanz, von 0,1 bis 0,5 Gew.-%, und Trocknung, 5 bis 10 Stunden in einem wasserdampfhaltigen Luftstrom bei 40O⁰C bis 850⁰C, vorzugsweise 570°C bis 75O⁰C, glüht

Zweckmäßigerweise erfolgt die Trocknung in wasserdampfgesättigter Luft bei 180° C bis 200⁰C. Für das Glühen hat sich ein wasserdampfhaltiger Luftstrom mit einer relativen Feuchte von 40 bis 80% als vorteilhaft erwiesen.

Der so hergestellte Träger weist einen häufigsten Porendurchmesser von 175 bis 3000 A, vorzugsweise 250 bis 600 A, optimalerweise etwa 340 A, auf.

Das erfindungsgemäße Immobilisierungsverfahren ist für alle technisch und analytisch wichtigen Enzyme anwendbar, beispielsweise für Hydrolasen (ζ. B. Amylasen, Glycosidasen, Proteasen), Oxydoreductasen (GIucoseoxidase, Katalase), Isomerasen (Glucoseisomerase), Transferasen (Dextransucrase).

Für den Fall, daß das Enzym Amyloglucosidase ist, welche im freien Zustand eine spezifische Aktivität von 10 bis 15 Einheiten/mg aufweist, wird das optimale Präparat dann erhalten, wenn man den optimalen Träger mit einer Lösung in Berührung bringt, die 25 bis 75 mg, vorzugsweise 50 mg, Amyloglucosidase pro Gramm Träger enthält

Wird als Enzym Glucoseisomerase eingesetzt, die im freien Zustand eine spezifische Aktivität von 50—70 Einheiten/mg aufweist, erhält man das optimale Präparat, wenn der optimale Träger mit einer Lösung in Berührung gebracht wird, die 20—50 mg, vorzugsweise 25 mg Glucoseisomerase pro Gramm Träger enthält.
■-) Die nachfolgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1 Zur Herstellung des Trägers 1 wurde ein aus

ίο Natriumsilikatlösung mit Schwefelsäure gefälltes SiO₂-GeI mit einem Na₂O-Gehalt von 0,3 Gew.-% bei 180⁰C in wasserdampfgesättigter Luft drei Stunden getrocknet 1 kg dieses Materials wurde sechs Stunden bei 730⁰C in einem Luftstrom von 2 l/min, der einen relativen Feuchtigkeitsgehalt von 80% aufwies, geglüht. Nach dieser Behandlung hatte das SiO₂ einen häufigsten Porendurchmesser von 1400 Ä. Der Träger 1 wurde durch Siebung in Fraktionen getrennt. Die weitere Präparation erfolgte mit der Fraktion 0,25 bis 0,5 mm.

150 g dieser Trägerfraktion wurde 8 Stunden mit 4 1 einer 10%igen Lösung von y-Aminopropyltriäthoxysilan in Benzol am Rückfluß gekocht und nach Abkühlung mit je 1000 ml Benzol und mit je 1000 ml Aceton dreimal gewaschen. Nach Abdampfen des Lösungsmittels bei Raumtemperatur im Vakuum wurde der Träger zweimal mit 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) und dreimal mit bidest. Wasser gewaschen. Die Trocknung erfolgte über P₂O5 im Vakuum. Berechnet auf Basis des Mittelwertes der C- und N-Bestimmung enthielt der

Träger 1 0,13 mÄqSilan/g.

10 g dieses Trägers wurden in 20 ml Lösung von 1 g Amyloglucosidase in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) suspendiert Die Aktivität der Amyloglucosidase betrug 11,75 U/mg, wobei als Aktivitätsmaß U die Bildung von 1 μ Mol Glucose/min bei 25° C benutzt wurde. Die Suspension wurde 20 Minuten unter Vakuum gehalten, wieder belüftet und nach zwei Stunden nochmals für 20 Minuten evakuiert. Nach vier Stunden erfolgte die Trennung von Träger und Lösung durch Filtration, anschließend dreimaliger Waschung mit bidest. Wasser und schließlich eine dreimalige Waschung mit 0,01 m Phosphatpuffer (pH 5). Die fertige Probe 1.1 wurde in Phosphatpuffer (pH 5) bei 4° C aufbewahrt. Die C-N-Analyse ergab einen Proteingehalt von 16,5 mg/g.

