JPH02273183A - 生体触媒固定化多孔質ゲル化物の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生体触媒、いわゆる酵素、オルガネラ、細胞
を固定化した、反応面積の大きい、生体触媒固定化多孔
質ゲル化物、及びその製造方法に関する。

〔発明の背景〕

従来、酵素は反応に際し、水溶液の形で使われてきたた
め、反復使用は困難であった。近年、酵素や微生物菌体
を固定化して、通常の固形触媒に近い形で取扱いできる
様になりつつある。

各種の固定化方法のうち、親水性の高分子マトリックス
中に酵素を封じ込めるゲル包括法は、比較的操作が簡単
でかつ温和な条件下で行えるため適用範囲が広い利点が
ある。具体的には、酵素や菌体をカラギーナン、寒天、
アクリルアミド及びウレタン等のゲル基材液に溶解若し
くは分散させた後、ゲル化して調製される。使用形態が
粒状の場合、これらのゲル粒子の粒径は実用性の観点か
ら直径０．５〜５ｍｍに調製される。

反応に際しては基質分子がゲル粒子の表面からマトリッ
クス内部へと拡散する。しかし、実用的な反応条件下で
はゲル表層のみが反応に関与し、内部は反応に寄与しな
い。すなわち、ゲル包括法は反応面積を大きく取れない
難点を有する。もちろん、粒径を小さくするほど反応面
積は増加するが、固定床、流動床でのゲル粒子の保持が
困難となる。またゲル粒子はそのままでは機械的強度が
低く、固定床として使用する際、圧密化されるため、圧
損失が大きいし、流動床で使用する際には、かくはんに
より粒子の破壊が起りやすい。更に気体を生成する反応
に際して、ゲル内部に発生した気泡によりゲル粒子が破
壊されやすい。これらのゲル粒子に限らず、ゲル膜等す
べての形態のゲル化物に共通な欠点である。

〔発明の目的〕

本発明の目的は、上記したゲル包括法の欠点を改善し、
反応面積が大きく、かつ機械的強度が大きく、更に気体
生成反応に際しゲル化物内部から円滑に気泡を放出可能
な新規な生体触媒固定化ゲル化物、及びその製造方法を
提供することにある。

〔発明の概要〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は生体触媒固
定化多孔質ゲル化物に関する発明であり、生体触媒を固
定化したゲル化物において、該ゲル化物内に微細な連続
泡を包含していることを特徴とする。

また本発明の第２の発明は、上記第１の発明の多孔質ゲ
ル化物を製造する方法に関する発明であり、ゲル基材溶
液に生体触媒を添加混合する第１工程、第１工程で得ら
れる混合物を処理してゲル化物を調製する第２工程、第
２工程で得られるゲル化物を冷却してゲル化物中の溶媒
を凍結する第３工程、第３工程で得られる凍結ゲル化物
中の固体化した溶媒を減圧下で昇華して除去する第４工
程、の各工程を包含することを特徴とする。

更に本発明の第３の発明は、同じく第１の発明の多孔質
ゲル化物を製造する他の方法に関する発明であって、ゲ
ル基材液に生体触媒と繊維状物質を添加混合する第１工
程、第１工程で得られる混合物を処理してゲル化物を調
製する第２工程、第２工程で得られるゲル化物を繊維状
物のみを分解する酵素と接触させ、該ゲル化物中の繊維
状物を分解して除去する第３工程、の各工程を包含する
ことを特徴とする。

本発明者等は、ゲル粒子を貫通する細孔を設け、ゲル粒
子の有効面積の増加を図るべく、ゲル粒子の製造方法に
つき鋭意検討を重ねた。その結果、ゲル粒子の触媒活性
を損うことなく粒子に多数の細孔を設けることに関する
本発明を完成した。

本発明による製造方法は、大別して凍結法と、分解除去
法の２つとなる。

本発明に適用できる目的の生体触媒としては、従来の包
括法で固定化できる公知のものに広く適用できる。すな
わち、酵素、オルガネラ、細胞等が対象となる。

ゲル基材としては、包括法で用いられた公知の材料が使
用できる。例えば、加熱によりゾル化し、冷却によりゲ
ル化する材料の代表例として、カラギーナン、アルギン
酸及び寒天等があげられる。耐アルカリ性の酵素の場合
にはマンナン、３０℃以下の比較的低温で使用する場合
にはゼラチンも使用できる。このほか、可視光、紫外線
、放射線及びラジカル開始剤で硬化させるタイプのアク
リルアミド、メタクリル酸メチル、及びデキストリンや
ゼラチンのように架橋剤で架橋して三次元マ）　Ｕック
ス形成によりゲル化するものも十分用いることができる
。また、水で膨張するゲル以外に有機溶媒系で膨潤する
ポリウレタン、ポリスチレン等も使用できる。

これらの材料は、Ｉｇ／ｃｍ’以上のゲル破壊強度が得
られるように材料の濃度を調整する。第１工程では、生
体触媒の安定剤、例えば、牛血清アルブミンのような酵
素安定剤を添加してもよい。

