Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nierozpuszczalnego w wodzie preparatu enzymu.Znane jest unieruchamianie enzymów przez wia¬ zanie z organicznymi albo nieorganicznymi nosni¬ kami, to znaczy przeprowadzanie w stan nieroz¬ puszczalny w wodzie, tak ze nadaja sie one do po¬ nownego uzycia i moga byc zastosowane w proce¬ sach przeprowadzanych w sposób ciagly.Materialy organiczne, np. celuloza, nylon, poli- akryloamid, wykazuja jako nosniki znaczne wady, poniewaz nie maja one wystarczajacej trwalosci mechanicznej, moga byc atakowane przez rozpusz¬ czalnik, sa wrazliwe na zmienne wartosci pH i mo¬ cy jonów i czesciowo maja sklonnosc do opanowa¬ nia przez mikroby, przez co moze rozluznic sie wiazanie z enzymem.Zaproponowano dlatego substancje nieorganiczne jako nosniki, na których enzymy moga byc zwiaza¬ ne adsórpcyjnie albo kowalencyjnie. Korzystny ro¬ dzaj wiazania zalezy od rodzaju i warunków zasto¬ sowania enzymu i stanu substratu. Jesli substrat wystepuje np. w silnym stezeniu soli, to nie moz¬ na stosowac metody adsorpcyjnej, poniewaz mozli- Tva jest desorpcja adsoribowanych czasteczek enzy¬ mu. Dlatego pierwszenstwo daje sie wiazaniu ko¬ walencyjnemu enzymu z nosnikiem. Powierzchnia nosnika musi wtenczas zawierac specyficzne grupy funkcyjne, które zapewniaja zwiazanie enzymu.Poniewaz nosnik w wiekszosci przypadków nie ma tych grup funkcyjnych, potrzebna jest obróbka wstepna powierzchni. Znane jest np. pokrywanie materialu nieorganicznego silanami, przez co po¬ wierzchnia otrzymuje organicznie funkcyjne grupy, np. alkiloamine, które wchodza z substancja orga¬ niczna w wiazanie kowalencyjne.Wypróbowano równiez obróbke nosników nieor¬ ganicznych za pomoca chlorku sulfurylu, chlorku tionylu albo chlorku cyjarnurowego. Oprócz tego mozliwe jest równiez powlekanie powierzchni nos¬ nika za pomoca polimeru nierozpuszczalnego w wo¬ dzie, który zawiera wolne grupy funkcyjne, jak np. poliakroleina, która ma 10—70% wolnych grup alde¬ hydowych, w odniesieniu do liczby czasteczek mo- nomerowych.Jako material dla nosników nieorganicznych pro¬ ponowano tlenki glinu, tlenek niklu, tlenek zelaza, tlenek tytanu, tlenek cyrkonu, hydroksyloaipatyt, krzemiany i szklo porowate, których porowata struktura zapewnia dostepnosc enzymu i substratu do powierzchni wewnetrznej. O ich dalszych poza¬ danych wlasciwosciach, jak np. optymalny podzial porów i wielkosc powierzchni istnieja jednakze bardzo rózne dane.Nie udalo sie za pomoca zadnego z wymienionych nosników, niezaleznie od zastosowanego rodzaju wiazania, unieruchomic enzymów tak, aby ich spe¬ cyficzna aktywnosc byla zblizona do specyficznej aktywnosci w stanie wolnym. Wedlug danych D. L. Laligue, Immobilized Enzymes for Industrial Reactors, Londyn 1975, str. 127, równiez w najlep- 126 637126 637 3 4 szych warunkach unieruchomienia tylko maksymal¬ nie 80% enzymu naniesionego na nosniku wystepu¬ je w postaci aktywnej.Zadaniem wynalazku jest dlatego takie ulepszenie znanych sposobów wytwarzania nierozpuszczalnych w