NL8303414A

NL8303414A - Werkwijze ter bereiding van een geimmobiliseerd enzympreparaat.

Info

Publication number: NL8303414A
Application number: NL8303414A
Authority: NL
Original assignee: Novo Industri As
Priority date: 1982-10-06
Filing date: 1983-10-05
Publication date: 1984-05-01
Also published as: FI85283B; DK442783A; JPS5985291A; DK149079C; CA1209936A; IE832346L; IT8323148A0; ES526246A0; AR241793A1; FI833614A; IE56080B1; DK149079B; FR2541305B1; DK442783D0; FI85283C; IT1163946B; ES8600392A1; US4572897A; BE897925A; FR2541305A1

Description

Ν.Ο. 52040

Werkwijze ter bereiding van een geïmmobiliseerd enzympreparaat.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze ter bereiding van een deeltjesvormig, geïmmobiliseerd enzympreparaat bestaande 5 uit een drager, aan het oppervlak waarvan het enzym is verbonden. Het oppervlak van de drager dient hier te worden verstaan als het uitwendige oppervlak, alsmede het inwendige oppervlak in het geval van een poreuze drager.

Het gebied, dat geïmmobiliseerde enzymen en dragers voor het immo-10 biliseren van enzymen omvat, is snel groeiende. Gewoonlijk heeft de drager de vorm van kleine, mogelijk zwaarder gemaakte deeltjes, waarin het enzym is ingebed, aan of op het oppervlak waarvan het enzym is verbonden of gefixeerd. Verwezen wordt naar Amerikaans octrooischrift 4.266.029, Amerikaans octrooischrift 4.116.771 en Deens octrooischrift 133.380, die 15 slechts drie voorbeelden van dragers, waarop of waarin enzymen zijn gefixeerd, bekend in de techniek zijn.

De drager, die in verband met de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding gebruikt wordt, behoort tot de categorie dragers, aan het oppervlak waarvan het enzym is verbonden, in tegenstelling tot de catego-20 rie dragers, waarin het enzym door het totale volume van de drager is verdeeld.

Een gebruikelijke bekende drager, die tot de zo juist aangegeven categorie dragers behoort, aan het oppervlak waarvan het enzym wordt verbonden, bestaat uit granulair gelatine en is beschreven in Derwent 25 08061 C/5 (J 5 4156-892). Deeltjes van zuivere gelatine zijn echter niet hard genoeg voor gebruik bij bewerkingen in een vast bed op grote schaal, waar zeer hoge stroomsnelheden vereist zijn. Ook zijn deeltjes van zuivere gelatine relatief duur.

Een soortgelijke drager, die eveneens tot deze categorie behoort, 30 waarbij een inerte kern met gelatine is bekleed, kan bereid worden volgens het Amerikaanse octrooischrift 4.266.029. Hoewel deze drager goede stromingseigenschappen heeft, heeft deze van het nadeel te leiden, dat de vorm en de grootte van de dragerdeeltjes niet gekozen kan worden volgens de kriteria voor het beste gedrag in een kolom, maar bepaald worden 35 met de speciale zandfraktie of andere fraktie van deeltjesvormig dicht als grondstof gebruikt materiaal. Voorts is, terwijl het gemakkelijk is deze drager op laboratoriumschaal te bereiden, moeilijk of zelfs onmogelijk deze drager op industriële schaal te bereiden.

Een andere gebruikelijke bekende drager, die tot deze categorie 40 hoort, is beschreven in Advances in Experimental Medicine and Biology, ---- - - --- j 1 . " 2 42, 191-212, Immobilized Blochemlcals and Affinity Chromatography. Deze drager bestaat uit glasparels met een sllaankoppelingsmiddel. Deze parels hebben uitstekende stromingseigenschappen en een relatief hoge be-ladingscapaciteit. Zij zijn echter zeer duur, en zoals alle andere anor-5 ganische dragers, dient om deze geschikt te maken voor het immobiliseren van enzymen, een ingewikkelde chemische behandeling te worden uitgevoerd, met inbegrip van het gebruik van ongewenste materialen.

Derhalve is een doelstelling van de uitvinding het verschaffen van een werkwijze voor de bereiding van een geïmmobiliseerd enzym, dat een 10 drager bevat, aan het oppervlak waarvan het enzym is verbonden, waarbij deze drager alle boven opgesomde gunstige eigenschappen vertoont, d.w.z. een voldoende hardheid, het vermogen om op industriële schaal en door middel van een eenvoudige chemische behandeling en lage produktiekosten bereid te worden.

15 Nu is volgens de uitvinding een werkwijze ter bereiding van een deeltjesvormig, geïmmobiliseerd enzympreparaat gevonden, dat een drager omvat, aan het oppervlak waarvan het enzym is verbonden, waarbij de drager gevormd wordt door combinatie van twee fasen, d.w.z. a) een continue fase van een in water oplosbaar bindmiddel, dat ten minste ten dele in 20 een water bevattend milieu is opgelost of gedispergeerd, en b) een discontinue fase van een groot aantal afzonderlijke, harde en inerte deeltjes, waarvan de afmeting klein genoeg is om de vorming van de drager te belemmeren en door het bindmiddel indien noodzakelijk in het milieu, waarin het enzym eventueel zal worden gebruikt, onoplosbaar te 25 maken en waarin de drager in kon takt wordt gebracht met een enzym, dat aan het oppervlak van de drager wordt verbonden. Wanneer het milieu, waarin het geïmmobiliseerde enzym tenslotte zal moeten worden gebruikt, een water bevattend milieu is, zal het noodzakelijk zijn het (oorspronkelijke) in water oplosbare bindmiddel door een chemische of fysische 30 behandeling, bijvoorbeeld door verknopen of verhitten, onoplosbaar te maken. Wanneer het milieu, waarin het geïmmobiliseerde enzym tenslotte zal moeten worden gebruikt, een niet water bevattend milieu is, kan het (oorspronkelijke) in water oplosbare bindmiddel in dit niet water bevattende milieu onoplosbaar zijn en in dit geval kan het dus niet noodzake-35 lijk zijn het bindmiddel onoplosbaar te maken. Volledigheidshalve wordt de aandacht gevestigd op het feit dat de drager andere bestanddelen naast de boven aangegeven noodzakelijke bestanddelen a) en b), bijvoorbeeld vulstoffen en/of hulpmiddelen voor het granuleren, kan bevatten.