以下、本発明の製造方法について、各方法ごとに、更に
具体的に説明する。

まず、第２の発明の凍結法において、凍結は、使用する
溶媒の融点よりも一３℃以下で３０分以下で行うのがよ
い。

溶媒の融点〜融点よりも−２℃低い温度範囲で１時間以
上を要して凍結すると、ゲルが収縮し、ゲル化物外部に
固化した溶媒が生成しゲル化物が破壊されやすい。凍結
したゲル化物は１０ｍｍＨｇ以下の減圧下で乾燥するこ
とができる。

本発明の凍結法による多孔質ゲル化物の製造においては
、上記した第４工程で得られる乾燥ゲル化物に、水又は
ｐＨ緩衝液等の溶媒を吸収させる第５工程を包含させて
もよい。また、既述の該第４工程で得られる乾燥ゲル化
物を機械的に圧密化する第５工程、第５工程で得られる
圧密化した乾燥ゲル化物に水又はｐＨ緩衝液等の溶媒を
添加して膨潤させる第６工程の各工程をも包含させても
よい。

更に、前記した各方法において、該第２工程に＄ける処
理が、粒子化、線状化又は膜状化処理を包含するもので
あってもよい。しかして該粒子化、線状化又は膜状化処
理を行う場合、その方法に２通りあり、（Ａ）　Ｕ！ｃ
第２工程における処理が、第１工程で得られる混合物を
ゲル化してから粒子化、線状化又は膜状化する方法と、
（Ｂ）該第２工程における処理が、第１工程で得られる
混合物を粒子化、線状化又は膜状化してから各粒子体、
線状体又は膜状体ごとにゲル化する方法とがある。

前記した圧密化は、乾燥ゲルを１ｋｇ／ｃｍ’以上の圧
力で行うことが最適である。上記の圧力の範囲外で行う
と、圧密化後、溶媒を吸収させると元の体積の５０〜９
５％に復元する。好ましくは、１．５　ｋｇ／ｃｍ２以
上で圧密化すれば膨潤しても元の体積の３０％以下に保
つことができる。

また、圧密化の際、好ましくはゲル化物の溶媒含有率を
２０％以下で行うことが好ましい。溶媒含有率が４０％
を越えると、圧密化後、溶媒で膨潤させると元の体積の
９０％以上に復元するためである。

前記した本発明の凍結法によれば、１〜１００μｍの孔
径の連続胞を形成させることができた。

その結果、未処理のゲル化物単位体積当りの酵素活性を
１．２〜数倍に向上させることができた。

更に乾燥ゲル化物を圧搾して圧密片化してから、水中で
膨潤させても元の体積の１７３以下にしか戻らないこと
も判明した。それだけでなく、ゲル化物単位乾物重量当
りの活性は、変化しないか、又は若干低下するだけであ
ることも見出した。すなわち、元の未処理のゲル化物に
対して、単位体積当りの酵素活性を、大幅に向上させる
ことに成功した。また、ゲル化物の機械的強度も著しく
向上すると共に、気体発生反応に対してもゲル化物内部
に発生した気泡を、外部に円滑に放出できることも見出
した。

次に、本発明の第３の発明である分解除去法について具
体的に説明する。

繊維状物質としては、セルロース、デンプン、ＤＮＡ５
ＲＮＡ等が用いられる。

セルロースとしては、綿花、ろ紙等の天然繊維若しくは
セロファン、スフ等の天然繊維を加工したものが用いら
れる。これらの繊維を新たに調製する場合には、繊維の
直径を調節できる点で紡糸が極めて適している。繊維の
直径はゲル化物直径の０．５〜１０％、長さは直径の５
０〜１５０％の範囲で使用できる。また、添加量はゲル
１ｍＡ’当り１０〜５００ｍｇの範囲で用いる。

繊維の直径、長さ並びに添加量共、上記範囲の下限未満
であると、ゲル化物内に円滑な液の導通が困難となり、
触媒活性は向上しない。他方、上記範囲の上限超とする
と、多孔質化後のゲルとしての実用的な機械的強度を保
持できな（なる。

次に得られる混合物を処理してゲル化物を得、次いで、
ゲル化物を高分子繊維の加水分解酵素と接触させ、繊維
を表面に露出した部分からゲル化物内部に向は分解する
。加水分解酵素との接触は加水分解酵素液中に浸漬する
か、あるいは、ゲル化物に酵素を塗布する等の手段を用
いる。加水分解酵素は、繊維に対し基質特異性が高いだ
けでなく、不純物としてのプロテアーゼを実用濃度以上
に含まない純度のものを用いる必要がある。セルロース
に対してはセルラーゼ、デンプンについてはα−アミラ
ーゼ、ＤＮＡについては口Ｎａ５ｅ、　ＲＮ　Ａについ
てはＲＮａｓｅを用いる。加水分解酵素処理の条件は目
的酵素の安定性、加水分解酵素の反応特性によって異な
る。

すなわち、目的酵素の活性を損わず、かつ各使用加水分
解酵素の加水分解作用にできるだけ適した条件で行う。

加水分解処理が終了後、必要に応じ水、若しくは酵素活
性に安定な緩衝液で洗浄する。

上記した分解除去法においても、既述の本発明の凍結法
の場合におけるように、該第２工程の処理が粒子化処理
を包含してもよく、その際、既述の（＾）又は（Ｂ）の
いずれの方法を採用してもよい。