Zur Herstellung der Probe 1.2 wurden 10 g des silanisierten Trägers 1 in 20 ml von 0,5 g Amyloglucosidase in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) suspendiert. Die weitere Verfahrensweise entsprach der Präparation der Probe 1.1. Die C-N-Analyse der fertigen Probe 1.2 ergab

so einen Proteingehalt von 9,0 mg/g.

Beispiel 2

Zur Herstellung des Trägers 2 wurde ein aus Natriumsilikatlösung mit Schwefelsäure gefälltes SiO₂-GeI mit einem Na^-Gehalt von 0,3 Gew.-%, wie im Beispiel 1 beschrieben, getrocknet. 1 kg dieses Materials wurde sechs Stunden bei 680° C in einem Luftraum von 2 l/min, der einen relativen Feuchtigkeitsgehalt von 80% aufwies, geglüht. Nach dieser

bo Behandlung hatte das SiO₂ einen häufigsten Porendurchmesser von 340 A. Der Träger 2 wurde durch Siebung in Fraktionen getrennt. Die weitere Präparation erfolgte mit der Fraktion 0,25 bis 0,5 mm.
150 g dieser Trägerfraktion wurde acht Stunden mit

es 4 1 einer 10%igen Lösung von y-Aminopropyltriäthoxysilan in Benzol entsprechend dem im Beispiel 1 angegebenen Verfahren behandelt.
Der Träger 2 enthielt, berechnet auf Basis des

Mittelwertes der C- und N-Bestimmung, 0,19 m Äq Silan/g.

10 g dieses Trägers wurden in 20 ml Lösung von 1 g Amyloglucosidase in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) suspendiert und, wie im Beispiel t beschrieben, > präpariert Die fertige Probe 2.1 wies nach der C-N-Analyse einen Proteingehalt von 30,8 mg/g auf.

Weitere 10 g des silanisierten Trägers 2 wurden in 20 ml Lösung von 0,5 g Amyloglucosidase in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) suspendiert und, wie im Beispiel ι ο 1 (Probe 12) beschrieben, behandelt.

Die C-N-Analyse der fertigen Probe 2.2 ergab einen Proteingehalt von 17,4 mg/g.

Beispiel 3 _r

Zur Herstellung des Trägers 3 wurde ein aus Natriumsilikatlösung mit Schwefelsäure gefälltes SiO₂-GeI mit einem Na₂O-GeIIaIt von 0,3 Gew.-%, wie im Beispiel 1 beschrieben, getrocknet 1 kg dieses Materials wurde sechs Stunden bei 640° C in einem > <> Luftstrom von 2 l/min, der einen relativen Feuchtigkeitsgehalt von 60% aufwies, geglüht. Nach dieser Behandlung hatte das SiO₂ einen häufigsten Porendurchmesser von 180 A. Der Träger 3 wurde durch Siebung in Fraktionen getrennt Die weitere Präpara- 2"> tion erfolgte mit der Fraktion 025 bis 0,50 mm.

150 g dieser Trägerfraktion wurde acht Stunden mit 41 einer 10%igen Lösung von y-Aminopropyltriäthoxysilan in Benzol entsprechend dem im Beispiel 1 angegebenen Verfahren behandelt. jo

Der Träger 3 enthielt, berechnet auf Basis des Mittelwertes der C- und N-Bestimmung 0,51 m Äq Silan/g.

10 g dieses Trägers wurden in 20 ml Lösung von 1 g Amyloglucosidase in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) j5 suspendiert und, wie im Beispiel 1 beschrieben, präpariert

Die fertige Probe 3.1 wies nach der C-N-Analyse einen Proteingehalt von 262 mg/g auf.

Weitere 10 g des silanisierten Trägers 3 wurden in 20 ml Lösung von 0,5 g Amyloglucosidase in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) suspendiert und, wie im Beispiel 1 (Probe 12) beschrieben, behandelt.

Die C-N-Analyse der fertigen Probe 32 ergab einen Proteingehalt von 12,7 mg/g.