wodzie preparatów enzymów, w których nieorga¬ niczny nosnik z grupami funkcyjnymi do wiazania kowalencyjnego doprowadza sie do zetkniecia z roztworem enzymu, aby przy minimalnym nakla¬ dzie enzymu otrzymac maksymalnie aktywny pre¬ parat.Rozwiazanie tego zadania wedlug wynalazku po¬ lega j^Jk^m^zenosnik z zelu Si02 o najczestszej sreAnatc&lrf^n^^^^teplijacej w zakresie 18—140 ran, koijzystnie wynoszacej »4 nm, poddaje sie reakcji z roztworem zawierajacym 20—50 mg na gram nos- iiilta,*l01&:ipM&i% 25 jnr, glikozoizomerazy o akityw- no%cC!SiKL2SSl?i'^H sianie wolnym wynoszacej okolo 50—70 jednostSk/mg, albo z roztworem zawie¬ rajacym 25—75 mg na gram nosnika, korzystnie 50 mg amyloglikozydazy "b aktywnosci specyficznej w stanie wolnym wynoszacej okolo 10—15 jednos¬ tek/mg.Wedlug wynalazku najpierw nosniki o róznych najczestszych srednicach porów zostaja zaopatrzone znanymi metodami w srodki sprzegania, które za¬ równo sa wystarczajaco silnie przyczepione do nos¬ nika, w szczególnosci wchodza w wiazanie kowalen¬ cyjne z nosnikiem, jak równiez sa zdolne do kowa¬ lencyjnego wiazania z enzymem. Jako najbardziej rozpowszechniona metoda przyjelo sie w przeszlo¬ sci dla nosników nieorganicznych silanowanie, moza jednak stosowac równiez inne srodki sprze¬ gania, jak to juz wywiedziono. Liczba czlonów sprzegania na nosniku musi byc wystarczajaco duza i zalezy w znacznej mierze od powierzchni nosnika.Do takich wstepnie obrabianych nosników do¬ daje sie nastepnie rózne ilosci enzymu, przy czym doprowadza sie je do zetkniecia z roztworami enzymu o róznym stezeniu i w znany sposób wy¬ twarza sie wiazanie kowalencyjne enzymu do czlonu sprzegania i tym samym do nosnika. Po oznaczeniu aktywnosci preparatów otrzymanych w ten sposób Okazuje sie, ze aktywnosc prepara¬ tów niezaleznie od zwiazanej z nimi ilosci enzymu zalezy od przewazajacej srednicy porów i przecho¬ dzi maksimum. Okazalo sie przy tym ponadto, ze wielkosc ziarna nosnika jest nieistotna dla poloze¬ nia maksimum i co najwyzej wplywa na jego war¬ tosc aibsolutna. Wielkosc ziarna nosnika ma dlate¬ go dla sposobu wedlug wynalazku tylko znaczenie podrzedne i jest dostosowana w znacznym stopniu do przewidywanego celu zastosowania, np. lepkosci suibstratu, przeprowadzenia procesu itp.Do ustalonego w ten sposób pod wzgledem prze¬ wazajacej srednicy porów optymalnego nosnika dodaje sie nastepnie znowu rózne ilosci enzymu.Okazuje sie przy tym, ze przy okreslonych ste¬ zeniach enzymu otrzymuje sie preparaty, których specyficzna aktywnosc dorównuje specyficznej aktywnosci enzymów w stanie wolnym albo ja osiaga, to znaczy wzgledna aktywnosc preparatu osiaga wartosc 100%.Korzystnie stosuje sde nosnik z zelu Si02, który po ustaleniu zawartosci alkaliów, w przeliczeniu na Na20 i w odniesieniu do suchej substancji, na wartosc 0,1—0,5% wagowych, i wysuszeniu, pra¬ zy sie w ciagu 5—10 godzin w zawierajacym pare wodna strumieniu powietrza w temperaturze 400°C—850°C, korzystnie 570°C—750°C.Suszenie przeprowadza sie korzystnie w powie¬ trzu nasyconym para wodna w temperaturze 180°C—200°C. Dla prazenia korzystny okazal sie io strumien powietrza, zawierajacy pare wodna, 0 wilgotnosci wzglednej 40—80%.Otrzymany w ten sposób nosnik ma przewazaja¬ ca srednice porów 18—140 -nm, korzystnie 25—60 nm, optymalnie okolo 34 nm.W przypadku, gdy enzym stanowi aniyloglikozy- daza, która w stanie wolnym ma aktywnosc wy¬ noszaca 10—15 jednostek/mg, otrzymuje sie prepa¬ rat optymalny wtenczas, jesli optymalny nosnik doprowadzi sie do zetkniecia z roztworem, który zawiera 25—75 mg, korzystnie 50 mg, amylogliko¬ zydazy na gram nosnika.Jesli jako enzym stosuje sie glikozoizomeraze, która w stanie wolnym ma specyficzna akitywnGis6 50—70 jednostek/mg, otrzymuje sie optymalny preparat, jesli optymalny nosnik doprowadza sie do zetkniecia z roztworem, który zawiera 20—5G mg, korzystnie 25 mg glikozoizomerazy na gram nosnika.Nastepujace przyklady wyjasniaja wynalazek.Przyklad I. W celu wytworzenia nosnika 1 zel Si02, stracony z roztworu krzemianu sodu za pomoca kwasu siarkowego, o zawantosci 0,3% wagowych Na20 suszono w powietrzu nasyconym para wodna w ciagu trzech godzin. 1 kg tego ma- terialu prazono w ciagu szesciu godzin w tempe¬ raturze 730°C w strumieniu powietrza 2 litry/min, który mial wzgledna zawartosc wilgoci 80%. Po tej obróbce Si02 mial przewazajaca srednice po¬ rów 140 nm. Nosnik 1 rozdzielono przez odsiewanie 40 na frakcje. Dalsze preparowanie przeprowadzono- z zastosowaniem frakcji 0,25—0,5 mm. 150 g tej frakcji nosnika gotowano w ciagu & godzin z 4 litrami 10% roztworu y-smimo^ocylo- trójetoksysiilanu w benzenie pod chlodnica zwrotna 45 i po oziebieniu przemyto trzykrotnie za pomoca po 1000 ml benzenu i po 1000 ml acetonu. Po od¬ parowaniu rozpuszczalnika w temperaturze poko¬ jowej pod zmniejszonym cisnieniem nosnik prze¬ mywano dwukrotnie za pomoca 0,5 m buforu fos- 50 foranowego (pH 7) i tonzytorotniie za pomoca wodjr podwójnie destylowanej. W przeliczeniu na pod¬ stawie wartosci sredniej oznaczenia C i N nosnik 1 zawieral 0,13 równowazników molowych silanu/g. g tego nosnika przeprowadzono w zawiesine/ 55 w 20 ml roztworu 1 g amyloglikozydazy (Merck 1330) w 0,05 m buforu fosforanowego (pH 7). Ak¬ tywnosc amyloglikozydazy wynosila 11,75 U/img„ przy czym jako miare aktywnosci U uzyto tworze¬ nie 1 mikromóla glikozy/min w temperaturze 25°C. 60 Zawiesine utrzymywano w ciagu 20 minut pod zmniejszonym cisnieniem, ponownie napowietrzano i po uplywie dwóch godzin jeszcze raz utirzymywa- no pod zmniejszonym cisnieniem w ciagu 20 mi¬ nut. Po uplywie czterech godzin przeprowadzono 65 rozdzielenie nosnika i roztworu przez saczenie,.126 637 6 nastepnie trzykrotne przemywanie za pomoca po¬ dwójnie destylowanej wody i wreszcie trzykrotne przemywanie za pomoca 0,01 m buforu fosforano¬ wego (pH 5). Gotowa próbke 1.1 przechowywano w buforze fosforanowym (pH 5) w temperaturze 4°C.Analiza C-N gotowej próbki wykazala zawar¬ tosc proteiny 9,0 mg/g.Przyklad II. W celu wytworzenia nosnika 2 wysuszono zel Si02, stracony z