上記した分解除去法においても、ゲル化物内に多数の貫
通孔を生じ、かつゲル化物の単位体積当りの酵素活性が
上昇した。

〔発明の実施例〕

以下、本発明を実施例及び比較例により更に具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例に限定されない。

なお、添付の第１図〜第３図は、反応時間と酵素活性と
の関係を示すグラフである。

比較例１ カラギーナン０．１５ｇ、水４．８５　ｇをオートクレ
ーブ中１２０℃、１５分加熱してカラギーナン溶液５ｇ
を得た。上記のカラギーナン溶液を４０℃に冷却した。

このカラギーナン溶液に、ウレアーゼ１０ｍｇ（ナタマ
メ起源）と牛血清アルブミン２０ｍｇ（酵素用安定剤と
して使用）を水３−に溶解した水溶液を添加して混合し
た。

混合液を直ちに平板上に流し、厚さ１．７Ｘ２．４ＩＩ
１ｍの板状のゲルとし、２Ｘ２ｍｍ角に細断した。

得られたゲル粒子の内部は、顕微鏡写真によって観察し
たところ、均質な透明ゲルからなっていた。ついで、こ
のゲル粒子を０．５ｇ分取し、１０％尿素５ｒｄ、１Ｍ
クエン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，７）　２０　ｒｎｉ
ｌ及び水５ｒｄを添加して、４０℃、３０分往復振とう
した（振幅３ｃｍ、３０ストロ一ク／分）。尿素の分解
により生ずるアンモニア態Ｎ生成量の時間経過を測定し
た。その結果を第１図に示す。すなわち第１図は、反応
時間（分）　（横軸）と酵素活性（９ｇ　　Ｎ−ＮＨｓ
／ｇ無処理ゲル）（縦軸）との関係を示すグラフであり
、後記実施例のものも一緒に示す。

他方、ゲル粒子０．１ｇを分取し、水５ｒｎｌを加えて
４０℃で１時間振とう後、遠心分離（４５００ｇ１１０
分）して、パックドボリューム（ｐａｃｋｅｄ　ｖｏｌ
ｕｍｅ）を測定した。その結果を第１表に示す。

実施例１ 比較例１で調製した同一バッチのゲル粒子２ｇをナスフ
ラスコに入れ、−５０℃で２分以内に凍結した。この凍
結したゲル粒子を１　ｍｍ）１ｇ以下の減圧下で乾燥し
て、乾燥ゲル４６ｍｇを得た。

この乾燥ゲルに水を吸収させて顕微鏡下に見ると、多数
の連続胞の形成が観察された。

次いで、この乾燥ゲル粒子から乾燥前のゲル粒子換算で
０．５ｇを分取し、比較例１と同じ手順により尿素の分
解の時間経過を測定した。その結果を第１図に示す。他
方、乾燥ゲル粒子から乾燥前のゲル換算で０．１　ｇを
分取し、比較例１と同じ手順によりパックドボリューム
を測定した。その結果を第１表に示す。

実施例２ 実施例１で調製したものと同一バッチの乾燥ゲル粒子３
０ｍｇ（乾燥前ゲル換算１．３ｇ）を１０　ｋｇ／ｃｍ
”の圧力で圧密化し、薄片状とした。

この薄片状の乾燥ゲル１０ｍｇを水に入れ、実施例１と
同様にしてパックドボリュームを測定した。その結果を
第１表に示す。また、水によって膨潤した後のゲルを顕
微鏡下に観察した。実施例１の連続胞が圧密化していた
。

比較例１、実施例１及び２につき、ゲル粒子乾物１ｇ当
りのウレアーゼ活性及びパックドボリューム１−当りの
ウレアーゼ活性を整理し、第１表に合せ示す。乾物重量
当りのウレアーゼ活性は、無処理ゲル粒子（比較例１）
に比べ、凍結乾燥処理ゲル粒子（実施例１）が１．５倍
、凍結乾燥−圧密化処理ゲル粒子（実施例２）は１．３
倍に向上した。他方、実施例２の乾物１ｇ当りのパック
ドボリュームは比較例１０４分の１に減少できる。した
がって、実施例２０パックドボリューム１−当りの活性
は比較例１の５．２倍に向上し、固定床のコンパクト化
に大きく寄与する。

