FI85283B - Foerfarande foer framstaellning av immobiliserade enzymer. - Google Patents

Description

1 85283

Menetelmä immobilisoitujen entsyymien valmistamiseksi

Keksintö kohdistuu menetelmään partikkelimaisen, immiboli-soidun entsyymivalmisteen tuottamiseksi, joka valmiste muodostuu kantajasta, jonka pinnalle entsyymi on kiinnittynyt. Kantajan pinta on tässä, huokoisen kantajan ollessa kyseessä, tulkittava sekä uiko- että sisäpinnaksi.

Immobilisoitujen entsyymien ja niiden kantajien käsittämä alue on nopeasti kasvamassa. Tavallisesti kantaja on pieninä, mahdollisesti punnittuina partikkeleina, joiden sisään entsyymi on tuotu, tai joiden pinnalle entsyymi on tarttunut tai kiinnittynyt. Viitteenä mainitaan US-patentit 4 266 029 ja 4 116 711 ja tanskalainen patentti 133 380, jotka ovat ainoastaan kolme esimerkkiä tunnetuista kantajista (joiden pinnalle tai sisään entsyymit ovat kiinnittyneet).

Tämän keksinnön mukaisen menetelmän yhteydessä käytetty kantaja kuuluu sen tyyppisiin kantajiin, joiden pinnalle entsyymi kiinnittyy päinvastoin kuin kantajilla, joissa entsyymi kiinnittyy läpi kantajan koko tilavuuden.

Tyypillinen tunnettu kantaja, joka kuuluu tähän juuri osoitettuun ryhmään kantajia, joiden pinnalle entsyymi kiinnittyy, muodostuu gelatiinigranulaateista ja se on kuvattu julkaisussa Derwent 08061 C/5 (J 5 4156-892). Puhtaat gelatiini-partikkelit eivät kuitenkaan ole riittävän kovia käytettäväksi suurimittakaavaisissa kiintopetioperaatioissa, joissa vaaditaan erittäin suuria virtausnopeuksia. Puhtaat gelatiini-partikkelit ovat myöskin suhteellisen kalliita.

Samanlainen kantaja, joka myös kuuluu tähän ryhmään, ja jossa inertti ydin on peitetty gelatiinilla, voidaan valmistaa US-patentin n:o 4 266 029 mukaisesti. Vaikka tällä kantajalla on hyvät virtauskarakteristiikat, sen heikkoutena on, että kantajapartikkelien muotoa ja kokoa ei voida valita sen 2 85283 parhaaseen kolonnisuorituskykyyn liittyvien kriteerien perusteella, vaan raaka-aineena käytetyn tietyn hiekkajakeen tai muun tietyn tiiviin materiaalin jakeen perusteella. Edelleen, vaikka on helppoa valmistaa tätä kantajaa laboratoriomittakaavassa, on vaikeata tai ehkä mahdotonta valmistaa sitä teollisessa mittakaavassa.

Toinen tyypillinen tunnettu kantaja, joka kuuluu tähän ryh-r mään, on kuvattu julkaisussa Advances in Experimental Medicine and Biology, voi. 42, ss. 191-192, Immobilized Biochemicals and Affinity Cromatography. Tämä kantaja muodostuu lasi-helmistä, joissa on silaani yhdistävänä aineena. Näillä helmillä on erinomaiset virtausominaisuudet ja suhteellisen suuri kuormituskapasiteetti. Kuitenkin ne ovat hyvin kalliita ja, kuten kaikki epäorgaaniset kantajat, ollakseen sopivia immobilisoiduille entsyymeille niille on suoritettava vaativia kemiallisia käsittelyjä, joihin liittyy ei-toivot-tujen materiaalien käyttö.

Siten tämän keksinnön tarkoituksena on aikaansaada menetelmä immobilisoidun entsyymin valmistamiseksi, joka käsittää kantajan, jonka pinnalle entsyymi on kiinnittynyt, jolloin tällä kantajalla on kaikki yllä luetellut edulliset ominaisuudet, esimerkiksi riittävä kovuus, mahdollisuus valmistaa teollisesti ja yksinkertaisin kemiallisin menetelmin ja alhaisin tuotantokustannuksin.

Nyt on kehitetty menetelmä partikkelimaisen immobilisoidun entsyymivalmisteen tuottamiseksi, valmisteen käsittäessä kantajan, jonka pinnalle entsyymi on kiinnittynyt, jolloin kantaja on muodostunut kahden faasin kombinaatiosta, esimerkiksi a) vesiliukoisen sideaineen faasista, jossa aine ainakin osittain on liuenneena tai dispergoituneena vesipitoiseen väliaineeseen, ja b) epäjatkuvasta useiden diskreettien kovien ja inerttien partikkeleiden faasista, jossa partikke-leiden koko on riittävän pieni ollakseen vaikuttamatta kantajan muotoutumiseen, ja sidosaineesta, joka on liukenematon 3 85283 väliaineeseen, jossa entsyymiä mahdollisesti tullaan käyttämään mikäli tarpeen, ja jossa kantaja on kontaktissa kantajan pintaan kiinnittyneen entsyymin kanssa. Jos väliaine, jossa immobilisoitua entsyymiä lopulta tullaan käyttämään on vesipitoinen väliaine, on välttämätöntä saattaa (alkuperäinen) vesiliukoinen sidosaine liukenemattomaan muotoon kemiallisella tai fysikaalisella käsittelyllä esimerkiksi silloittamalla tai kuumentamalla. Jos väliaine, jossa immobilisoitua entsyymiä tullaan lopulta käyttämään, on vedetön väliaine, (alkuperäinen) vesiliukoinen sidosaine saattaa olla liukenematon tähän vedettömään väliaineeseen, ja siten tässä tapauksessa ei ehkä ole tarpeellista saattaa sidosainetta liukenemattomaan muotoon. Täydellisyyden vuoksi huomiota on kiinnitetty siihen, että kantaja voi sisältää myös muita komponentteja kuin yllä mainitut välttämättömät komponentit a) ja b), esimerkiksi täyteaineita ja/tai granuloivia apuaineita.