Beispiel 4

Um den Nachweis zu führen, daß das Kupplungsmittel auf die Aktivität des Präparates keinen Einfluß hat, wurde von dem Träger 2 (häufigster Porendurchmesser 340 A) die Fraktion 025—0,5 mm ausgesiebt und davon 50 g in 500 ml 12,5%iger wäßriger Glutardialdehydlösung 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt Anschließend erfolgte ein Zusatz von 500 ml gesättigter NH₄Cl-LoSmIg. Nach vierstündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Probe mit Wasser bis zur Chloridfreiheit gewaschen und über P₂Os im Vakuum getrocknet

10 g dieses Trägers wurden in 20 ml Lösung von 1 g bo Amyloglucosidase in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) suspendiert und wie im Beispiel 1 beschrieben, präpariert

Die fertige Probe 4.1 wies nach der C-N-Analyse einen Proteingehalt von 29,8 mg/g auf.

Weitere 10 g des Trägers 2 wurden in 20 ml Lösung von 0,5 g Amyloglucosidase in 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7) suspenidert und wie im Beispiel 1 (Probe 1.2) beschrieben, behandelt. Die C-N-Analyse der fertigen Probe 42 ergab einen Proteingehalt von 17,9 mg.

Beispiel 5

10 g des Trägers 1 (häufigster Porendurchmesser 1400 A) wurden in 40 ml einer 0,05 m Phosphatpufferlösung (pH 7), die 0,5 g Glucoseisomerase (Y. T a k a s a ki, Agr. Biol. Chem. 33, Nr. 11, 1527-1534 [1969]) enthielt, suspendiert.

Die Reaktionszeit betrug bei Raumtemperatur 30 Minuten. Nach jeweils 10 Minuten wurde das Reaktionsgefäß evakuiert und nach Beendigung der Reaktion die Restlösung abgesaugt. Dann erfolgten 3 Waschungen mit Wasser und 0,05 m Phosphatpuffer (pH 7).

Die fertige Probe 5.1 wies nach der C-N-Analyse einen Proteingehalt von 4,8 mg/g auf.

Zur Herstellung der Probe 52 wurden weitere 10 g des Trägers 1 in 40 ml einer 0,05 m Phosphatpufferlösung (pH 7), die 0,25 g Glucoseisomerase enthielt, suspendiert. Die weitere Verfahrensweise entsprach der Präparation 5.1.

Die C-N-Analyse der fertigen Probe 5.2 ergab einen Proteingehalt von 2,0 mg/g.

Beispiel 6

10 g des Trägers 2 (häufigster Porendurchmesser 340 A) wurden in 40 ml einer 0,05 m Phosphatpufferlösung (pH 7), die 0,5 g Glucoseisomerase enthielt, suspenidert.

Die weitere Behandlung entsprach Beispiel 5. Die fertige Probe 6.1 wies nach der C-N-Analyse einen Proteingehalt von 22,0 mg/g auf.

Zur Herstellung der Probe 6.2 wurden weitere 10 g des Trägers 2 in 40 ml einer 0,05 m Phosphatpufferlösung (pH 7), die 025 g Glucoseisomerase enthielt, suspendiert. Die weitere Behandlung entsprach Beispiel 5. Die C-N-Analyse der fertigen Probe 62 ergab einen Proteingehalt von 102 mg/g.

Beispiel 7

10 g des Trägers 3 (häufigster Porendurchmesser 180 A) wurden in 40 ml einer 0,05 m Phosphatpufferlösung (pH 7), die 0,5 g Glucoseisomerase enthielt, suspendiert

Die weitere Behandlung entsprach Beispiel 5. Die fertige Probe 7.1 wies nach der C-N-Analyse einen Proteingehalt von 112 mg/g auf.

Zur Herstellung der Probe 72 wurden weitere 10 g des Trägers 3 in 40 ml einer 0,05 m Phosphatpufferlösung (pH 7), die 025 g Glucoseisomerase enthielt, suspendiert. Die weitere Verfahrensweise entsprach der Präparation 5.1.

Die C-N-Analyse der fertigen Probe 72 ergab einen Proteingehalt von 5,1 mg/g.

Beispiel 8

10 g des im Beispiel 4 genannten Trägers (häufigster Porendurchmesser 340A, behandelt mit wäßriger Glutardialdehydlösung) wurden in 40 ml einer 0,05 m Phosphatpufferlösung (pH 7), die 0,5 g Glucoseisomerase enthielt, suspendiert Die weitete Behandlung entsprach Beispiel 5. Die fertige Probe 8.1 wies nach der C-N-Analyse einen Proteingehalt von 213 mg/g auf.