第　　１ 表 ＊　１０分間で生成したＮ−ＮＨ，量から算出した初速
度を使用実施例３ 精製寒天０．１５ｇ１水４．８５ｇを９０℃、１５分加
熱して寒天溶液５ｇを得た。上記の寒天液を４０℃に冷
却した。この寒天溶液にウレアーゼ３０ｒｎｇ（ナタマ
メ起源、比活性４Ｕ／ｍｇ、ＩＵ：１μモル　Ｎ−Ｎ１
１ａ　／分）と牛血清アルブミン３０ｍｇ（酵素用安定
剤として使用）を水１．０ｇに溶解した水溶液１．６３
ｇ、及び脱脂綿を長さ２〜３ｍｍに細断した繊維（繊維
径３０〜６０μｍ）を０．６ｇ添加して混合した。混合
液を直ちに平板上に流し、厚さ１．７〜２．３　ｍｍの
板状に固化成型した。次いで、１００ｍｇのセルラーゼ
（トリコデルマ起源、１００ＦＰＡ−Ｕ／ｍｇ）を７−
の０．０５Ｍ酢酸ソーダ緩衝液（ｐＨ４，５）に溶解し
た溶液に、上記繊維入りウレアーゼ固定寒天ゲル粒子１
．５　ｇを添加し、４０℃で２時間処理した。セルラー
ゼ処理後の繊維入りウレアーゼ固定寒天ゲル粒子を顕微
鏡下に観察すると、セルラーゼ処理により、処理以前に
認められたセルロース繊維が消失し、消失部分に貫通孔
が生じていることが観察された。セルラーゼ処理後のゲ
ル粒子を分離回収し、１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６，７
）　２０ｒｎ１及び１０％尿素溶液１０−を添加して４
０℃で２時間往復振とうしたく振幅３ｃｍ、３０ストロ
一ク／分）。尿素の分解により生ずるアンモニア態Ｎ生
成量の時間経過を第２図に示す。

すなわち第２図は、反応時間（分）（横軸）と酵素活性
（８ｇ　　Ｎ−ＮＨｓ／ｍｊり　　（縦軸）との関係を
示すグラフであり、後記比較例の結果も併記した。

比較例２ 実施例３で調製した同一バッチの繊維入りウレアーゼ固
定ゲル粒子１．５ｇを、セルラーゼを添加しない０．０
５Ｍ酢酸ソーダ緩衝液（ｐＨ４，７）に添加し、同じ要
領で４０℃、２時間保温した。

上記処理後、実施例３と同一要領で尿素の分解試験を行
った。アンモニア態Ｎ生成の時間経過を第２図に示す。

比較例３ 実施例３にて調製した同一バッチの繊維入りウレアーゼ
固定ゲル粒子１．５ｇを５℃で２時間保存後、実施例３
と同一要領で尿素の分解試験を行った。アンモニア態Ｎ
生成の時間経過を第２図に併記する。

比較例４ ウレアーゼ固定ゲル粒子の調製に際して、綿繊維の代り
に０．６ｇの水を添加して、実施例３と同一要領でウレ
アーゼ固定ゲル粒子を調製した。このゲル粒子１．５ｇ
を実施例３と同一要領で尿素の分解試験を行った。アン
モニア態Ｎ生成の時間経過を第２図に併記する。

実施例３及び比較例２〜４の結果をゲル粒子１ｇ当りの
ウレアーゼ活性で整理し第２表に示す。比較例に比べ実
施例３は約１．４倍の活性を示し、本発明により従来の
単純な包括法に比べ４０％の活性上昇を認めた。

第　　２　　表 ＊　１０分間で生成したＮ−Ｎ８重量から算出した初速
度を使用 比較例５ アルギン酸０．４ｇ、水４．６ｇを１０５℃、１０分加
熱してアルギン酸溶液５ｇを得た。上記のアルギン酸溶
液にラクターゼ（サツカロミセス属酵母起源）１０ｍｇ
を水２Ｗ１１に溶解して水溶液を添加して混合した。混
合液を２％塩化カルシウム溶液中に滴下して固化し、直
径１．５〜４ｍｍの球状粒子を得た。次いで、このゲル
粒子を水洗し、０．５ｇを分取して、０．１Ｍリン酸カ
リウム緩衝液ｐＨ６，５を１−加え、これに基質として
オルト・ニトロフェノール−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ド（ＯＮＧＰ）の０．５％水溶液３ｍｊ！を添加した。

上記混合液を３０℃で１０分間反応させた後、氷冷し、
酵素固定化粒子をろ別した。次いで、ろ液中の生成オル
トフェノール量を４２０ｎｍで比色定量した。１０分間
で生成したオルトフェ・ノール量より算出した初速度か
らラクターゼ活性を算出した。他方、ゲル粒子０．１ｇ
を分取し、水５−を加えて３０℃で１０分間振とう後、
遠心分離（４５００ｇ、１０分）して、パックドボリュ
ームを測定した。パックドポリニーム及びパックドポリ
ニーム当りのラクターゼ活性及び乾量当りのラクターゼ
活性を第３表に示した。

実施例４ 比較例５で調製した同一バッチのゲル粒子２ｇをナスフ
ラスコに入れ、液体窒素中で１分以内に凍結した。この
凍結したゲル粒子をｌ　ｍｍ）１ｇ以下の減圧下で乾燥
して、乾燥ゲル４０ｍｇを得た。この乾燥ゲルに水を吸
収させて顕微鏡下に見ると、多数の連続胞の形成が観察
された。次いで、この乾燥ゲル粒子から乾燥前ゲル粒子
換算で０．５　ｇを分取し、比較例５と同じ手順によリ
オルト・ニトロフェノール−β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ドの分解の初速度を測定した。他方、乾燥ゲル粒子から
乾燥前のゲル換算で０．１　ｇを分取し、比較例１と同
じ手順によりパックドボリュームを測定した。その結果
と、パックドポリニーム当りのラクターゼ活性及び乾量
当りのラクターゼ活性を第３表に示した。