Keksinnön mukaisesti on yllättäen todettu, että keksinnön mukainen menetelmä täyttää yllä mainitut keksinnön päämäärät. Myöskin yllättäen on havaittu, että kantaja säilyttää erinomaisen fysikaalisen yhtenäisyytensä vielä kun inerttien partikkelien osuus on 98 paino-% suhteessa kantajan painoon. Tämä on hyvin tärkeätä, koska mitä korkeampi inerttien partikkelien osuus on (aina yllä mainitulle ylärajalle asti), sitä kovempaa kantaja on ja sitä pienemmät ovat kustannukset.

Jos immobilisoitu entsyymi on lipaasi, ja lipaasilla aiotaan esteröidä lipidejä petrolieetteriliuoksessa, silloin albumiinia, kaseiinia, soijaproteiinia, hydroksietyyliselluloo-saa, agaria, alginaattia, polyvinyylialkoholeja, tärkkelystä, metyyliselluloosaa tai karboksimetyyliselluloosaa voidaan käyttää sidosaineena, koska nämä materiaalit ovat liukenemattomia petrolieetteriin. Kantajan ja entsyymin välillä tarvitaan tässä tapauksessa ainoastaan heikko kiinnittyminen. Jos toisaalta entsyymi, jonka kanssa kantajaa mahdollisesti tullaan käyttämään, on amyloglukosidaasi, ja amyloglukosi-daasi on tarkoitettu pilkkomaan dekstriinejä vesipitoisessa 4 85283 liuoksessa, silloin on välttämätöntä saattaa (alkuperäinen) vesiliukoinen sidosaine liukenemattomaan muotoon. Tavallisesti amyloglukosidaasi tarttuu tai kiinnitetään kantajan pinnalle silloittumalla glutaraldehydin kanssa.

On selvää, että minkä tahansa entsyymin ja kumman tahansa kantajafaasin a) ja b) jokainen kombinaatio ei ole toimiva. Alan ammattimies tietää, että jotkut entsyymit eivät siedä joitakin kationeja, jotka saattavat vapautua pieninä määrinä faasista b), ja myöskin jos immobilisoitua entsyymiä on tarkoitus käyttää elintarviketeollisuudessa, jotkut faasin a) aineosat saattavat olla vähemmän toivottuja, koska haitallisia aineosia voi joutua entsyymireaktorin poistovirtaan.

Tanskalaisessa patenttihakemuksessa n:o 1592/78 (Standard Brands), joka vastaa US-patenttia 4 110 164 ja BE-patenttia 865 900, on kuvattu immobilisoitua glukoosi-isomeraasia, joka on kiinnittynyt ioninvaihdolla kantajaan, joka käsittää kuitumaisen hydrofiilisen polymeeriin yhdistetyn ioneja vaihtavan selluloosan ja joka mahdollisesti sisältää paksun-nosainetta, kuten jauhemaisia metallioksideja. Kantaja valmistetaan sulattamalla hydrofobinen polymeeri ja sekoittamalla selluloosa ja paksunnosaine sulaan polymeeriin. Tähän menetelmään liittyy kuitenkin joukko haittoja. Ensinnäkin tällaisten hydrofobisten polymeerien hinta on suhteellisen korkea, ja toiseksi on paljon helpompaa työskennellä keksinnön mukaisten sidosaineiden vesiliuosten ja suspensioiden kuin sulien hydrofobisten polymeerien kanssa. Myöskin tanskalaisessa patenttihakemuksessa 1592/78 kuvattu menetelmä on tarkoin rajoitettu entsyymeihin, jotka on immobilisoitu ioninvaihtohartseilla, ts. yksimolekyylisiin entsyymikerrok-siin, kun taas esillä oleva keksintö soveltuu kaikkiin entsyymin kiinnityssyteemeihin, ja yksimolekyylisiin entsyymi-kerroksiin yhtä hyvin kuin monimolekyylisiin kerroksiin. Siksi esimerkiksi glukoosi-isomeraasitapauksessa, johtuen entsyymikerroksen paksuuden vapaasta valinnasta, on mahdollista aikaansaada erittäin korkeat spesifisen aktiivisuuden 5 85283 arvot tämän keksinnön yhteydessä, kun taas maksimi arvo (tanskalaisessa patenttihakemuksessa n:o 1592/78 kuvatun) immobilisoidun glukoosi-isomeraasin spesifiselle aktiivisuudelle on suhteellisen pieni ja erityisesti liian pieni teolliselle sovellutukselle.

Edullisessa keksinnön mukaisessa menetelmässä kahden faasin kombinaatiossa jatkuva ja epäjatkuva faasi sekoitetaan keskenään, jonka jälkeen seos muokataan partikkelimuotoiseksi kantajaksi, edullisesti pallomaiseksi. Tällä tavoin saadaan halpoja ja helposti valmistettavia kantajapartikkeleita.

Aikaisemmin tunnetut gelatiinirakeiden tai pallomaisten gelatiinipartikkelien valmistusmenetelmät ovat melko kalliita ja vaivalloisia. Esimerkkinä on tanskalainen patentti 133 380, jossa on kuvattu tällaisten gelatiinipartikkelien valmistusta lisäämällä gelatiinin (ja entsyymin) vesiliuos n-butanoliin ja erottamalla muodostuneet pisaranmuotoiset partikkelit. Keksinnön mukaisesti on kuitenkin havaittu, että sidosaineen ja inertin materiaalin seoksen muodostavat rakeet tai pallomaiset partikkelit voidaan valmistaa paljon halvemmalla tavalla, esimerkiksi Marumerizer-laitteen avulla (kts. esim. US-patentti 3 277 520) tai erityisen granuloimis-laitteen avulla (kts. esim. US-patentti 4 106 991). Edelleen useiden pienten kovien partikkelien lisääminen tekee kanta-japartikkelit hyvin koviksi parantaen siten niiden virtaus-ominaisuuksia ja tehden ne sopiviksi suuren mittakaavan kolonnioperaatioihin suurilla virtaamilla.