Zur Herstellung der Probe 82 wurden weitere 10 g des gleichen Trägers in 40 ml einer 0,05 m Phosphatpufferlösung (pH 7), die 025 g Glucoseisomerase enthielt, suspendiert Die weitere Verfahrensweise entsprach der

Präparation 5.1. Die C-N-Analyse der fertigen Probe 8.2 ergab einen Proteingehalt von 9,8 mg/g.

Beispiel 9

Die Aktivität der in den Beispielen 1 bis 4 beschriebenen Präparate 1.1,1.2; 2.1,22; 3.1,32; 4.1,4.2 sowie die des zur Fixierung eingesetzten Enzyms (Amyioglucosidase) wurde nach der Dinitrosalizylsäuremethode (vergl. Rick, W, Stegbauer, H. P. in: Bergmeyer, H. U. »Meth. d. Enzymatischen Analy- ι ο se«, Verlag Chemie 1970 S. 848 ff) bestimmt Eine Aktivitätseinheit (U) entspricht der Enzymmenge, die unter Inkubationsbedingungen 1 μ Äquivalent reduzierende Gruppen (berechnet als Glucose) pro Minute freisetzt

Inkubationsbedingungen

2%ige Substratlösung (Zulkowsky-Stärke) in 0,1 m Acetatpuffer pH 5,0,30 Minuten, 25° C
Trägerfixierte Präparate wurden unter o. a. Bedin-

Tabelle 1

(Fixierte Amyioglucosidase)

gungen in einem 40 ml Reaktor bei einer Rührgeschwindigkeit von 600 min-' (Produktbildungsrate unabhängig von Rührgeschwindigkeit) suspendiert.

Der Proteingehalt der Präparate wurde auf Basis der Mittelwerte der C-N-Bestimmung ermittelt. Der häufigste Porendurchmesser der Träger wurde aus der Porenverteilung (gemessen mit Hochdruckporosimeter) bestimmt.

In der folgenden Tabelle 1 sind die Ergebnisse der Proben 1 —4 zusammengestellt. Die verwendeten Kenngrößen werden wie folgt definiert:

Häufigster
Porendurchmesser
Enzymaufnahme
Aktivität
Spez. Aktivität
Spez. Aktivität
L freien Zustand

D (A)

Cf (mg Enzym/g Träger)

U (Units/g Probe)

Us i//CE(Units/mg Enzym)

Usf (Units/mg Enzym)

Relative Aktivität i7_re/= 100 ·

Probe

Häufigster Porendurchm.

Enzymaufnahme

Aktivität

U_n;

1.1 1.2	1400	16,5 9,0	98,4 100,5	5,96 11,16	51 95
2.1 2.2	340	30,8 17,4	208,8 203,9	6,77 11,71	58 100
3.1 3.2	180	26,2 12,7	150,0 149,5	5,72 11,77	49 100
4.1 4.2	340	29,8 17,9	199,7 209,4	6,70 11,70	57 100

11,75

Beispiel 10

Die Aktivität der in den Beispielen 5—8 beschriebenen Präparate 5.1,52; 6.1,62; 7.1, 72; 8.1,8.2 sowie die der zur Fixierung eingesetzten Glucoseisomerase wurde nach der Takasaki-Methode (vgL Y. Takasaki: Agr. Biol. Chem. Vol. 30, Nr. 12,1247-1253,1966 und Z. Dische und E. Borenf reund: J. BioL Chem. 192, 583, 1951) bestimmt Eine Aktivitätseinheit (U) ist definiert als die Enzymmenge, die unter Inkubationsbedingungen 1 mg Fructose bildet

Inkubationsbedingungen

Temperatur 65° C
Reaktionszeit 1 h

Tabelle 2

(Fixierte Glucoseisomerase)

Substrat 0,1 m Glucose ^H₂O (Merck 8342) in

0,05 m Phosphatpuffer, pH 8,0 mit

0,0004 m MgSO₄

Die trägerfixierten Präparate wurden wie im Beispiel 9 beschrieben unter Standardbedingungen im Rührreaktor suspendiert

Der Proteingehalt der Präparate wurde auf Basis der Mittelwerte der C-N-Bestimmung ermittelt

In der folgenden Tabelle 2 sind die Ergebnisse der Proben 5—8 zusammengestellt.