実施例５ 実施例４で調製したものと同一バッチの乾燥ゲル粒子２
０ｍｇ（乾燥前ゲル換算１．３ｇ）を８ｋｇ／ｃｍ”の
圧力でプレスして圧密化し、２ｘ２ｆｆＩｍの薄片状と
した。この薄片状の乾燥ゲル１０ｏ＋ｇを水に入れ、実
施例４と同様にしてパックドボリュームを測定した。そ
の結果を第３表に示す。

第　　３ 表 実施例６ カラギーナン０．２ｇ、水４．８ｇをオートクレーブ中
１１０℃、５分間加熱してカラギーナン溶液５ｇを得た
。上記のカラギーナン溶液を４０℃に冷却した。このカ
ラギーナン溶液に、ウレアーゼ２５ｍｇ（ナタマメ起源
、比活性４Ｕ／ｒｎｇ、ＩＵ：１．ＵモルＮ　−ＮＨ，
／分）と牛血清アルブミン３０ｍｇ（酵素用安定剤とし
て使用）を水１ｇに溶解した水溶液１．０６ｇ、及び脱
脂綿を長さ２〜３ｏ＋ｍに細断した繊維（繊維径３０〜
６０μｍ）を０．６　ｇ添加して混合した。混合液を直
ちに平板上に流し、厚さ１．７　Ｘ　２．３　ｏｈｍの
板状の固化成型し、１．５〜２．５　Ｘ　１．５〜２．
５　ｍｍ×１．０〜１．５　ｍｍの大きさに細断しセル
ロース繊維入りのウレアーゼ固定化カラギーナンゲル粒
子を調製した。次いで、１００ｍｇのセルラーゼ（トリ
コデルマ起源、１００　ＦＰＡ−Ｕ／ｍｇ）を７−の０
．０５Ｍ酢酸ソーダ緩衝液（ｐＨ４，５）に溶解した溶
液に、上記の繊維入りウレアーゼ固定カラギーナンゲル
粒子１．５ｇを添加し、４０℃で２時間処理した。セル
ラーゼ処理により、処理以前に認められたセルロース繊
維が消失し、消失部分に貫通孔が生じていることが観察
された。セルラーゼ処理後のゲル粒子を分離回収し、１
Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６，７）　２０　ｍｌ及び１０
％尿素溶液１０ｒｎＩ！を添加して、４０℃で２時間往
復振とうした（振幅３ｃＩＯ１３０ストロ一クス／分）
。尿素の分解により生ずるアンモニア態Ｎ生成量の時間
経過を第３図に示す。すなわち第３図は、反応時間（分
）（横軸）と酵素活性（μｇ　　Ｎ−ＮＨｓ／ｍｌり　
　（縦軸）との関係をボスクラフであり、後記比較例の
結果も併記した。

比較例６ 実施例６で調製した同一バッチの繊維入りウレアーゼ固
定カラギーナンゲル粒子１．５ｇを、セルラーゼを添加
しない０．０５Ｍ酢酸ソーダ緩衝液（ｐＨ４，７）に添
加し、同じ要領で４０℃、２時間保温した。上記処理後
、実施例６と同要領で尿素の分解実験を行った。アンモ
ニア態Ｎ生成の時間経過を第３図に併記する。

比較例７ 実施例３にて調製した同一バッチの繊維入りウレアーゼ
固定カラギーナンゲル粒子１．５ｇを５℃で２時間保存
後、実施例６と同一要領で尿素の分解試験を行った。ア
ンモニア態窒素生戊の時間経過を第３図に併記する。

比較例８ ウレアーゼ固定ゲル粒子の調製に際して、綿繊維の代り
に０．６ｇの水を添加して、実施例３と同一要領でウレ
アーゼ固定ゲル粒子を調製した。このゲル粒子１．５　
ｇを実施例６と同一要領で尿素の分解試験を行った。ア
ンモニア態Ｎ生成の時間経過を第３図に併記する。

実施例６及び比較例６〜８の結果をゲル粒子１ｇ当りの
ウレアーゼ活性で整理し、第４表に示す。比較例に比べ
、実施例６は約１．４倍の活性を示し、本発明により従
来の単純な包括法に比べ４０％の活性上昇を認めた。

第　　４　　表 実施例７ 下記の５成分を混合した液を１．５　ｍｍ間隙のガラス
壁間に流し、１５℃、４０分間静置してゲル化させ、厚
さ１．５　ｏｈｏＩのゲルプレートを調製した。