Edullisessa keksinnön mukaisessa menetelmässä muovaus tarkoittaa saattamista pallomaiseen muotoon granulointilait-teessa, jota on kuvattu US-patentissa 4 106 991. Tällä tavoin voidaan tuottaa erittäin halpoja palloja, joilla on erinomaiset fysikaaliset ominaisuudet.

Edullisessa keksinnön mukaisessa menetelmässä jatkuvaan faasiin lisätään geeliä muodostavaa ainetta ennen sekoittamista epäjatkuvaan faasiin, sen aikana tai sen jälkeen, jonka 6 85283 jälkeen siten saatu massa ekstruoidaan tai tiputetaan väliaineeseen jolloin silloittava aine voidaan lisätä missä tahansa näistä vaiheista. Tällöin saadaan partikkeleita, joilla on erittäin säännölliset muodot.

Edullisessa keksinnön mukaisessa menetelmässä geelin muodostava aine on gelatiini, alginaatti, karragenan tai kito-saani. Tällöin saadaan partikkeleita, joilla on erittäin säännölliset muodot ja erinomainen koheesio.

Edullisessa keksinnön mukaisessa menetelmässä väliaine on liuos, joka sisältää Ca++:a, Ba++:a, K+:a, polyfosfaattia tai ferrisyanidia tai kylmää vettä tai kylmän ilmavirran. Tällöin saadaan partikkeleita, joilla on hyvin säännölliset muodot ja erinomainen koheesio.

Edullisessa keksinnön mukaisessa menetelmässä jatkuva faasi on vesiliukoinen proteiini, erityisesti gelatiini, soijaprote-iini, kaseiini, albumiini, seiini, gluteeni tai proteiini-hydrolysaatti, tai polysakkaridi, erityisesti agar, alginaatti tai muut kumit, jauho, tärkkelys tai kitosaani tai synteettinen materiaali, karboksimetyyliselluloosa, metyylisel-luloosa, etyyliselluloosa, hydroksietyyliselluloosa, hydroksi-propyyliselluloosa, polyvinyylialkoholi, polyvinyylipyrroli-doni; tai natriumsilikaatti. Jatkuva faasi voi olla mikä tahansa keksinnössä käytettävä sidosaineiden seos, esimerkiksi mikä tahansa yllä mainittujen materiaalien seos. Näillä sidosaineilla on mahdollista aikaansaada kantaja, jolla on erinomaiset fysikaaliset ominaisuudet, jopa hyvin pieninä suhteina epäjatkuvaan faasiin.

Edullisessa keksinnön mukaisessa menetelmässä epäjatkuva faasi on piimaata, murskattua hiekkaa, tiilipölyä, savea, nailonjauhetta, liukenemattomia metallioksideja tai liukenemattomia metallisuoloja, piijauhetta, aerosilia, alumiini-jauhetta, korundia, lasijauhetta, piikivijauhetta, kvartsi-jauhetta, grafiittijauhetta, alumiinifosfaattia, kaoliinia, 7 85283 bentoniittia, perliittiä, zeoliittejä, kalsiumsilikaattia, mikrosolusuodattajaa, murskattua magnesiumsilikaattia, talkkia, asbestoosia, sarvivälkelastuja, titaanidioksidia, tina-oksidia, kiillotusjauhetta, jauhettua zirkoniumsilikaattia, hiilimustaa,aktiivihiiltä, luujauhoa, lentotuhkaa, tai metal-lijauhetta. Epäjatkuva faasi voi olla mikä tahansa diskreettien, kovien ja inerttien keksinnössä käytettävien partikke-leiden seos, esimerkiksi mikä tahansa yllä mainittu materiaalien seos. Nämä materiaalit ovat halpoja ja parantavat kantajan mekaanisia ominaisuuksia.

Edullisessa keksinnön mukaisessa menetelmässä epäjatkuvan faasin määrä on välillä n. 10 ja 98 paino-% suhteessa kantajan kokonaispainoon, edullisesti välillä 50 ja 95 paino-%. Tällä tavoin yhdistyvät alhaiset kustannukset ja kantajan erinomaiset fysikaaliset ominaisuudet.

Keksinnön mukaisessa edullisessa menetelmässä yksittäisen inertin partikkelin lineaarinen koko epäjatkuvassa faasissa, laskettuna sellaisen pallon halkaisijana, jolla on sama tilavuus kuin yksittäisellä inertillä partikkelilla, on alle 1/5 kantajapartikkelin halkaisijasta, edullisesti alle 1/20. Inerttien partikkeleiden dimensoiden ollessa tällaisia muovaus voidaan suorittaa ilman vaikeuksia.

Edullisessa keksinnön mukaisessa menetelmässä jatkuva faasi on saatettu liukenemattomaan muotoon silloittamalla sopivan silloittavan aineen, edullisesti glutaraldehydin kanssa. Tällä tavoin kantajapartikkeleiden mekaaninen kestävyys edelleen paranee.

Edullisessa keksinnön mukaisessa menetelmässä kantajan muoto on pallomainen, ja kantajan keskihalkaisija on välillä 0,1 ja 5 mm, edullisesti välillä 0,2 ja 2 mm, erittäin edullisesti välillä 0,2 ja 1 mm. Tällä tavoin aikaansaadaan kantaja, jossa on tehty hyvä kompromissi virtausominaisuuksien ja pinta-alan välillä.