Verrassenderwijze werd volgens de uitvinding gevonden, dat de werk-40 wijze volgens de uitvinding aan de boven aangegeven doelstelling van de 3 * * uitvinding voldoet* Eveneens verrassenderwijze werd gevonden, dat de drager zijn uitstekende fysische samenhang behoudt zelfs bij zeer hoge verhoudingen van de inerte deeltjes tot ongeveer 98 gew.%, in verhouding tot het gewicht van de drager. Dit is zeer belangrijk, aangezien hoe 5 groter de verhouding van de inerte deeltjes (tot de boven aangegeven bovengrens) hoe harder de drager en hoe lager de kosten ervan.

Wanneer het geïmmobiliseerde enzym een lipase is en het lipase bestemd is lipiden in een petroleumetheroplossing onderling te veresteren, dan kunnen eiwit, caseïne, sojaprotelne, hydroryethylcellulose, agar, 10 alginaat, polyvinylalkoholen, zetmeel, methylcellulose of carboxymethyl-cellulose als bindmiddel gebruikt worden, daar deze materialen in petroleumether onoplosbaar zijn. Slechts een losse verbinding tussen de drager en het enzym is in dit geval vereist. Wanneer anderzijds het enzym, waarmee de drager eventueel zal worden gebruikt, amyloglycosidase is, en 15 het amyloglycosidase bestemd is om dextrinen in water bevattende oplossing te splitsen, dan zal het noodzakelijk zijn het (oorspronkelijk) in water oplosbare bindmiddel onoplosbaar te maken. Gewoonlijk zal het amyloglycosidase verbonden worden aan of gefixeerd worden op het oppervlak van de drager door met glutaaraldehyd te verknopen.

20 Het spreekt vanzelf, dat niet elke combinatie van een of ander en zym en elk van de twee dragerfasen a) en b) noodzakelijkerwijze werkzaam is. De in de techniek deskundige werker zal weten, dat sommige enzymen bepaalde kationen, die in kleine hoeveelheden uit fase b) kunnen worden afgegeven, niet kunnen verdragen en ook, wanneer het geïmmobiliseerde 25 enzym bestemd is voor gebruik in de voedingsmiddelenindustrie, sommige bestanddelen van de fase a) minder gewenst kunnen zijn, tengevolge van lekkage van nadelige bestanddelen in de afvoerstroom uit de enzymreak-tor.

Geïmmobiliseerde glucoseisomerase, door ionenuitwisseling verbonden 30 aan een drager, bestaande uit vezelachtige, ionenuitwisselende cellulose opgenomen in een hydrofoob polymeer, dat eventueel een verdichtingsmid-del zoals verpoederde metaaloxiden bevat, wordt in de Deense octrooiaanvrage 1592/78 (Standard Brands), overeenkomende met het Amerikaanse oc-trooischrift 4.110.164 of het Belgische octrooischrift 865.900 beschre-35 ven. De drager wordt bereid door het hydrofobe polymeer te smelten en het cellulose en het verdichtingsmiddel in het gesmolten polymeer te mengen. Deze methode leidt echter tot een aantal nadelen. In de eerste plaats is de prijs van dergelijke hydrofobe polymeren tamelijk hoog en in de tweede plaats is het veel gemakkelijker met water bevattende op-40 lossingen of suspensies van bindmiddelen volgens de onderhavige uitvin-- - · r : i ‘ i - 4 * * 4 ding te werken dan met gesmolten hydrofobe polymeren. Ook is de methode, beschreven in de Deense octrooiaanvrage 1592/78, strikt beperkt tot enzymen, die op ionenuitwisselingsharsen geïmmobiliseerd zijn, d.w.z. met een monomolekulaire laag enzym, terwijl de onderhavige uitvinding aange-5 past is aan alle methoden verbindingen van enzymen aan de drager en op monomolekulaire lagen van enzymen alsmede multimolekulaire lagen van enzymen. Derhalve is het bijvoorbeeld in het geval van glucoselsomerase tengevolge van deze vrije keuze van dikte van de enzymlaag raogelijk zeer hoge waarden van specifieke aktiviteit volgens de onderhavige uitvinding 10 te verkrijgen, terwijl de maximum waarde voor de specifieke aktiviteit van het geïmmobiliseerde glucoselsomerase, beschreven in de Deense octrooiaanvrage 1592/78 relatief laag is en duidelijk te laag voor industriële toepassingen.

De werkwijze volgens de uitvinding voor het combineren van de twee 15 fasen, die de voorkeur verdient, is het mengen van de continue fase en de discontinue fase, waarna het mengsel vervolgens tot de deeltjesvormi-ge drager, bij voorkeur bolvormig, gevormd wordt. Hierbij worden goedkope en gemakkelijk verkrijgbare dragerdeeltjes verkregen.

Methoden volgens de stand der techniek voor de bereiding van gela-20 tinebolletjes of ronde gelatinedeeltjes zijn tamelijk kostbaar en vervelend. Verwezen wordt naar het Deense octrooischrift 133.380, waarin beschreven wordt, dat dergelijke gelatinedeeltjes bereid worden door toevoeging van een water bevattende oplossing van gelatine (en enzym) aan n-butanol en afscheiding van de gevormde, druppelachtige deeltjes. Vol-25 gens de uitvinding werd echter gevonden, dat bolletjes of ronde deeltjes van een mengsel van een bindmiddel en een inert materiaal op een veel goedkopere wijze vervaardigd kunnen worden, bijvoorbeeld door middel van een Marumerizer (zie bijv. Amerikaans octrooischrift 3.277.520) of door middel van een speciale granuleringsinrichting (zie bijv. Amerikaans oc-30 trooischrift 4.106.991). Voorts verleent de insluiting van een grote aantal kleine harde deeltjes een zeer grote hardheid aan de dragerdeel-tjes, waardoor derhalve de stromingseigenschappen ervan aanzienlijk verbeterd worden, en zij geschikt worden gemaakt voor kolombewerkingen op grote schaal bij een zeer grote stroming.