Ａ　：　Ｉ　Ｎ　ＩＣ１４，８ｍｊ！ トリスヒドロキシメチルアミノメタン３．７蒸留水６．
３７！ Ｂニアクリルアミド６ｇ メチレンビスアクリルアミドＱ、　１６　ｇフェリシア
ン化カリウム１．４　ｍｇ 蒸留水１４ｄ Ｃ：０．１４％過硫酸アンモニウム４０ｒｄＤ：ウレア
ーゼ０．３ｇ（ナタマメ起源、比活性４０／＋＋＋ｇ、
１０　：　１μモルＮ−ＮＨｓ／分）牛血清アルブミン
０．３ｇ（酵素安定剤として使用） 蒸留水９．４　ｍｌ Ｅ：デンプン繊維（繊維長２〜３　ｍｍ、繊維径５０〜
１５０μｍ１本繊維は馬鈴しよデンプン糊をフィルム状
に乾燥した薄膜を細断して調製）１０ｇ 上記ゲルプレートを１．５〜２．５　Ｘ　１．５〜２．
５ｍｍの大きさに細断してデンプン繊維入りのウレアー
ゼ固定化ポリアクリルアミドゲル粒子を調製した。次い
で、５０１１１ｇのα−アミラーゼ（枯草菌起源、７０
０Ｕ／ｍｇ、ＩＵ：　１．ｕモルデンプンからのマルト
ース／３分）を７−の０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液
（ｐ）１６．８）に溶解した溶液に、上記の繊維入りウ
レアーゼ固定ポリアクリルアミドゲル粒子１．５ｇを添
加し、３７℃で、１５分処理した。光学顕微鏡観察によ
りα−アミラーゼ処理により、処理以前に認められたデ
ンプン繊維が消失し、消失部分に貫通孔が生じているこ
とが観察された。α−アミラーゼ処理後のゲル粒子分を
分離回収し、１Ｍクエン酸緩衝（ｐＨ６，７）　２０　
ｒｎｌ及び１０％尿素溶液１０ｍ１を添加して、４０℃
で２時間往復振とうした（振幅３ｃｍ、３０ストロ一ク
ス／分）。尿素の分解により生ずるアンモニア態Ｎ生成
量の時間経過を測定し、初速度からα−アミラーゼ無処
理ゲルｇ当りの見掛けの比活性を算出し、４．Ｏ１Ｊ／
ｇの値を得た。

比較例９ 実施例７で調製した同一パッチの繊維入りウレアーゼ固
定ポリアクリルアミドゲル粒子１．５ｇを、α−アミラ
ーゼを添加しない０．０５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ６，８）に添加し、同じ要領で３７℃、１５分保温し
た。上記処理後、実施例７と同要領で尿素の分解実験を
行った。尿素の分解により生ずるアンモニア態Ｎ生成量
の時間経過から初速度を測定し、α−アミラーゼ無処理
ゲルｇ当りの見掛けのウレアーゼ比活性を算出し２．７
０／ｇの値を得た。

比較例１０ 実施例７で調製した同一バッチの繊維入りウレアーゼ固
定ポリアクリルアミドゲル粒子１．５ｇを５℃で２時間
保存後、実施例７と同一要領で尿素の分解試験を行った
。アンモニア態Ｎ生成量の時間経過から初速度を測定し
、α−アミラーゼ無処理ゲルｇ当りの見掛けのウレアー
ゼ比活性を算出し２．６Ｕ／ｇの値を得た。

比較例１１ ウレアーゼ固定ゲル粒子の調製に際して、デンプン繊維
の代りにＬｏｇの水を添加して、実施例７と同一要領で
ウレアーゼ固定ゲル粒子を調製した。このゲル粒子１．
５ｇを実施例７と同一要領で尿素の分解試験を行った。

アンモニア態Ｎ生成量の時間経過から初速度を測定し、
α−アミラーゼ無処理ｇ当りの見掛けのウレアーゼ比活
性を算出し、２．７Ｕ／ｇの値を得た。

実施例８ カラギーナン０．２ｇ、水４．８ｇをオートクレーブ中
１１０℃、５分加熱してカラギーナン溶液５ｇを得た。

上記のカラギーナン溶液を４０℃に冷却した。このカラ
ギーナン溶液に、インベルターゼ３０１ｇ［：カンジダ
　ウテイリス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ）起源、
比活性２００Ｕ／ｍｇ。

ＩＵニスクロース１μモル分解／分〕を水１ｇに溶解し
た水溶液１．０３　ｇ及び脱脂綿を長さ２〜３ｒｎｍに
細断した繊維（繊維径３０〜６０μｍ）を０．６ｇ添加
して混合した。混合液を直ちに平板上に流し、厚さ０．
８〜１．２　ｍｍの膜状に固化した。次いで１５０ｍｇ
のセルラーゼ（トリコデルマ起源、１００　Ｆ　Ｐ　Ａ
−Ｕ／ｍｇ）を７ｒｎ１の０．０５Ｍ酢酸ソーダ緩衝液
（ｐＨ４，５）に溶解した溶液に、上記繊維入りウレア
ーゼ固定カラギーナン溶液展１．５　ｇ　（４０Ｘ　４
０　ｍｍ）を浸漬し、４０℃で１時間処理した。セルラ
ーゼ処理により、処理以前に認められたセルロース繊維
が消失し、消失部分に貫通孔が生じていることが観察さ
れた。

セルラーゼ処理後のゲル粒子を分離回収し、０．１　Ｍ
酢酸緩衝液（ｐ）ｌ　４、？）２０ｍｌ！及び５％スク
ロース溶液１０ｍｊ！を添加して、４５℃で２時間往復
振とうした（振幅３ｃｍ、３０ストロ一クス／分）。ス
クロースの分解により生ずるグルコース生成量の時間経
過から初速度を測定し、セルラーゼ無処理ゲルｇ当りの
見掛けのウレアーゼ比活性を算出し４２０／ｇの値を得
た。