8 85283

Edullisessa keksinnön mukaisessa menetelmässä kantajaa käsitellään entsyymiliuoksella ja silloittavalla aineella. Tällöin saadaan erinomainen adheesio kantajan ja entsyymin välillä ja siten immobilisoitu entsyymi, jolla on erittäin hyvä fysikaalinen stabiilisuus.

Edullisessa keksinnön mukaisessa menetelmässä kantaja tuodaan torniin fluidisoituna massana ja liukoisen entsyymin liuos tuodaan torniin suihkuna, jonka jälkeen siten aikaansaatu massa poistetaan tornista ja käsitellään silloittavalla aineella. Tällä tavoin voidaan valmistaa keksinnön mukainen immobilisoitu entsyymi, jossa kantajaan kohdistuva entsyymi-kuorma on erittäin suuri.

Edullisessa keksinnön mukaisessa menetelmässä kantaja tuodaan torniin fluidisoituna massana ja liukoisen entsyymin liuoksen ja silloittavan aineen seos tuodaan torniin suihkuna, jonka jälkeen täten saatu massa poistetaan tornista.

Tällä tavoin voidaan valmistaa keksinnön mukainen immobilisoitu entsyymi, jossa kantajaan kohdistuva entsyymikuorma on erittäin suuri.

Mitä tulee kahdessa edellisessä kappaleessa kuvattuihin edullisiin sovellutusmuotoihin, on otettava huomioon, että kantaja, silloittava aine, entsyymi ja lisäaineet, mikäli niitä on läsnä, voidaan yhdistää missä tahansa halutussa järjestyksessä. Tällaiset lisäaineet voivat olla esimerkiksi granuloivia aineita (esim. selluloosakuituja tai kapipaleita, kovia ja inerttejä partikkeleita), liukoisia materiaaleja, jotka toimivat huokoisuutta lisäävänä aineena (esim. NaCl), tai muita proteiineja.

Edullisessa keksinnön mukaisessa menetelmässä entsyymi on glukoosi-isomeraasi, joka edullisesti on peräisin lajista Bacillus coagulans. On havaittu, että tällä tavoin valmistetulla glukoosi-isomeraasilla voi olla erinomainen aktiivi-' suus ja paremmat ominaisuudet jatkuvassa kolonnityöskente- lyssä.

9 85283

Keksinnön mukainen immobilisoitu entsyymivalmiste voidaan tuoda kolonniin kerroksena, jonka jälkeen entsyymin sub-straattiliuos ajetaan mainitun kerroksen läpi sellaisella nopeudella, että ainakin osa substraatista muuttuu entsyymin vaikutuksesta.

Seuraavat esimerkit kuvaavat keksinnön mukaista menetelmää. Joissakin esimerkeissä on kuvattu ainoastaan kantajan valmistusta. Kaikissa näissä esimerkeissä kantaja on käsitelty samalla entsyymiliuoksella kuin esimerkissä 12 edelleenkä-sitellyn immobilisoidun entsyymin valmistamiseksi.

Seuraavassa viitataan erilaisiin NOVO-kirjallisuusreferaat-teihin. Näistä kaikista referaateista on saatavana kopiot osoitteesta NOVO Industri A/S, Novo Α11δ, 2880 Bagsvaefd, Tanska.

Joissakin esimerkeissä on osoitettu painehäviön (fysikaalinen lujuus) arvo kolonnioperaation aikana. Tämä arvo määritetään menetelmän AF 166/2 mukaisesti, mikä on NOVO-laboratorion määritysmenetelmä. Joitakin teoreettisia seikkoja, jotka ovat yhteydessä tähän painehäviön määritykseen on kuvattu julkaisussa Starch/Stärke 31 (1979) n:o 1, sivut 13-16. Verrattaessa joihinkin kaupallisiin tuotteisiin, on mainittava, että parhaat painehäviön arvot immobilisoidulle glukoosi-isomeraasivalmisteelle SWEETZYME ovat n. 10 g/cm^. Esimerkeistä ilmenee, että painehäviöt keksinnön mukaisella menetel-mällä valmistetuilla immob il isoiduilla entsyymipreparaa-teilla voivat olla jopa 2 g/cm^ ja että kaikki arvot ovat huomattavasti alempia kuin 10 g/cm , jolloin keksinnön tek-ninen hyöty on selvästi osoitettu.

Esimerkki 1 10 g gelatiinia Bloom 260 dispergoitiin 60 ml:aan H20, lisättiin 33 g 6-prosenttista paino/tilavuus Na-alginaattia, seosta kuumennettiin 60°C:een gelatiinin liuottamiseksi, sen jälkeen lisättiin 10 g Hyflo Celite'ä (piimaata), koko 10 85283 seosta sekoitettiin 10 min 55°C:ssa ja pumpattiin tärisevän ruiskun läpi hyvin pienien pisaroiden saamiseksi, joiden pisaroiden annettiin pudota 2-prosenttiseen paino/tilavuus CaCl2 · Sl^O-liuokseen, joka oli 5-asteista. Valmistettuja pallomaisia partikkeleita sekoitettiin CaC^-liuoksessa muutaman minuutin ajan, ja poistettiin sen jälkeen liuoksesta, pestiin deionisoidulla vedellä ja annettiin kuivua 2 päivää huoneen lämpötilassa. Partikkeleita sekoitettiin sen jälkeen varovasti tunnin ajan 200 mlrssa 1-prosenttista paino/tilavuus glutaraldehydiliuosta pH-arvossa 8,5, poistettiin, pestiin deponoidulla vedellä ja annettiin jälleen kuivua. Tällä tavoin saatiin pallomaisia ja äärimmäisen kovia ja koossapysyviä partikkeleita, joiden halkaisija oli n. 2 mm ja joilla oli erinomaiset virtausominaisuudet. Paine-häviö oli 2 g/cm . Partikkeleita käsiteltiin haluttaessa sitraatilla tai fosfaatilla Ca++-ionien ja alginaatin poistamiseksi ilman negatiivista vaikutusta partikkeleihin.