35 Volgens een werkwijze van de onderhavige uitvinding, die de voor keur verdient, is de vorming een bolletjesvormende behandeling, die wordt uitgevoerd in een Marumerizer volgens het Amerikaanse octrooischrift 3.277.520. Op deze wijze kunnen bolletjes, die geschikt zijn voor toepassing in een kolom en met uitstekende fysische eigenschappen 40 bereid worden.

% 5 '

Bij een werkwijze volgens de uitvinding, die de voorkeur verdient, is de vorming een bolletjesvormende behandeling uitgevoerd in een granu-leerinrichting zoals beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 4.106.991* Op deze wijze kunnen zeer goedkope bolletjes met uitstekende 5 fysische eigenschappen voortgebracht worden.

Bij een werkwijze volgens de uitvinding, die de voorkeur verdient, wordt een geleerbaar middel aan de continue fase voor, tijdens of na het mengen met de discontinue fase toegevoegd, waarna de aldus verkregen massa in een geleringsmedium wordt geëxtrudeerd of gedruppeld, waarbij 10 een verknopingsmiddel bij elk van deze trappen kan worden toegevoegd.

Hierbij kunnen deeltjes met zeer regelmatige vormen verkregen worden.

Bij een werkwijze volgens de uitvinding, die de voorkeur verdient, is het geleerbare middel gelatine, alginaat, carrageenan of chitosan.

Hierbij kunnen deeltjes met zeer regelmatige vormen en met een uitste-15 kende cohesie verkregen worden.

Bij een werkwijze volgens de uitvinding, die de voorkeur verdient, is het geleringsmilieu een oplossing, die Ca·*"*, Ba"^, K*, po- lyfosfaat of ijzer(IIÏ)cyanide bevat of koud water of een stroom koude lucht. Hierbij kunnen deeltjes met zeer regelmatige vormen en een uit-20 stekende cohesie verkregen worden.

Bij een werkwijze volgens de uitvinding, dié de voorkeur verdient, is de continue fase een in water oplosbaar proteïne, in het bijzonder gelatine, sojaprotelne, caseïne, eiwit, zelne, gluten, of een protelne-hydrolysaat of een polysaccharide, in het bijzonder agar, alginaat of 25 andere gommen, meel, zetmeel of chitosan, of een synthetisch materiaal, carboxymethylcellulose, methylcellulose, ethylcellulose, hydroxyethyl-cellulose, hydroxypropylcellulose, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon of natriumsilicaat. De continue fase kan een willekeurig mengsel van de bij de uitvinding bruikbare bindmiddelen zijn, bijvoorbeeld een wille-30 keurig mengsel van de hierboven aangegeven materialen. Met deze bindmiddelen is het mogelijk een drager met uitstekende fysische eigenschappen te ontwikkelen, zelfs in een zeer kleine verhouding in verhouding tot de discontinue fase.

Bij een werkwijze volgens de uitvinding, die de voorkeur verdient, 35 is de discontinue fase diatomeeënaarde, fijn gestampt zand, steenstof, klei, nylonpoeder, onoplosbare metaaloxiden of onoplosbare metaalzouten, gemalen siliciumdioxide, aerosil, gemalen aluminiumoxiden, corund, gemalen glas, gemalen keisteen, gemalen kwarts, gemalen graniet, aluminiumfosfaat, kaolien, bentoniet, perliet, zeolieten, calciumsili-40 caat, microcelfilterhulpmiddel, fijn gestampt magnesiumsilicaat, talk, ' , * 6 asbest, afgeschuurde hoornblende, titaandioxide, tin(IV)oxide, polijst" poeder, gemalen zirkoniumsilicaat, roet, aktieve kool, beendermeel, vliegas of fijn verdeelde metalen. De discontinue fase kan een willekeurig mengsel zijn van de afzonderlijke, harde en inerte deeltjes, die bij 5 de uitvinding geschikt zijn, bijvoorbeeld elk mengsel van de boven aangegeven materialen. Deze materialen zijn goedkoop en geven aanleiding tot een drager met goede mechanische eigenschappen.

Bij een werkwijze volgens de uitvinding, die de voorkeur verdient, ligt de hoeveelheid van de discontinue fase tussen ongeveer 10 en onge-10 veer 98 gew.%, in verhouding tot het totale gewicht van de drager, bij voorkeur tussen 50 en 95 gew.%, in verhouding tot het totale gewicht van de drager. Op deze wijze wordt een goede combinatie van lage kosten en uitstekende fysische eigenschappen van de drager verkregen.

Bij een werkwijze volgens de uitvinding, die de voorkeur verdient, 15 is de lineaire afmeting van een enkelvoudig inert deeltje in de discontinue fase, berekend als de diameter van het bolletje met hetzelfde volume als het enkelvoudige inerte deeltje kleiner dan 1/5 van de diameter van het dragerdeeltje, bij voorkeur kleiner dan 1/20 van de diameter van het dragerdeeltje. Met dergelijke afmetingen van de inerte deeltjes kan 20 de vorming zonder moeilijkheden worden uitgevoerd.

Bij een werkwijze volgens de uitvinding, die de voorkeur verdient, wordt de continue fase onoplosbaar gemaakt door verknoopt te worden door middel van een geschikt verknopingsmiddel, bij voorkeur glutaaraldehyd. Op deze wijze wordt de mechanische samenhang van de dragerdeeltjes ver-25 der verbeterd.

Bij een werkwijze volgens de uitvinding, die de voorkeur verdient, is de vorm van de drager bolvormig of afgerond en ligt de gemiddelde dragerdiameter tussen 0,1 en 5 mm, bij voorkeur tussen 0,2 en 2 mm, meer bij voorkeur tussen 0,2 en 1 mm. Hierbij wordt een drager met een zeer 30 goed compromis tussen stromingseigenschappen en specifiek oppervlak verschaft.