比較例１２ 実施例８で調製した同一バッチの繊維入りインベルター
ゼ固定カラギーナンゲル膜１．５ｇを、セルラーゼを添
加しない０．０５Ｍ酢酸ソーダ緩衝液（ｐＨ６，８）に
添加し、同じ要領で４０℃、１時間保温した。上記処理
後、実施例８と同じ要領でスクロースの分解実験を行っ
た。スクロースの分解により生ずるグルコース生成量の
時間経過から初速度を測定し、セルラーゼ無処理ゲルｇ
当りの見掛けのインベルターゼ比活性を算出し２８Ｕ／
Ｈの値を得た。

比較例１３ 実施例８で？Ａ製した同一バッチの繊維入りインベルタ
ーゼ固定カラギーナンゲル膜１．５ｇを、５℃で２時間
保存後、実施例８と同一要領でスクロースの分解実験を
行った。スクロースの分解により生ずるグルコース生成
量の時間経過から初速度を測定し、セルラーゼ無処理ゲ
ルｇ当りの見掛けのインベルターゼ比活性を算出し２５
Ｕ／ｇの値を得た。

比較例１４ インベルターゼ固定化カラギーナンゲル膜の調製に際し
て、セルロース繊維の代りに１０ｇの水を添加して、実
施例８と同一要領でゲル膜を調製した。このゲル膜１．
５ｇを用い、実施例８と同じ要領でスクロースの分解実
験を行った。

スクロースの分解により生ずるグルコース生成量の時間
経過から初速度を測定し、セルラーゼ無処理ゲルｇ当り
の見掛けのインベルターゼ比活性を算出し２７Ｕ／ｇの
値を得た。

実施例９ 実施例６と同要領でウレアーゼ、脱脂綿繊維を含むカラ
ギーナン液６ｇを調製し、これを５％塩化カリウム溶液
（６℃）中に滴下し２〜３ｍｍのビーズ状に成型した。

上記のゲル粒子１．５ｇを分離し実施例６と同要領でセ
ルラーゼ処理を行った。その結果、処理以前に認められ
たセルロース繊維が消失し、消失部分に貫通孔を生じて
いることを確認した。セルラーゼ処理後のゲル粒子を分
離して実施例６と同要領でセルラーゼ無処理ゲルｇ当り
の見掛けの比活性を算出し３．９Ｕ／ｇの値を得た。

比較例１５ 実施例９で調製した同一バッチのゲル粒子１．５ｇをセ
ルラーゼを添加しない０．０５Ｍ酢酸ソーダ緩衝液（ｐ
Ｈ４，７）に添加し、同じ要領でセルラーゼ無処理ゲル
ｇ当りの見掛けの比活性を算出し２，４Ｕ／ｇの値を得
た。

実施例６〜９及び各々に対応する比較例につき、ゲル粒
子１ｇ当りの比活性を比べると、実施例は比較例に比べ
１．４〜１．６倍を見掛けの比活性が向上している。

比較例１６ 下記の４を分を混合した液を、幅１．５　Ｘ　１．５Ｘ
６０ｍｍのアクリル板上の溝に流し、１５℃、４０分間
静置してゲル化させ、線状ゲル化物を調製した。

＾）　　ＩＮ　　ＨＣｌ４．８− トリスヒドロキシメチルアミノメタン　３．７−蒸留水
　６．３　ｍｌ Ｂ）　アクリルアミド　６ｇ メチレンビスアクリルアミド　０．１６　ｇフェリシア
ン化カリウム　１．４　ｍｇ蒸留水　１４− Ｃ）０．１４％過硫酸アンモニウム　４．０　ｍ１Ｏ）
マルターゼ（サツカロミセス属酵母起源０．２ｇ（２１
００Ｕ） 蒸留水　９．４− 上記線状ゲル化物２．０ｇを分取して５℃水５１中に３
時間浸漬して洗浄した。次いで０．１Ｍリン酸カリウム
緩衝液ｐＨ６，８を１０Ｗｄｌを加え、これに基質とし
てオルト・ニトロフェノール−β−Ｄ−グルコピラノシ
ドの０．５％水溶液３ｍｆを添加した。上記混合液を３
７℃で１０分間反応させた後、氷冷し、酵素固定化線状
ゲル化物を得た。このゲル化物をろ別したろ液中のオル
トフェノール生成量を４２０　ｎｍで比色定量した。

１０分間で生成したオルトフェノール量から算出した初
速度からマルターゼ活性を算出した。

他方、線状ゲル化物０．５　ｇを分取し、水５−を加え
て、遠心分離（４５００ｇ、１０分）して、パックドボ
リュームを測定した。パックドボリューム及びパックド
ボリューム当りのマルターゼ活性及び乾量当りのマルタ
ーゼ活性を第５表に示した。

実施例１０ 比較例１６で調製した同一バッチの線状ゲル化物２ｇを
５℃水５１中に３時間浸漬して洗浄した。次いでゲル化
物をナスフラスコに入れ、−５０℃で２分以内に凍結し
た。この凍結した線状ゲル粒子を１　ｍｍ）１ｇ以下の
減圧下で乾燥して、乾燥ゲル０．２７　ｇを得た。これ
を直径１　ｃｍ、深さ１　ｃｍの凹金型に入れ３ｋｇ／
ｃｍ’の圧力でプレスし、円板状のマットを得た。この
マットを２×２ｍ角に裁断した。次いで、０．１　Ｍ　
’）ン酸カリウム緩衝液ｐｔ１６．８を１０−加え、こ
れに基質トシてオルト・ニトロフェノール−β−Ｄ−グ
ルコピラノシドの０．５％水溶液３＋ｎｌを添加した。