roztwcru krze¬ mianu sodu za pomoca kwasu siarkowego, o za¬ wartosci Na20 0,3% wagowych, jak opisano w przykladzie I. 1 kg tego materialu prazono w cia¬ gu szesciu godzin w temperaturze 680°C w stru¬ mieniu powietrza 2 litry/rnin, który mial zawartosc wzgledna wilgoci 80%. Po tej obróbce Si02 mial przewazajaca srednice porów 34 nm. Nosnia 2 rozdzielono na frakcje przez przesiewanie. Dalsze preparowanie przeprowadzono z zastosowaniem fraikcji 0,25—0,5 mm. 150 g tej frakcji nosndlka pod¬ dano obróbce w ciagu osmiu godzin za pomoca 4 litrów 10% roztworu y-aminopropylotrójetoksysi¬ lanu w benzenie w sposób opisany w przykladzie I.Nosnik 2 zawieral, w obliczeniu na podstawie wartosci sredniej oznaczenia C i N, 0,19 równowaz¬ ników molowych silanu/g. g tego nosnika przeprowadzono w zawiesine w 20 ml roztworu 1 g amyloglikozydazy (Merck 1330) w 0,05 m buforu fosforanowego opisano w przykladzie I, preparowano. Gotowa próbka 2.1 wykazywala wedlug analizy C-N za¬ wartosc proteiny 30,8 mg/g.Dalsze 10 g silanowanego nosnika 2 przeprowa¬ dzono w zawiesine w 2€ ml roztworu 0,5 g amylo¬ glikozydazy (Merck 1330) w 0,05 m buforze fosfora¬ nowym (pH 7) i poddano obróbce w sposób opisany w przykladzie I (próbka 1.2).Analiza C-N gotowej próbki wykazala zawar¬ tosc proteiny 17,4 mg/g.Przyklad III. W celu wytworzenia nosni¬ ka 3 wysuszono zel Si02, stracony z roztworu krzemianu sodu za pomoca kwasu siarkowego, o zawartosci Na20 0,3% wagowych, jak opisano w przykladzie I.- 1 kg tego materialu prazono w cia¬ gu szesciu godzin w temperaturze 640°C w stru¬ mieniu powietrza 2 litry/min, który miial wzgledna zawartosc wilgoci 60%. Po tej obróbce Si02 mial przewazajaca srednice porów 18 nim. Nosnik 3 rozdzielono na frakcje przez przesiewanie. Dalsze preparowanie przeprowadzono z zastosowaniem frakcji 0,25—0,50 mm. 150 g tej frakcji nosnika poddano obróbce w cia¬ gu osmiu godzin za pcmoca 4 litrów 10% roztworu -y-aminopropylotrójetoksysilanu w benzenie w spo¬ sób podany w przykladzie I.Nosnik 3 ; zawieral, w obliczeniu na podstawie wartosci sredniej oznaczenia C i N 0,51 równowaz¬ nika molowego silanu/g. g tego nosnika przeprowadzono w zawiesine w 20 ml roztworu 1 g amyloglikozydazy {Merck 1330) w 0,05: m buforu fosforanowego (pH 7) i pre¬ parowano w sposób opisany w przykladzie I.Gotowa próbka 3.1 wykazywala wedlug analizy C-N zawartosc proteiny 26J2 mg/g.Dalsze 10 g silanowanego nosnika 3 przeprowa¬ dzono w zawiesine w 20 ml roztworu 0,5 g amylo¬ glikozydazy (Merck 1330) w 0,05 i.i buforu fosfora¬ nowego (pH 7) i poddano obróbce w sposób opi¬ sany w przykladzie I (próbka 1.2).Analiza C-N gotowej próbki 3.2 wykazala za- * wartosc proteiny 12,7 mg/g.Przyklad IV. W celu wykazania, ze srodek sprzegania nie ma wplywu na aktywnosc prepara¬ tu, z nosnika 2 (przewazajaca srednica porów 34 nm) wysiano frakcje 0,25—0,5 mm i z tego 50 g mieszano w 500 ml 12,5% wodnego roztworu dwualdehydu glutarowego w ciagu 5 minut w tem¬ peraturze pokojowej. Nastepnie dodano 500 ml na¬ syconego roztworu NH4C1. Po