Bij een werkwijze volgens de uitvinding, die de voorkeur verdient, wordt de drager met een oplossing van het enzym en met een verknopingsmiddel behandeld. Hierbij wordt een prachtige adhesie tussen drager en 35 enzym verkregen en derhalve een geïmmobiliseerd enzym, dat een uiterst goede fysische houdbaarheid heeft.

Bij een werkwijze volgens de uitvinding, die de voorkeur verdient, wordt de drager in een toren gebracht als een gefluldiseerde massa en wordt de oplossing van oplosbaar enzym aan de toren als een nevel toege-40 voerd, waarna de aldus voortgebrachte massa uit de toren wordt verwij- 7 ' derd en met het verknopingsmiddel wordt behandeld. Hierbij kan het geïmmobiliseerde enzym volgens de uitvinding met een zeer hoge belasting van het enzym op de drager, voortgebracht worden.

Bij een werkwijze volgens de uitvinding, die de voorkeur verdient, 5 wordt de drager in een toren als een gefluldiseerde massa gebracht en wordt een mengsel van de oplossing van oplosbaar enzym en verknopingsmiddel in de toren als een nevel toegevoerd, waarna de aldus voortgebrachte massa uit de toren wordt verwijderd. Hierbij kan het geïmmobiliseerde enzym volgens de uitvinding met een zeer hoge belasting van het 10 enzym op de drager worden voortgebracht.

In verband met de voorkeursuitvoeringsvormen, aangegeven in de twee voorafgaande alinea’s dient overwogen te worden, dat de drager, het verknopingsmiddel, het enzym en verdere middelen, indien aanwezig, in elke willekeurige volgorde bij elkaar gebracht kunnen worden. Dergelijke ver-15 dere middelen kunnen bijvoorbeeld hulpmiddelen voor het granuleren (bijvoorbeeld cellulosevezels of zeer kleine, harde en inerte deeltjes), oplosbare materialen, bestemd als middelen voor het vergroten van de poreusheid (bijv. NaCl) of andere proteïnen zijn.

Bij een werkwijze volgens de uitvinding, die de voorkeur verdient, 20 is het enzym een glucoseïsomerase, dat bij voorkeur afkomstig is van Bacillus coagulans. Gebleken is dat het aldus bereide geïmmobiliseerde glucoseïsomerase verschaft kan worden met een uitstekend aktiviteitsher-stel en met superieure eigenschappen met betrekking tot het continue kolombedrijf.

25 Het geïmmobiliseerde enzympreparaat volgens de uitvinding kan als een laag in een kolom worden gebracht, waarna een oplossing van het substraat voor het enzym door deze laag wordt geleid met een snelheid, die het toelaat dat ten minste een deel van het substraat door het enzym wordt omgezet.

30 De volgende voorbeelden lichten de werkwijze volgens de uitvinding toe. In sommige voorbeelden wordt alleen de bereiding van de drager beschreven. Voor al deze voorbeelden spreekt het vanzelf, dat de drager behandeld wordt met dezelfde enzymoplossing zoals aangegeven in voorbeeld 12 en verder behandeld waarbij een geïmmobiliseerd enzym werd 35 voortgebracht.

In het volgende wordt verwezen naar verschillende NOVO literatuur-referenties. Kopieën van al deze referenties kunnen verkregen worden bij NOVO Industri A/S, Novo Allé, 2880 Bagsvaerd, Denemarken.

In sommige gevallen wordt een waarde voor de drukval (fysische 40 sterkte) tijdens het bedrijven van de kolom aangegeven. Deze waarde ' 8 wordt bepaald volgens AF 166/2, dat een beschrijving is van een labora-toriummethode van NOVO. Sommige theoretische overwegingen, die verband houden met deze bepaling van de drukval zijn beschreven in Starch/StSrke 31 (1979) Nr. 1, blz. 14-16. Ter vergelijking met bekende handelsproduk-5 ten, kan vermeld worden, dat de beste waarden voor de drukval voor de geïmmobiliseerde glucoselsomerasepreparaten SWEETZYME ongeveer 10 g/cm^ is. Uit de voorbeelden blijkt, dat drukvallen met de geïmmobiliseerde enzympreparaten, bereid voor middel van de werkwijze volgens de uitvinding, slechts 2 g/cm^ kunnen zijn en dat alle waarden aanzienlijk lager 10 zijn dan 10 g/cm^, waardoor het technische voordeel van de uitvinding duidelijk is aangetoond.

Voorbeeld I

10 g Gelatine Bloom 260 werden in 60 ml Η£θ gedispergeerd, 33 g 15 6 gew./vol.% Na-alginaat werden toegevoerd, het mengsel werd tot 60°C

verwarmd om het gelatine op te lossen, vervolgens werden 10 g Hyflo Celite (diatomeeënaarde) toegevoegd, werd het gehele mengsel gedurende 10 minuten bij 55°C geroerd en door een vibrerende spuit gepompt om zeer fijne druppels voort te brengen, die in een op 5°C gehouden oplossing 20 van 2 gew./vol.% CaCl2 2Η£θ vielen. De aldus voortgebrachte bolvormige deeltjes werden gedurende enkele minuten in de CaCl2~oplossing geroerd, daarna uit de oplossing verwijderd, met gedeloniseerd water gewassen en gedurende 2 dagen bij kamertemperatuur gedroogd. De deeltjes werden vervolgens voorzichtig gedurende 1 uur in 200 ml 1 gew./vol.% 25 glutaaraldehydoplossing bij een pH van 8,5 geroerd, verwijderd, in gede-ioniseerd water gewassen en opnieuw gedroogd. Op deze wijze werden bolvormige en uiterste harde en samenhangende deeltjes met een diameter van ongeveer 2 mm verkregen, die uitstekende stromingseigenschappen vertoonden. De drukval was 2 g/cm^. De deeltjes konden met citraat of fosfaat 30 behandeld worden om het 034-1- en het alginaat, desgewenst te verwijderen zonder enig nadelig effekt op de deeltjes.