Esimerkki 2

Esimerkissä 1 kuvattu menetelmä toistettiin, paitsi että käytettiin vain puolet gelatiinimäärästä, joka on 5 g, ja kaksi kertaa Hyflo Celite-määrä, joka on 20 g, eikä partikke-leiden annettu kuivua ennenkuin ne käsiteltiin glutaralde-hydilla. Saatiin oleellisesti identtisiä partikkeleita, joiden kovuus oli jonkin verran alentunut, mutta joilla kuitenkin oli lähes samat erinomaiset virtausominaisuudet.

Λ

Paineen lasku oli 3 g/cm .

Esimerkki 3

Esimerkissä 2 kuvattu menetelmä toistettiin paitsi että käytettiin gelatiinia Bloom 200 ja että sen määrä aleni 4 g:aan. Glutaraldehydin konsentraatio aleni myöskin 0,2 prosenttiin paino/tilavuus. Tällä tavoin saatiin partikkeleita, joilla oli oleellisesti identtiset ominaisuudet.

Esimerkki 4 Tässä esimerkissä käytettiin pilot-plant-laitteistoa. Täten n 85283 sekoittajassa, joka oli tyyppiä Lödige FM 130 D sekoitettiin 0,7 kg selluloosakuituja tyyppiä Arbocel BC 200, 2,8 kg Clarcel Celite'ä (piimaata) ja 4 kg 20 %:sta paino/paino gelatiini Bloom 200-liuosta, kaikki 60°C:ssa, ja näin saatu paksu massa ekstruoitiin ekstruuderilla, jossa oli 1,5 mm:n suutin ja sitten saatettiin pallomaisiksi rakeiksi Marume-rizei®-laitteella tavalla, jota on kuvattu US-patentissa n:o 3 277 520. Ekstruuderi oli kaksoissuutintyyppinen malli EXDC-100, ja rakeistaja oli mallia Q-400. Näin saadut partikkelit kuivattiin leijupetitornissa (Glatt tyyppi WSG 15) ja seulottiin, jae 1,2-2,0 mm otettiin talteen, jäännös uudel-leenkierrätettiin. 10 g:n näyte käsiteltiin 3 tunnin ajan huoneen lämpötilassa 100 ml :11a 1-prosenttista paino/tilavuus glutaraldehydiliuosta, joka oli säädetty happamuuteen pH 7,0, poistettiin liuoksesta ja pestiin huolellisesti deionisoi-dulla vedellä. Jopa kuivaamatta näin valmistetut partikkelit olivat äärettömän kovia ja koossapysyviä ja niillä oli erin- 2 omaiset virtausominaisuudet. Painehäviö oli 2 g/cm . Tässä esimerkissä epäjatkuva faasi muodostui 65 painoprosenttises-ti partikkeleista.

Esimerkki 5 Tässä esimerkissä käytettiin samaa Marurnerizer-laitetta kuin esimerkissä 4, paitsi että ekstruuderia ei käytetty. Edelleen epäjatkuvan faasin sisältö nostettiin 94 prosenttiin paino/-paino kantajan kokonaispainosta. Siten 1,5 kg Skamol-savipartikkeleita, joiden partikkelikoko oli 0,7-1,0 mm lastattiin rakeistajaan ja 0,4 kg Hyflo Celite'ä ja 1,15 kg 10-prosenttista paino/paino gelatiini-Bloom 80-liuosta lisättiin 60°C:ssa vaihdellen niin, että estettiin paakkujen syntyminen. Niin saadut partikkelit käsiteltiin kuten esimerkissä 4, jolloin saatiin kovia partikkeleita, joilla on erittäin hyvät virtausominaisuudet. Painohäviö oli 5 g/cm^.

Esimerkki 6 Tässä esimerkissä lastattiin rakeistaja, jossa oli auran vannastyyppinen sekoittaja Lödige FM 50 ja suurinopeuksinen leikkuri, jollainen on kuvattu US-patentissa 4 106 991, i2 85283 5 kg:lla Clarcel Celite'a, ja 5,95 kg 16-prosenttista gelatiinia Bloom 200 ruiskutettiin siihen, jolloin käsittelyaika ja sekoittajan ja leikkurin pyörimisnopeudet valittiin siten, että partikkelikoko oli 0,7-1,5 mm. Nämä partikkelit käsiteltiin kuten esimerkissä 4, jolloin saatiin kantajapartik- keleita, joilla oli oleellisesti samat ominaisuudet kuin 2 esimerkissä 4. Painehäviö 4 g/cm .

Esimerkki 7 1 kg selluloosakuituja, 4 kg Clarcel Celite'ä ja 10 kg tämän esimerkin mukaisesti valmistettua uudelleenkierrätet-tyä materiaalia ruiskutettiin yhdessä 10,5 kg:n 10-prosent-tista paino/paino gelatiinia Bloom 200 kanssa Lödige-sekoit-tajaan tyyppiä FM 130 D, jolloin saatiin pyöreitä partikkeleita, joiden koko vaihteli. Kaikkien yllä kuvattujen toimintojen aikana sekä ainesosat että laitteisto pidettiin 55°C:ssa. Pyöreät partikkelit kuivattiin leijukerrostornissa ja seulottiin ja jae 0,5-0,7 mm, joka käsitti 32 %, otettiin talteen. Jäte, joka käsitti karkeammat partikkelit, jotka jauhettiin, ja erittäin hienot partikkelit, jotka käytettiin sellaisenaan, kierrätettiin uudelleen kuten tämän esimerkin alussa on kuvattu.