czterogodzinnym mieszaniu w temperaturze pokojowej przemyto lj próbke za pomoca wody az do uwolnienia od chlorków i wysuszono nad P205 pod zmjniejszonym cisnieniem.Gotowa próbka 4.1 wykazywala wedlug analizy C-N zawartosc proteiny 29,8 mg/g.Dalsze 10 g nosnika 2 przeprowadzono w zawie¬ sine w 20 ml roztworu 0,5 g amyloglikozydazy (Merck 1330) w 0,05 m buforu fosforanowego (pH 7) i poddano obróbce w sposób opisany w przy¬ kladzie I (próbka 1.2).Analiza C-N gotowej próbki 4.2 wykazala za¬ wartosc proteiny 17,9 mg.Przyklad V. 10 g nosnika 1 (przewazajaca srednica porów 14 nm) przeprowadzono w zawie¬ sine w 40 ml 0,05 m roztworu buforu fosforamo- wego (pH 7), który zawieral 0,5 g gljkozoizomera- zy (Y. Takasaki, Agr. Biol. Chem. 33, nr 11, 1527— —1534. 1969).Czas reakcji wynosil w temperaturze pokojowej minut. Po kazdorazowo 10 minutach ewakuowa- no naczynie reakcyjne i po zakonczeniu reafccji odsaczono roztwór resztkowy. Nastepnie przepro¬ wadzono 3 przemywania za pomoca wody i 0,05 ni buforu fosforanowego (pH 7).Gotowa próbka 5.1 wykazywala wedlug analizy W C-N zawartosc proteiny 4,8 mg/g.W celu wytworzenia próbki 5.2 przeprowadzono w zawiesine dalszych 10 g nosnika 1 w 40 ml 0,05 m roztworu buforu fosforanowego (pH 7), któ¬ ry zawieral 0,25 g glikozoizomerazy. 45 Dalszy sposób postepowania odpowiadal prepa¬ rowaniu próbki 5.1.A-naliza C-N gotowej próbki 5.2 wykazala zawar¬ tosc proteiny 2,0 mg/g.Przyklad VI. 10 g nosnika 2 (przewazaja- 50 ca srednica porów 34 nm) przeprowadzono w za¬ wiesine w 40 ml 0,05 m roztworu buforu fosfora¬ nowego (pH 7), który zawieral 0,5 g glikozoizome¬ razy.Dalsza obróbke przeprowadzono wedlug przykla- 55 du V. Gotowa próbka wykazywala wedlug analizy C-N zawartosc proteiny 22,0 mg/g.W celu wytworzenia próbki 6.2 przeprowadzono- w zawiesine dalsze 10 g nosnika 2 w 40 ml 0,05 m roztworu buforu fosforanowego (pH 7), który za- 60 wieral 0,25 g glikozoizomenazy. Dalsza obróbke przeprowadzono wedlug przykladu V. Analiza C-N gotowej próbki 6.2 wykazala zawartosc pro¬ teiny 10,2 mg/g.Przyklad VII. 10 g nosnika 3 (przewazaja- a ca srednica porów 18 ran) przeprowadzono w za-126 637 8 wiesine w 40 ml 0,05 m roztworu buforu fosfora¬ nowego (pH 7), który zawieral 0,5 g glikozoizome- razy.Dalsza obróbke przeprowadzano wedlug przykla¬ du V. Gotowa próbka 7.1 wykazywala wedlug ana¬ lizy C-N zawartosc proteiny 11,2 mg/g.W celu wytworzenia próbki 7.2 przeprowadzono w zawiesine dalsze 10 g nosnika 3 w 40 ml 0,05 m roztworu buforu fosforanowego (pH 7), który za¬ wieral 0,25 g glikozojzomerazy. Dalszy sposób po¬ stepowania odpowiadal preparowaniu próbki 5.1.Analiza C-N gotowej próbki 7.2 wykazala za¬ wartosc proteiny 5,1 mg/g.Przyklad VIII. 10 g nosnika wymienionego w przykladzie IV (przewazajaca srednica porów 34 nim, traktowany wodnym roztworem dwualde- hydu glutarowego) przeprowadzono w zawiesine w 40 ml 0,05 m roztworiu buforu fosforanowego (pH 7), który zawieral 0,5 g glikozoizomerazy.Dalsza obróbke przeprowadzono wedlug przykladu V. Gotowa