Voorbeeld II

De in voorbeeld I beschreven methode werd herhaald, behalve dat de 35 halve hoeveelheid gelatine, d.w.z. 5 g en tweemaal zoveeel Hyflo Celite, d.w.z. 20 g, werden gebruikt en dat de deeltjes voorafgaande aan de behandeling met glutaaraldehyd niet werden gedroogd. Op deze wijze werden in hoofdzaak identieke deeltjes verkregen met een enigszins verminderde hardheid, echter toch met bijna dezelfde uitstekende stromingseigen-40 schappen. De drukval was 3 g/cm2.

9

•V

w «

Voorbeeld III

De in voorbeeld II beschreven methode werd herhaald, behalve dat gelatine Bloom 200 werd gebruikt en dat de hoeveelheid daarvan tot 4 g werd verminderd. De concentratie van glutaaraldehyd werd eveneens tot 5 0,2 gew./vol.% verminderd. Deeltjes met in hoofdzaak identieke eigen schappen werden op deze wijze verkregen.

Voorbeeld IV

In dit voorbeeld werd semi-technische apparaat gebruikt. Zo werden 10 0,7 kg cellulosevezel, type Arbocel BC 200, 2,8 kg Clarcel Celite (dia-tomeeënaarde) en 4 kg 20 gew.Z gelatine Bloom 200 oplossing, alle bij 60°C, in een ploegschaarmenger van het type Lödige FM 130 D gemengd en de aldus verkregen dikke massa werd door een extrusielnrichting, voorzien van een zeef van 1,5 mm geëxtrudeerd en vervolgens in een 15 Marumerizer ® , zoals beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 3.277.520 tot bolletjes verwerkt. De extrusielnrichting was van het dubbele schroeftypemodel EXDC-100 en het model van de bolvormingsinrichting was Q-400. De aldus verkregen deeltjes werden in een toren met gefluldi-seerd bed (Glatt type WSG 15) gedroogd en gezeefd en de fraktie van 1,2 20 - 2,0 mm werd verzameld,,waarbij het residu in kringloop werd gebracht.

Een monster van 10 g werd vervolgens 3 uren bij kamertemperatuur met 100 ml 1 g gew./vol.Z glutaaraldehydoplossing ingesteld op een pH van 7,0 behandeld, uit de oplossing verwijderd en grondig met gedeloniseerd water gewassen. Zelfs zonder drogen waren de aldus verkregen deeltjes ui-25 terst hard en samenhangend en met uitstekende stromingseigenschappen. De drukval was 2 g/cm^. In dit voorbeeld maakte de discontinue fase 65 gew.Z van het deeltje uit*

Voorbeeld V

30 In dit voorbeeld werd dezelfde Marumerizer gebruikt als in voor beeld IV, behalve dat geen extrusielnrichting werd gebruikt. Voorts werd het gehalte van de discontinue fase verhoogd tot 94 gew.Z van het totale gewicht van de drager. Derhalve werden 1,5 kg Skamol kleideeltjes met een deeltjesgrootte van 0,7-1,0 mm in de bolvormingsinrichting gebracht 35 en werden 0,4 kg Hyflo Celite en 1,15 kg 10 gew.Z gelatine Bloom 80 oplossing bij 60°C afwisselend toegevoegd om vorming van klonten te vermijden. De aldus verkregen deeltjes werden zoals in voorbeeld IV behandeld, waarbij zeer harde deeltjes met zeer goede stromingseigenschappen werden ontwikkeld. De drukval was 5 g/cm^.

40

, ‘ 10 Voorbeeld VI

In dit voorbeeld werd een granuleerinrlchtlng van een menger van het ploegschaartype, Lödige FM 50, voorzien van een hakinrichting met grote snelheid, als beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 5 4.106.991, gevuld met 5,0 kg Clarcel Celite en 5,95 kg 16 gew.% gelatine

Bloom 200 werden erin verneveld, waarbij de behandelingstijd en de rota-tiesnelheden van de menger en de hakinrichting op een zodanige wijze werden gekozen, dat een deeltjesgrootte van 0,7-1,5 mm werd ontwikkeld. Deze deeltjes werden zoals in voorbeeld IV behandeld, waarbij drager-10 deeltjes met in hoofdzaak dezelfde eigenschappen als in voorbeeld IV werden ontwikkeld. De drukval bedroeg 4 g/cm^.

Voorbeeld VII

1 kg Cellulosevezel, 4 kg Clarcel Celite en 10 kg in kringloop ge-15 bracht materiaal, voortgebracht volgens dit voorbeeld, werden met 10,5' kg 10 gew.% gelatine Bloom 200 in een ploegschaarmenger van het type Lödige FM 130 D verneveld, waarbij ronde deeltjes van verschillende afmeting werden ontwikkeld. Tijdens alle hiervoor beschreven bewerkingen werden zowel de bestanddelen als de apparatuur op 55°C gehouden. De ron-20 de deeltjes werden in een toren met een gefluldiseerd bed gedroogd en gezeefd en de fraktie van 0,5-0,7 mm, die 32 % vormde, werd verzameld. Het residu, dat grovere deeltjes bevatte, die werden gemalen en fijne bestanddelen, die direkt werden gebruikt, werden in kringloop gebracht zoals beschreven in het begin van dit voorbeeld.

25

Voorbeeld VIII

Dezelfde menger als in voorbeeld IV, d.w.z. Lödige FM 130 D, werd met 3 kg cellulosevezel, 10,5 kg Clarcel Celite en 1,5 kg eiwit bij omgevingstemperatuur gevuld en met 15,2 kg water besproeid. De behande-30 lingstijd en de rotatiesnelheden van de menger en de hakinrichting werden op een zodanige wijze gekozen, dat deeltjes van de voorkeursgrootte werden ontwikkeld. De deeltjes werden in een gefluldiseerd bed gedroogd en een zeefanalyse bij de gedroogde deeltjes liet de volgende deeltjes-grootteverdeling zien: 35 ) 1000 ym 19,7 % > 850 - 35,6 % > 707 - 58,8 % > 600 - 78,2 % > 500 - 92,1 % 40 < 420 - 1,1 % -v 11 ·> ί