Esimerkki 3

Sama sekoittaja kuin esimerkissä 4, ts. Lödige FM 130 D, täytettiin 3 kg:11a selluloosakuituja, 10,5 kg:11a Clarcel Celite'a ja 1,5 kg:11a albumiinia sopivassa lämpötilassa ja ruiskutettiin 15,2 kg:n kanssa vettä. Käsittelyaika ja sekoittajan ja leikkurin pyörimisnopeudet valittiin sellaisella tavalla, että saatiin halutun kokoisia partikkeleita. Partikkelit kuivattiin leijukerroksessa ja kuivattujen partikke-leiden seula-analyysi osoitti seuraavan partikkelikokoja-kautuman: >1000 ^um 19,7 % > 850 - 35,6 % > 707 - 58,8 % > 600 - 78,2 % > 500 - 92,1 % -I < 420 - 1,1 % i3 85283

Esimerkki 9

Esimerkin 8 menetelmä toistettiin paitsi että 1,5 kg iso-elektrisellä soijaproteiinihydrolysaatilla korvattiin albumiini ja että veden määrä oli 14,8 kg. Kuivien partikkelei-den seula-analyysi osoitti seuraavat partikkelikokojakautuman: > 1000 yum 24,2 % > 850 - 43,2 % > 707 - 66,1 % > 600 - 84,4 % > 500 - 95,2 % < 420 - 1,0 %

Esimerkki 10

Sama sekoittaja kuin esimerkissä 6, ts. Lödige FM 50, täytettiin 11,3 kg:11a A^O^a ja 3,0 kg:11a selluloosakuituja ja ruiskutettiin 650 g:n gelatiinia Bloom 200 kanssa 4,55 kg:aan vettä. Lämpötila pidettiin 55°C:ssa. Partikkelit, jotka muodostettiin sekoittajan ja leikkurin rotaatiolla, kuivattiin leijukerroksessa. Seula-analyysi osoitti seuraavan partikkelikokojakautuman.

> 1000 yum 8,5 % > 850 - 16,1 % > 707 - 31,2 % > 600 '- 46,2 % > 500 - 65,3 % < 420 - 15,6 %

Esimerkki 11 Lödige FM 130 D-sekoittaja täytettiin 2,1 kg:11a selluloosa-kuituja, 8,4 kg:lla Clarcel Celite‘ä ja 4,5 kg:lla natrium-kloridia ja ruiskutettiin 11,0 kg:n 10-prosenttista (paino/ paino) gelatiinia Bloom 200 kanssa. Lämpötila oli 55°C. Partikkelit muodostettiin ja kuivattiin. Seula-analyysi osoitti seuraavan partikkelikoko jakautuman.

i4 85283 > 1000 ^um 14,2 % > 850 - 23,7 % > 707 - 40,1 % > 600 - 59,1 % > 500 - 79,1 % < 420 - 5,8 %

Esimerkki 12 Tämä esimerkki kuvaa keksinnön mukaista immobilisoidun entsyymivalmisteen valmistusmenetelmää. Tällöin 4,5 kg esimerkin 4 tavalla valmistettuja, glutaraldehydillä pestyjä ja kuivattuja kantajapartikkeleita leijutettiin pilot-plant-leijupetilaitteistossa (Glatt tyyppi WSG 15), ja 9,3 kg 19-prosenttista paino/paino osittain puhdistettua glukoosi-isomeraasia lajista Bacillus coagulans NRRL 5650 (aktiivisuus 3240 yksikköä/g kuiva-ainetta, aktiivisuusyksikkö määritetty julkaisussa NOVO Analyseforskrift AF 189/1), ruiskutettiin partikkelien päälle 50-55°C:ssa, ja partikkelien annettiin kuivua. Tällä tavoin valmistettu tuote sisälsi 28 paino-% osittain puhdistettua glukoosi-isomeraasia, jossa entsyymin aktiivisuus oli 85 %. 20 g näistä partikkeleista käsiteltiin sen jälkeen 500 mlrssa liuosta, joka sisälsi 0,06 M NaH2P04 · 2H20, 1,4 M Na2S04 ja 0,1 % paino/tilavuus glutaraldehydiä ja jonka pH oli säädetty arvoon 7,0 IN NaOH:lla. Tunnin kuluttua huoneen lämpötilassa partikkelit poistettiin ja pestiin huolellisesti 0,06 M natriumfosfaa-tilla, jonka pH oli 7,0, ja sen jälkeen pinnalta deionisoi-dulla vedellä, ja osan niistä annettiin kuivua. Sekä märillä että kuivilla partikkeleilla oli samat erinomaiset virtaus-ominaisuudet kuin alkuperäisellä kantajalla, eikä aktiivi-suusvuotoja voitu havaita. Kuitenkin märkien partikkeleiden entsyymiaktiivisuus oli 70 %, kun se kuivilla partikkeleilla oli ainoastaan 48 %.

Esimerkki 13 20 g kuivia esimerkin 4 tavalla valmistettuja partikkeleita fluidisoitiin Lab-tyyppiseen leijupetiin. 45,8 g 11-prosent- tista paino/paino homogenisoitua solulietettä (fermentoitu is 85283 kuten tanskalaisessa patenttihakemuksessa n:o 5190/79 esimerkissä 1 on esitetty, liete valmistettu kuten osoitettu esimerkissä 4 tanskalaisessa patenttihakemuksessa n:o 5190/79) , joka sisälsi 80,1 U/g termofiilistä laktaasia lajista Bacillus sp. NRRL B-11.229 ruiskutettiin kantajapar-tikkelien päälle 30-40°C:ssa ja päällystettyjen partikke-leiden annettiin kuivua. Laktaasin aktiivisuusyksikkö määritettiin laktaasimääränä, joka hajottaa 1 ^umoolia laktoo-sia/minuutti seuraavissa reaktio-olosuhteissa: substraatti-pitoisuus = 10 % laktoosia, lämpötila = 60°C, pH = 6,5 ja reaktioaika =30 min. Entsyymiaktiivisuus oli 79,8 %. 10 g päällystettyjä palloja käsiteltiin sitten 250 ml:11a liuosta, joka sisälsi 0,06 M Na2HPO^, 1,4 M Na2SO^ ja 0,1 % paino/tilavuus glutaraldehydiä pH-arvossa 7,5. Tunnin kuluttua huoneen lämpötilassa partikkelit poistettiin ja pestiin huolellisesti 0,06 M ^HPO^llä pH-arvossa 7,5. Entsyymiaktiivisuus suhteessa silloittumisvaiheeseen oli 17,2 %.