próbka 8.1 wykazywala wedlug analizy C-N zawartosc proteiny 21,3 mg/g.W celu wytworzenia próbki 8.2 przeprowadzono w zawiesine dalsze 10 g tego samego nosnika w 40 ml 0,05 m roztworu buforu fosforanowego Dalszy sposób postepowania odpowiadal preparo¬ waniu próbki 5.1 Analiza C-N gotowej próbki 8.2 wykazala zawartosc proteiny 9,8 mg/g.Przyklad IX. Aktywnosc opisanych w przy¬ kladach I—IV preparatów Id, 1.2; 2.1, 2.2; 3.1, 3.2; 4.1, 4.2 oraz zastosowanego do utrwalania enzymu (amyloglikozydaza, Merck 1330) oznaczono metoda kwasu dwiuntaosalicylowego (por. Rick, W., Steg- baiuer, H.P. w: Bergrneyer, H.U. „Meth. d. Emzyma- tischen Amalyse", Verlag Chemie 1970 str. 848 i na¬ stepne). Jednostka aktywnosci (U) odpowiada ilosci enzymu, która w warunkach inkubacji uwalnia na minute gnupy redukujace 1 mikrowaznik, w przeliczeniu na glikoze.Warunki inkubacji. 2% roztwór substrafcu (Zulkowsky-Starke Merck 1257) w 0,1 m buforze octanowym pH 5,0, 30 minut, °C.Utrwalone na nosniku preparaty przeprowadzo¬ no w zawiesine w wyzej podanych warunkach 40 w reaktorze o pojemnosci 40 ml przy predkosci mieszania 600 min-* (szybkosc zmian tworzenia produktu niezalezna od predkosci mieszania).Zawartosc proteiny w preparatach okreslono na podstawie wartosci srednich oznaczenia C-N.Przewazajaca srednice porów nosników okreslono z rozdzialu porów (zmierzonego za pomoca wyso¬ kocisnieniowego przyrzadu do pomiaim porowa¬ tosci).W nastepujacej tablicy I zestawiono wyniki dla •próbek 1—4. Zastosowane wielkosci ziarna zdefi¬ niowane sa nastepujaco: przewazajaca srednica porów pobieranie enzymu aktywnosc specyficzna aktywnosc specyficzna aktywnosc w stanie wolnym aktywnosc wzgledna D cE U (rum) (mg enzy¬ mu/g nosni¬ ka) (jednostek/g próbki) Us = U/ce (jed¬ nostek/mg enzymu) USf (jednostek/ /mg enzy¬ mu) /o Urel= 100- USF 45 Przyklad X. Aktywnosc opisanych w przy¬ kladach V—VIII preparatów 5.1, 5,2; 6.1, 6,2; 7.1, 7.2; 8.1, 8.2 oraz zastosowanej do utrwalenia gliko¬ zoizomerazy okreslono metoda Takasaki (por.Y. Takasaki: Agr. Biol. Chem. tom 30, nr 12, 1247— —1253, 1966 i Z. Dische, E. Borenfreund: J. Biol.Chem. 192, 583, 1951). Jednostka aktywnosci (U) jest zdefiniowana jako ilosc enzymu, która w wa¬ runkach inkubacji tworzy 1 mg fruktozy.Warunki inkubacji Temperatura 65 °C Czasreakcji 1 h Substrat 0,1 m glikoza X H^O (Merck 8342) w 0,05 m buforze fosforanowym, pH 0,8 z 0,0004 mg MgS04.Utrwalone na nosniku preparaty przeprowadzo¬ no w zawiesine w sposób opisany w przykladzie Tablica I (utrwalona amyloglikozydaza) Próbka 1.1, • : 1.2 < \ . 2.1. ¦ . 2.2 ¦ ¦3.1. 3.2 . ... 4.1 -. 