Voorbeeld IX

De methode van voorbeeld VIII werd herhaald, behalve dat het eiwit vervangen werd door 1,5 kg isoëlektrisch oplosbaar sojaproteïnehydroly-saat en dat de hoeveelheid water 14,8 kg was. De zeefanalyse bij de ge-5 droogde deeltjes liet de volgende deeltjesgrootteverdeling zien:

> 1000 ym 24,2 Z

> 850 - 43,2 Z

> 707 - 66,1 Z

> 600 - 84,4 Z

10 > 500 - 95,2 Z

< 420 - 1,0 Z

Voorbeeld X

Dezelfde menger als in voorbeeld VI, d.w.z. Lödige FM 50, werd met 15 11,3 kg AI2O3 en 3,0 kg cellulosevezel gevuld en met 650 g gelatine

Bloom 200 in 4,55 kg water besproeid. De temperatuur werd op 55°C gehouden. De door de rotatie van de menger en de hakinrichting gevormde deeltjes werden in een gefluldiseerd bed gedroogd. Zeefanalyse liet de volgende deeltjesgrootteverdeling zien:

20 > 1000 ym 8,5 Z

> 850 16,1 Z

> 707 - 31,2 Z

> 600 - 46,2 Z

> 500 - 65,3 Z

25 < 420 - 15,6 Z

Voorbeeld XI

De Lödige FM 130 D menger werd met 2,1 kg cellulosevezel, 8,4 kg Clarcel Celite en 4,5 kg natriumchloride gevuld en met 11,0 kg 10 gew.Z 30 gelatine Bloom 80 besproeid. De temperatuur was 55°C. De deeltjes werden gevormd en gedroogd. Zeefanalyse liet de volgende deeltjesgrootteverdeling zien:

> 1000 ym 14,2 Z

> 850 - 23,7 Z

35 > 707 - 40,1 Z

> 600 - 59,1 Z

> 500 - 79,1 Z

< 420 5,8 Z

: - ' 12 Voorbeeld XII

In dit voorbeeld wordt een werkwijze beschreven voor de bereiding van een geïmmobiliseerd enzympreparaat volgens de uitvinding. Zo werden 4,5 kg dragerdeeltjes, bereid zoals in voorbeeld IV behandeld met glur· 5 taaraldehyd, gewassen en gedroogd in een semi-technisch apparaat met ge-fluldiseerd bed (Glatt type WSG 15) gefluldiseerd en werden 9,3 kg oplossing van 19 gew.% ten dele gezuiverde glucoselsomerase van Bacillus coagulans NRRL 5650 (aktiviteit 3240 eenheden/g droog produkt, welke ak-tiviteitseenheid gedefinieerd is in NOVO analyseforskrift AF 189/1) bij 10 50-55°C op de deeltjes gesproeid en werden de deeltjes gedroogd. Het al dus verkregen produkt bevatte 28 gew.Z ten dele gezuiverde glucoselsomerase met een enzymaktiviteitsherstel van 85 Z. Vervolgens werden 20 g van deze deeltjes behandeld in 500 ml oplossing, die 0,06 mol Na^PO^ .2H2O, 1,4 mol Na2S04 en 0,1 gew./vol.Z glutaaraldehyd, 15 ingesteld met 1 N NaOH op een pH van 7,0, bevatte. Na 1 uur bij kamertemperatuur werden de deeltjes verwijderd en grondig met 0,6 molair na-triumfosfaat met een pH van 7,0 en vervolgens oppervlakkig met gedeloni-seerd water gewassen en een deel daarvan werd gedroogd. Zowel de natte als de gedroogde deeltjes vertoonden dezelfde uitstekende stromingsei-20 genschappen als de oorspronkelijke drager en geen vermindering van aktiviteit kon worden vastgesteld. In de natte deeltjes was echter het enzymaktiviteitsherstel 70 %, terwijl dit in de gedroogde deeltjes slechts 48 % was.

Voorbeeld XIII

25 20 g Gedroogde dragerdeeltjes, bereid zoals in voorbeeld IV, werden in een gefluldiseerd bed van het laborator!umtype gefluldiseerd. 45,8 g van een 11,0 gew.Z gehomogeniseerde celsuspensie (gefermenteerd zoals aangegeven in voorbeeld 1 van de Deense octrooischrift 5190/79, de suspensie bereid zoals aangegeven in voorbeeld 4 van de Deense octrooiaan-30 vrage 5190/79), die 80,1 eenheden/g thermofiel lactase van Bacillus sp. NRRL B-ll.229 bevatte, werden bij 30-40°C op de dragerdeeltjes gesproeid en de beklede deeltjes werden gedroogd. De lactaseaktiviteitseenheid wordt gedefinieerd als die hoeveelheid lactase, die 1 ymol lactase/min onder de volgende reaktieomstandigheden zal splitsen: substraatconcen-35 tratie 10 Z lactose, temperatuur = 60°C, pH = 6,5 en de reaktietijd => 30 minuten. Het enzymaktiviteitsherstel was 79,8 %. Vervolgens werden 10 g beklede bolletjes bij een pH van 7,5 behandeld in 250 ml oplossing, die 0,06 mol Na2HP04, 1,4 mol Na2S04 en 0,1 gew./vol.Z glutaaraldehyd bevatte. Na 1 uur bij kamertemperatuur werden de deeltjes ver-40 wijderd en grondig met 0,06 mol K2hpo4 bij een pH van 7,5 gewassen.

13

Het enzymaktiviteitsherstel met betrekking tot deze verknopingstrap was 17,2 Z.

Voorbeeld XIV

5 24 g Gedroogde dragerdeeltjes, bereid zoals in voorbeeld IV, werden gedrenkt in 20,2 g oplossing van een 39,6 gew.Z ten dele gezuiverd amy-loglucosidase van A. niger, bereid door ultrafiltratie van het handels-produkt AMG 200 L (beschreven in NOVO brochure AMG, B 020 g - GB 2500 juli 1982) teneinde bestanddelen met een laag molekuulgewicht te verwij-10 deren tot een gehalte droge stof van 39,6 gew.Z (aktiviteit 2610 IAG/g, waarbij de aktiviteitseenheid gedefinieerd is in NOVO Analyseforskrift AF 159/2). Vacuum werd gedurende 1 uur aangebracht. Het aldus verkregen produkt bevatte 25 gew.Z droge stof van het enzym met een enzymaktivi-teitsherstel van 77,9 Z.