Esimerkki 14 24 g kuivia esimerkin 4 mukaisesti valmistettuja kantaja-partikkeleita ravistettiin 20,2 g:ssa 39,6-prosenttista paino/paino osittain puhdistettua lajista A. niger kaupallisen tuotteen AMG 200 L ultrasuodatuksella valmistettua amylo-glukosidaasia (kuvattu NOVO-esitteessä AMG, B 020 g - GB 2500 heinäkuu 1982) pienimolekyylisten ainesosien poistamiseksi kuiva-ainepitoisuuteen 39,6 % paino/paino (aktiivisuus 2610 IAG/g, aktiivisuusyksikkö määritelty julkaisussa NOVO Analyseforskrift AF 159/2). Vakuumia pidettiin tunnin ajan. Mäin saatu tuote sisälsi 25 paino-% entsyymikuiva-äinetta, jossa oli 77,9 prosentin entsyymiaktiivisuus.

20 g partikkeleita, joiden kuiva-aine oli 71,8 % käsiteltiin sitten 1600 ml:11a liuosta: 1 % paino/tilavuus NaHjPO^, 20 % paino/tilavuus Na2SO^ ja 0,2 % glutaraldehydiä pH-ar-vossa 4,5. Tunnin kuluttua partikkelit poistettiin suodattamalla ja pestiin 1-prosenttisella Na^PO^llä, pH = 4,5.

Entsyymiaktiivisuus suhteessa silloittumisvaiheeseen oli 55,1 %.

ie 85283

Esimerkki 15 40 g kantajapartikkeleita, jotka oli valmistettu esimerkissä 4 kuvatulla tavalla ja joiden kuiva-ainepitoisuus oli 98,8 %, ja 24 g vakuumihaihdutettua, osittain puhdistettua Bacillus coagulans glukoosi-isomeraasi-(NRRL 5650)-konsen-traattia, johon oli lisätty 5 % glukoosia ja 8 % natrium-sulfaattia (kuiva-aine 41,8 %) sekoitettiin keskenään ja neste syrjäytti vakuumikäsittelyn kautta partikkelien huokosissa olleen ilman. Paino sekoituksen jälkeen oli 63,22 g. Kuiva-aine oli 79,2 %.

18 g tätä valmistetta ( ~ 14 g kuiva-ainetta) käsiteltiin tunnin ajan huoneen lämpötilassa 375 ml:n kanssa liuosta, joka sisäksi kaikissa tapauksissa 22 % natriumsulfaattia, 5 % glukoosia ja 1 % natriumfosfaattia säädettynä pH-arvoon 7,5 ja edelleen joko 0,1 tai 0,2 tai 0,3 % glutaraldehydiä.

Tämän käsittelyn jälkeen valmisteet pestiin viisi kertaa n. 150 ml:lla 1 %:sta natriumfosfaattia, pH 7,5.

Entsyymiaktiivisuus määritettiin menetelmän AF 189/1 mukaisesti valuttaen neste partikkeleista. Myöskin kuiva-aine määritettiin valutetuista partikkeleista.

% kuiva- U/g U/g Saanto, Iitmobil.

ainetta märkä kuiva %_ saanto, %

Entsyymi- 41 3 1415 3385 - konsentraatti ' i4ib J,:5öb

Entsyymikon- sentraatti + 79,2 463 585 86 kantaja

Iranobilisoitu c .. co AO, Q, 0,1 »:11a GA 32'5 158 486 72 83

Iiimobilisoitu Q .... _co 0,2 »:11a GA 38'9 141 362 53 62

Inmobilisoitu .Q - 0,3'%:11a GA " 11' b/ i7 85283 Näytteet, jotka olivat ekvivalentit 5 g:lie kuiva-ainetta testattiin painehäviön suhteen.

Immobilisoinnissa käytetty Painehäviö glutaraldehydikonsentraatio 25 h 50 h 0,1 % 3 5 0,2 % 1 3 0,3 % 2 3

Es imorkk i 10

Sama sekoittaja kuin esimerkissä 4, ts. Lödige FM 130 D, täytettiin 3 kgrlla selluloosakuituja ja 13,5 kg:lla Clarcel Celite'ä ja ruiskutettiin 15 kg:n kanssa 10 %:sta paino/tila-vuus polyetyleeni-imiiniä PEI 15 T, Taihei Sangyo Kaisha Ltd., sopivassa lämpötilassa, sen jälkeen 3,0 kg:n kanssa vettä ja lopuksi 2 kg:n kanssa 50 %:sta paino/tilavuus glutaralde-hydiä. Käsittelyaika ja sekoittajan ja leikkurin pyörimisnopeus oli valittu siten, että saatiin halutun kokoisia partikkeleita. Partikkelit kuivattiin leijupedissä.