Die Definition der verwendeten Kenngrößen ist im Beispiel 9 angegeben.

Probe

Häufigster Porendurchm.

Enzymaufnahme

Aktivität

Ure,

USF

5.1 5.2	1400	4,8 2,0	115,4 117,3	24,0 58,7	41 99
6.1 6.2	340	22,0 10,2	558,5 556,1	25,4 54,5	43 93
7.1 7.2	180	11,2 5.1	291,0 292,3	26,0 57,3	44 97
8.1 8.2	340	21,3 9,8	543,2 544,0	25,5 55,5	43 94

58,9

809 535/456

Die Ergebnisse zeigen:

1. Die Aktivität U der untersuchten Proben verläuft über ein Maximum, das vom häufigsten Porendurchmesser des Trägers abhängig ist.

2. Die spezifische Aktivität U_s hängt von der Enzymaufnahme ab und erreicht bei einer bestimmten Enzymkonzentration Cfden Wert der Aktivität des Enzyms im freien Zustand U_Sf, so daß Urei = 100 wird. Wird diese Enzymmenge überschritten, sinkt die spezifische Aktivität ab, wobei das Produkt aus U_sund c_fc konstant bleibt.

3. Die vom Träger aufgenommene Enzymmenge ist eine Funktion des häufigsten Porendurchmessers.
Das System Enzym/Träger weist maximale Aktivität bei kleinstmöglichem Enzymeinsatz auf, wenn

der optimale Träger 2 (häufigster Porendurchmesser 340 Ä) 17,4 mg Amyloglucosidase/g bzw. 10,2 mg Glucoseisomerase/g aufgenommen hat (Proben 22 bzw. 62).

■-> 4. Enzymaufnahme und Aktivität der untersuchten Proben sind vom Kupplungsmittel unabhängig.

Da die Enzymkosten beträchtlich sind und mit dem geforderten Reinheitsgrad sehr stark ansteigen, für den

ίο wirtschaftlichen Einsatz also eine erhebliche Rolle spielen, ist mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erstmals die Möglichkeit geschaffen worden, auch teure Enzyme technisch anzuwenden, da es das Verfahren gestattet, bei Einsatz des erfindungsgemäßen Trägers,

π die für maximale Aktivität benötigte Enzymmenge zu optimieren.

Claims (8)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines wasserunlöslichen Enzympräparates, bei dem man einen anorga- ■> nischen Träger mit funktionellen Gruppen zur kovalenten Bindung mit einer Lösung eines Enzyms in Berührung bringt, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Träger mit einem solchen häufigsten Porendurchmesser auswählt, der unge- ι ο achtet der an ihn gebundenen Enzymmenge ein Präparat mit maximaler Aktivität ergibt, und daß man den so ausgewählten Träger mit einer Enzymlösung in Berührung bringt, die nur so viel Enzym enthält, daß die spezifische Aktivität des r> damit hergestellten Präparats die spezifische Aktivität des Enzyms in freiem Zustand erreicht oder ihr nahekommt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Träger aus einem Si(VGeI auswählt, das nach Einstellung eines Alkaligehalts, berechnet als Na₂O, auf 0,1 bis 0,5 Gew.-% und Trocknung 5—10 Stunden in einem wasserdampf haltigen Luftstrom bei 400⁰C bis 850⁰C, vorzugsweise 570° C bis 750° C, geglüht ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Trocknung in wasserdampfgesättigter Luft bei 180°C bis 200°C erfolgt

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Glühen in einem jo wasserdampfhaltigen Luftstrom mit einer relativen Feuchte von 40 bis 80% erfolgt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzym Amyloglucosidase verwendet wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet daß bei Verwendung einer Amyloglucosidase mit einer spezifischen Aktivität im freien Zustand von etwa 10 bis 15 Einheiten/mg der Träger mit einer Lösung in Berührung gebracht wird, die 25 bis 75 mg, vorzugsweise 50 mg, Amyloglucosidase pro Gramm Träger enthält.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzym Glucoseisomerase verwendet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet daß bei Verwendung einer Glucoseisomerase mit einer spezifischen Aktivität im freien Zustand von etwa 50 bis 70 Einheiten/mg der Träger mit einer Lösung in Berührung gebracht wird, die 20 bis 50 mg, vorzugsweise 25 mg, Glucoseisomerase pro Gramm Träger enthält