15 20 g Deeltjes met 71,8 Z droge stof werden vervolgens behandeld in 1600 ml van een oplossing van 1 gew./vol.Z Na^PO^ 20 gew./vol.Z Na2S04 en 0,2 gew.Z glutaaraldehyd bij een pH van 4,5. Na 1 uur werden de deeltjes door filtratie verwijderd en met 1 Z NaH2P04 bij een pH van 4,5 gewassen.

20 Het enzymaktlviteitsherstel in verband met deze verknopingstrap was 55,1 Z.

Voorbeeld XV

40 g Dragerdeeltjes, bereid zoals aangegeven in voorbeeld IV en met 25 een gehalte droge stof van 98,8 Z en 24 g onder vacuum verdampt, ten dele gezuiverde Bacillus coagulans glucoseïsomerase (NRRL 5650) concentraat met 5 Z glucose en 8 Z natriumsulfaat toegevoegd (droge stof 41,8 Z) en door een vacuumbehandeling kreeg de vloeistof de gelegenheid de lucht in de poriën van de deeltjes te vervangen. Het gewicht na het men-30 gen was 63,22 g. Het gehalte droge stof was 79,2 Z.

Porties van 18 g van dit preparaat (ongeveer 14 g droge stof) werden gedurende 1 uur bij kamertemperatuur behandeld met 375 ml van een op een pH van 7,5 ingestelde oplossing, die in alle gevallen 22 Z natriumsulfaat, 5 Z glucose en 1 Z natriumfosfaat en voorts hetzij 0,1, hetzij 35 0,2, hetzij 0,3 Z glutaaraldehyd bevatten.

Na deze behandeling werden de preparaten vijfmaal met ongeveer 150 ml 1-procents natriumfosfaat, pH 7,5 gewassen.

De enzymaktiviteit werd bepaald volgens AF 189/1 na afvoering van de vloeistof uit de deeltjes. Ook werd het percentage droge stof bij de-40 ze deeltjes bepaald.

Λ f *« i' 14 % droge eenheid/g eenheid/g opbrengst opbrengst _stof_nat_droog_%_%_ enzymconcentraat 41,8 1415 3385 enzymconcentraat + 5 drager 79,2 463 585 86 geïmmobiliseerd met 0,1 % GA 32,5 158 486 72 83 geïmmobiliseerd met 0,2 % GA 38,9 141 362 53 62 10 geïmmobiliseerd met 0,3 % GA - 117 333 49 57

Porties equivalent aan 5 g droge stof werden op drukval onderzocht.

15 glutaaraldehydeconcentraat drukval bij het immobiliseren_25 uren_50 uren_ 0,1 % 3 5 0,2 % 1 3 20 0,3 % 2 3 i

Voorbeeld XVI

Dezelfde menger als in voorbeeld IV, d.w.z. Lödige FM 130 D, werd gevuld met 3 kg cellulosevezels en 13,5 kg Clarcel Celite en besproeid 25 met 15 kg gew./vol.% polyethyleenimine PEI 15 T, Taihei Sangyo Kaisha Ltd., bij omgevingstemperatuur, daarna met 3,0 kg water en tenslotte met 2 kg 50 gew./vol.% glutaaraldehyde. De behandelingstijd en rotatiesnel-heden van de menger en de hakker werden zodanig gekozen dat deeltjes van de voorkeursgrootte werden voorgebracht. De deeltjes werden in een ge-30 fluldiseerd bed gedroogd.

Voorbeeld XVII

Dezelfde menger als in voorbeeld IV, d.w.z. Lödige FM 130 D, werd gevuld met 3 kg cellulosevezels en 12,0 kg geaktiveerde kool Picactif 35 FGV (van de firma Pica S.A., Levallois, Cedex, Frankrijk) en besproeid met 20,0 kg 10 gew.% gelatine Bloom 200 oplossing en tenslotte met 4,5 kg water. De behandelingstijd en rotatiesnelheden van de menger en de hakker werden zodanig gekozen, dat deeltjes van de voorkeursgrootte werden voorgebracht. De deeltjes werden in een gefluldiseerd bed gedroogd. 40 De bruikbaarheid van een geïmmobiliseerd enzymprodukt, bereid vol- ^ - .· ; ’ { t - ; ; 15 ’ ' % gens de uitvinding, blijkt uit het volgende toepassingsexperiment. Een geïmmobiliseerd glucoseïsomeraseprodukt werd in het algemeen bereid zo-als in voorbeeld XII. Het produkt bevatte 32,6 gew.Z ten dele gezuiverde glucoseïsomerase en de verknoping werd zoals in voorbeeld XII uitge-5 voerd.

Na het wassen met 1 gew./vol.% natriumfosfaat (pH = 7,0) werden 27,6 g vochtige deeltjes, overeenkomend met 10 g droge stof van het deeltje, in een van een watermantel voorziene kolom met een diameter van 1,5 cm gebracht. De kolom werd op 65°C gehouden en een 45 gew.Z glucose-10 siroop werd bij een pH van 7,8 (ingesteld met Na2C03) continu door het enzymbed gepompt met een snelheid, die een omzetting van 40-42 % van glucose tot fructose mogelijk zal maken. De beginaktiviteit was 538 IGIC/g droge stof van het preparaat (waarbij de aktiviteit werd berekend volgens NOVO Analyseforskrift AF 147/6) en de halfwaardetijd van de ak-15 tiviteit werd bepaald op 450 uren. De pH van de afvoer bedroeg 7,4-7,5.

Ter vergelijking kan vermeld worden, dat het op grote schaal gebruikte geïmmobiliseerde glucoseïsomerase Sweetzyme ® uit de handel een aktiviteit heeft van 225-300 IGIC/g en een soortgelijke halfwaardetijd van de aktiviteit en om een afvoer pH van 7,4-7,5 met Sweetzyme bij 20 dezelfde omstandigheden zoals hierboven aangegeven te verkrijgen, d.w.z.