Esimerkki 17

Sama sekoittaja kuin esimerkissä 4, ts. Lödige FM 130 D, täytettiin 3 kg:lla selluloosakuituja ja 12,0 kg:lla aktiivi-hiiltä Pecactif FGV (valmistajalta Peca S.A., Levallois,

Cedex, Ranska) ja ruiskutettiin 20,0 kg:n kanssa 10 %:sta paino/paino gelatiiniliuosta Bloom 200 ja lopuksi 4,5 kg:n kanssa vettä. Käsittelyaika ja sekoittajan ja leikkurin pyörimisnopeudet valittiin siten, että saatiin halutun kokoisia partikkeleita. Partikkelit kuivattiin leijukerroksessa.

Keksinnön mukaisesti valmistetun immobilisoidun entsyymituot-teen käyttökelpoisuus ilmenee seuraavasta sovellutuskokeesta. Immobilisoitu glukoosi-isomeraasituote valmistettiin kuten esimerkissä 12. Tuote sisälsi 32,6 paino-% osittain puhdistettua glukoosi-isomeraasia ja silloittaminen suoritettiin kuten esimerkissä 12.

27,6 g:lla kosteita partikkeleita, sen jälkeen kun ne oli is 85283 pesty 1 %: sella paino/tilavuus natrimnfosfaatilla (pH = 7,0) ja jotka vastasivat 10 g:aa partikkelikuiva-ainetta, täytettiin vesivaipallinen kolonni, jonka halkaisija oli 1,5 cm. Kolonni pidettiin 65°C:ssa ja 45 % paino/paino glukoosisii-rappia pH:ssa 7,8 (säädettiin ^200^:113) pumpattiin jatkuvasti entsyymikerroksen läpi nopeudella, jolla saatiin 40-42 %:n konversio glukoosista fruktoosiksi. Alkuaktiivisuus oli 538 IGIC/g valmisteen kuiva-ainetta (aktiivisuus laskettiin julkaisun N0V0 Analyseforskrift AF 147/6 mukaisesti) ja aktiviteettipuoliaika määritettiin 450 tunniksi. Poistu-mis-pll oli 7,4-7,5.

Vertailun vuoksi voidaan mainita, että laajasti käytetyllä (S) kaupallisella immobilisoidun glukoosi-isomeraasin Sweetzyme** aktiivisuus on 225-300 IGIC/g ja sama aktiviteettipuoliaika, ja poistumis-pH:n saamiseksi Sweetzyme'llä arvoon 7,4-7,5 yllä osoitetuissa olosuhteissa, ts. 65°C:ssa ja 45-prosentti-sella paino/paino glukoosisiirapilla, syöttöhappamuuden tulee olla pH 8,2.

Claims (12)

1. Menetelmä partikkelimaisen, immobilisoidun entsyymi-valmisteen tuottamiseksi, valmisteen käsittäessä kantajan, jonka pinnalle entsyymi on kiinnittynyt, tunnettu siitä, että kantaja on valmistettu yhdistämällä kaksi faasia, ts. a) jatkuva vesiliukoisen sidosaineen faasi, jossa sidosaine ainakin osittain on liuenneena tai dispergoituneena vesipitoiseen väliaineeseen, ja b) epäjatkuva useiden erillisten, kovien ja inerttien partikkeleiden faasi, jossa partikkelien koko on riittävän pieni ollakseen vaikuttamatta kantajan muotoutumiseen, ja saattamalla sidosaine liukenemattomaksi väliaineeseen, jossa entsyymiä entyymivalmisteen tuottamisen jälkeen tullaan käyttämään, mikäli välttämätöntä, ja jossa kantaja on kosketuksissa sen entsyymin kanssa, joka on kiinnittynyt kantajan pintaan.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kahden komponentin yhdistelmä on jatkuvan ja epäjatkuvan faasin seos, ja että seos muovataan partikkeli-muotoiseksi, edullisesti pallomuotoiseksi kantajaksi.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sidosaine muodostuu geelin muodostavasta aineesta tai sisältää sitä ja että seos ekstruoidaan ja tiputetaan geeliä muodostavaan väliaineeseen, jolloin silloitava aine voidaan lisätä missä tahansa näistä vaiheista.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että geeliyttävä aine on gelatiini, alginaatti, karrageenan tai kitosaani.

5. Patenttivaatimusten 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että epäjatkuvan faasin määrä on n. 10 - n. 98 pai-no-% kantajan kokonaispainosta, edullisesti 50-95 paino-% kantajan kokonaispainosta.

6. Patenttivaatimusten 1-5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että yksittäisen inertin partikkelin lineaarinen 20 85283 koko epäjatkuvassa faasissa, laskettuna yksittäisen inertin partikkelin kanssa saman tilavuuden omaavan pallon halkaisijana, on alle 1/5 kantajapartikkelin halkaisijasta, edullisesti alle 1/20 kantajapartikkelin halkaisijasta.

7. Patenttivaatimusten 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että jatkuva faasi on saatettu liukenemattomaksi silloittamalla sopivan silloittavan aineen, edullisesti glutaraldehydin avulla.

8. Patenttivaatimusten 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kantajan muoto on pallomainen, ja että kantajan keskihalkaisija on välillä 0,1 ja 5 mm, edullisesti välillä 0,2 ja 2 mm, edullisimmin välillä 0,2 ja 1 mm.

9. Patenttivaatimusten 1-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kantajaa käsitellään entsyymiliuoksella ja silloittavalla aineella.

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kantaja viedään torniin fluidisoituna massana ja että liukoisen entsyymin liuos viedään torniin suihkuna, minkä jälkeen näin saatu massa poistetaan tornista ja käsitellään silloittavalla aineella.

11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kantaja viedään torniin fluidisoituna massana ja että liukoisen entsyymiliuoksen ja silloittavan aineen seos viedään torniin suihkuna, minkä jälkeen näin saatu massa poistetaan tornista.

12. Patenttivaatimusten 1-11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsyymi on glukoosi-isomeraasi, joka edullisesti on peräisin lajista Bacillus coagulans. 2i 85283