4.2 D 140 34 18 34 CE 16,5 v 9,0 ,8 17,4 26,2 12,7 29,8 17,9 Aktywnosc U 98,4 100,5 208,8 203,9 150,0 149,5 199,7 209,4 Us ,96 11,16 6,77 11,71 ,72 11,77 6,70 s 11,70 Urel 51 95 58 100 49 100 57 100 : Usf 11,75126 637 Tablica II (utrwalona glikozoizomeraza) Próbka .1 .2 6.1 6.2 7.1 7.2 8.1 8.2 D 140 34 18 34 cE 4,8 2,0 22,0 ,2 11,2 ,1 21,3 9,8 Aktywnosc U 115,4 117,5 558,5 556,1 291,0 29,2,3 543y2 544,0 us 24,0 58,7 ,4 54,5 26,0 57,3 ,5 55,5 Urel 41 99 43 93 44 97 43 94 UsF 58,9 IX w warunkach znormalizowanych w reaktorze z mieszadlem.Zawartosc proteiny w preparatach okreslono na podstawie wartosci srednich oznaczenia C-N.W nastepujacej tablicy II zestawiono wyniki dla próbek 5—£.Definicje zastosowanych wielkosci ziarna podano w przykladzie IX.Wyniki wskazuja: Aktywnosc U badanych próbek przebiega przez maksimum, które zalezne jest od przewazajacej srednicy porów nosnika.Specyficzna aktywnosc Us zalezy od pobierania enzymu i osiaga przy okreslonym stezeniu enzymu Ce wartosc aktywnosci enzymu w stanie wolnym USF, tak ze Urei-= 100. Jesli ta ilosc enzymu zo¬ stanie przekroczona, specyficzna aktywnosc maleje, przy czym wynik z Us i Ce pozostaje staly.Ilosc enzymu pobrana przez nosnik jest funkcja srednicy por.Uklad enzym/nosnik wykazuje maksymalna ak¬ tywnosc przy mozliwym najmniejszym wsadzie enzymu, jesli optymalny nosnik 2 (przewazajaca srednica porów 34 nm) pobral 17,4 mg amylogliko- zydazy/g lub 10,2 mg glikozoizomerazy/g (próbki 2.2 lub 6.2).Pobieranie enzymu i aktywnosc sa niezalezne od srodka sprzegania.Poniewaz koszty enzymu sa znaczne i wraz z zadanym stopniem czystosci bardzo silnie wzrasta¬ ja, odgrywaja zatem wazna role dla zastosowania gospodarczego, dzieki sposobowi wedlug wynalaz¬ ku stworzono po raz pierwszy mozliwosc zastoso¬ wania technicznego równiez drogich enzymów, poniewaz sposób pozwala na to, aby przy zastoso¬ waniu nosnika wedlug wynalazku zoptymalizowac 40 45 ilosc enzymu potrzebna dla maksymalnej ak¬ tywnosci.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nierozpuszczalnego w wo¬ dzie preparatu enzymu, w którym nosnik nieorga¬ niczny, zawierajacy grupy funkcyjne -do wiazania kowalencyjnego enzymu, poddaje sie reakcji z roz¬ tworem enzymu i wyodrebnia otrzymany preparat enzymu, znamienny tym, ze nosnik z zelu Si02 o najczestszej srednicy porów wystepujacej w za¬ kresie 18—140 nim, korzystnie wynoszacej 34 nm, poddaje sie reakcji z roztworem zawierajacym —50 mg na gram nosnika, korzystnie 25 mg, gli- kozoizomerazy o aktywnosci specyficznej w stanie wolnym wynoszacej okolo 50—70 jednostek/mg, albo z roztworem zawierajacym 25—75 mg na gram nosnika, korzystnie 50 mg, £myloglikozydazy o aktywnosci specyficznej w stanie wolnym wyno¬ szacej okolo 10—15 jednostek /mg. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako nosnik stosuje sie zel Si02, wyprazony w ciagu 5—10 godzin w strumieniu powietrza zawie¬ rajacym pare wodna, w temperaturze 400°C— —850°C, korzystnie 570°C—750°C po ustaleniu za¬ wartosci alkaliów, obliczonych jako Na20, na 0,1—0,5% wagowych i wysuszeniu. 3. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze jako nosnik stosuje sie Si02 wyprazony po wysu¬ szeniu w powietrzu nasyconym para wodna w temperaturze 180°C—200°C. 4. Sposób wedlug zastrz. 2 albo 3, znamienny tym, ze jako nosnik stosuje sie Si02 wyprazony w strumieniu powietrza zawierajacym pare wodna o wilgotnosci wzglednej wynoszacej 40—80%. PL PL PL PL PL PL PL PL PL PL