65eC en 45 gew.Z glucosesiroop, is een toevoer pH van 8,2 noodzakelijk.

Claims

1. Werkwijze ter bereiding van een deeltjesvormig, geïmmobiliseerd enzympreparaat, dat een drager bevat, aan het oppervlak waarvan het en-5 zym wordt verbonden, waarbij de drager gevormd wordt door combinatie van twee fasen, d.w.z. a) een continue fase van een in water oplosbaar bindmiddel, dat ten minste ten dele in een water bevattend milieu is opgelost of gedispergeerd en b) een discontinue fase van een groot aantal afzonderlijke, harde en inerte deeltjes, waarvan de afmeting voldoende 10 klein is om de vorming van de drager niet te verhinderen, en door het bindmiddel indien noodzakelijk in het milieu, waarin het enzym eventueel zal worden gebruikt, onoplosbaar te maken en waarbij de drager in kon-takt wordt gebracht met een enzym, dat aan het oppervlak van de drager is verbonden.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de combina tie van de twee componenten het mengen is van de continue fase en de discontinue fase en waarbij het mengsel vervolgens tot de deeltjesvormi-ge drager, bij voorkeur bolvormig, wordt gevormd.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de vorming 20 een bolvormingsbehandeling is, uitgevoerd in een Marumerizer volgens het Amerikaanse octrooischrift 3.277.520.

4. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de vorming een bolvormingsbehandeling is, uitgevoerd in een granuleerinrichting, zoals beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 4.106.991.

5. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat een geleer- baar middel aan de continue fase voor, tijdens of na het mengen met de discontinue fase wordt toegevoegd, waarna de aldus verkregen massa in een geleringsmilieu wordt geëxtrudeerd of gedruppeld, waarbij een ver-knopingsmiddel bij elk van deze trappen kan worden toegevoegd.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat het geleer- bare middel gelatine, alginaat, carrageenan of chitosan is.

7. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat het geleringsmilieu een oplossing, die Ba·*"1·, K*, polyfosfaat of ijzer(III)cyanide bevat, of koud water of een stroom koude lucht is.

8. Werkwijze volgens conclusies 1-7, met het kenmerk, dat de conti nue fase een proteïne, deeltjesvormige gelatine, sojaprotelne, caseïne, eiwit, zelne, gluten of een protelnehydrolysaat, of een polysaccharide, in het bijzonder agar, alginaat of andere gommen, meel, zetmeel, chitosan of een synthetisch materiaal, zoals carboxymethylcellulose, methyl-40 cellulose, ethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulo- 17 τ ~ » r se, polyvinylalkohol, polyvinylpyrrolidon of natriumsilicaat is.

9. Werkwijze volgens conclusies 1-8, met het kenmerk, dat de discontinue fase diatomeeënaarde, fijngestampt zand, steenstof, klei, ny-lonpoeder, onoplosbare metaaloxiden of onoplosbare metaalzouten, gemalen 5 siliciumdioxide, aerosil, gemalen aluminiumoxiden, corund, gemalen glas, gemalen keisteen, gemalen kwarts, gemalen graniet, aluminiumfosfaat, ka-olien, bentoniet, perliet, zeolieten, calciumsilicaat, microcelfilter-hulpmiddel, fijngestampt magnesiumsilicaat, talk, asbest, afgesleten hoornblende, titaandioxide, tin(lV)oxide, polijstpoeder, gemalen zirko- 10 niumsilicaat, roet, aktieve kool, beendermeel, vliegas of fijne metaal-bestanddelen is.

10. Werkwijze volgens conclusies 1-9, met het kenmerk, dat de hoeveelheid van de discontinue fase tussen ongeveer 10 en ongeveer 98 gew.Z is, in verhouding tot het totale gewicht van de drager, bij voorkeur 15 tussen 50 en 95 gew.Z, in verhouding tot het totale gewicht van de drager.

11. Werkwijze volgens conclusies 1-10, met het kenmerk, dat de lineaire afmeting van een enkelvoudig inert deeltje in de discontinue fase, berekend als de diameter van de bol met hetzelfde volume als het en- 20 kele inerte deeltje, kleiner is dan 1/5 van de diameter van het drager-deeltje, bij voorkeur kleiner dan 1/20 van de diameter van het drager-deeltje.

12. Werkwijze volgens conclusies 1-11, met het kenmerk, dat de continue fase onoplosbaar wordt gemaakt door verknoopt te worden door mid- 25 del van een geschikt verknopingsmiddel, bij voorkeur glutaaraldehyd.

13. Werkwijze volgens conclusies 1-12, met het kenmerk, dat de vorm van de drager bolvormig of rond is, en waarbij de gemiddelde dragerdia-meter tussen 0,1 en 5 mm, bij voorkeur tussen 0,2 en 2 mm, meer bij voorkeur tussen 0,2 en 1 mm ligt.

14. Werkwijze volgens conclusies 1-13, met het kenmerk, dat de dra ger behandeld wordt met een oplossing van het enzym en met een verknopingsmiddel.

15. Werkwijze volgens conclusie 14, met het kenmerk, dat de drager in een toren als een gefluïdiseerde massa wordt ingevoerd en waarbij de 35 oplossing van het oplosbare enzym in de toren als een nevel wordt ingevoerd, waarna de aldus voortgebrachte massa uit de toren wordt verwijderd en met het verknopingsmiddel wordt behandeld.

16. Werkwijze volgens conclusies 14, met het kenmerk, dat de drager als een gefluïdiseerde massa in een toren wordt ingevoerd en een mengsel 40 van de oplossing van het oplosbare enzym en het verknopingsmiddel in de v * j * 18 toren als een nevel wordt ingevoerd, waarna de aldus voortgebrachte mas-sa uit de toren wordt verwijderd.

17. Werkwijze volgens conclusies 1-16, met het kenmerk, dat het enzym een glucoselsomerase is, bij voorkeur afkomstig van Bacillus coagu-5 lans. *******