上記混合液を３７℃で１０分間反応させた後、氷冷し、
固定化酵素粒子をろ別したろ液中のオルトフェノール生
成量を４２０ｎｍで比色定量した。１０分間で生成した
オルトフェノール量から算出した初速度からマルターゼ
活性を算出した。他方、同じ操作で調製したマットを裁
断して調製したゲル化直後の線状ゲル化物０．５ｇに相
当量を取り、水５−を加えて、遠心分離（４５００ｇ、
１０分）して、パックドボリュームを測定した。パック
ドポリニーム、パックドボリューム当りのマルターゼ活
性及び乾量当りのマルターゼ活性を第５表に示した。

第　　５ 表 比較例１７ カラギーナン０．５ｇ、水４．５ｇをオートクレーブ中
１２０℃で１５分間加熱してカラギーナン溶液５ｇを得
た。上記のカラギーナン溶液２．０ｇを４０℃に冷却し
た。これに、スクラーゼ（サツカロミセス属酵母起源）
　０．１　ｇ　（１５００Ｕ）、塩化カルシウム０．２
ｇを水３ｍｊ！に溶解した水溶液を添加し、−辺が５０
ｍ！１１の正方形の分析用ろ紙（乾量１７４　ｍｇ）を
内部に敷いた内法５０Ｘ５０ｍｍ、深さ１０ｍｍの容器
に注ぎ、室温に静置して固化した。ろ紙を封入した厚さ
２ｍｍの膜状ゲル化物を５℃の水５１中に３時間浸漬し
て洗浄した。次いでゲル化物を２５Ｘ５０ｍｍに２等分
した。上記のゲル化物の一方を１００−ビーカーに入れ
、１０％蔗糖溶液１０−１０．５Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ５，
９，５−を加え、ゆるやかに振とうさせ、４０℃で１０
分間反応させた。反応液中のグルコース生成量から、ゲ
ル化物のスクラーゼ活性を算出した。一方、ゲル化物の
体積を測定し、ゲル体積当りのスクラーゼ活性及び乾量
当りの活性を算出し第６表に示した。

実施例１１ 比較例１７で調製した未使用の２５Ｘ５０ｍｍのゲル化
物を、広口１１ナスフラスコに入れ、壁面に付着させた
状態で一４５℃で凍結した。

この凍結ゲル化物をｌ　ｍｍＨｇ以下の減圧下で乾燥し
て、乾燥膜９２ｍｇを得た。この乾燥膜を湿度８０％の
空気中に１時装置いた後、油圧プレス機（５０ｋｇ／ｃ
ｍ’）でプレスして圧密化し、紙状の膜を得た。上記の
膜を１００ｍｌビーカーに入れ、比較例１７と同要領で
スクラーゼ活性及び湿潤膜の容積を測定した。湿潤膜体
積当りのスクラーゼ活性及び乾量当りの活性を算出し、
第６表中に示した。

第６表 比較例１８ 精製寒天０．１５ｇ、水４．８５　ｇをオートクレーブ
中で１２０℃、９０分加熱して寒天溶液５ｇを得た。上
記の寒天溶液を４０℃に冷却した。

この寒天溶液にパン酵母ケーキ２００＋ｍｇ（乾物４２
ｍｇ）を水１ｒｎｌに懸濁した溶液を添加し混合し、直
ちに平板上に流して固化した。板状のゲル（厚さ１．８
〜２．６　ｍｍ）を２Ｘ　２ｍｍ角に細断した。上記ゲ
ル粒子０．５　ｇを１００ｍ１三角フラスコに分取し、
１０％グルコース溶液５ｍ１ｉ！、１Ｍ酢酸緩衝液ｐＨ
５，６，５ｍｌ！、水１０−を添加し、３０℃、１０分
間往復振とうした（振幅２．５　にｌＴ１％３０ストロ
ーク／分）、反応後５℃で冷却して菌体を遠心分離し、
ろ液中のエタノール濃度をガスクロマトグラフにより測
定した。一方、ゲル粒子０゜５ｇを水中に添加してゲル
粒子の体積を求め、湿ゲル粒子体稜当りのアルコール生
成速度、乾量当りのアルコール生成速度を算出し、第７
表に示した。

実施例１２ 比較例１８で調製した同一バッチのゲル粒子０．５ｇを
分取し、５００−ナスフラスコ中に入れ、−４５℃で１
分以内に凍結した。この凍結物をｌ　ｍｍ）１ｇ以下の
減圧下で乾燥して、乾燥ゲル粒子を得た。これを、個々
の粒子毎にプレス機で（５ｋｇ／ｃｍ’）でプレスして
圧密化し、薄片状物を得た。この薄片状物を用い比較例
１８と同要領でエタノール生成速度及び水に浸漬したと
きの体積を測定した。その結果を第７表に示した。

第　　７　　表 応槽の有効容積を減少することにより、効率よく反応さ
せることが可能となるという顕著な効果が奏せられる。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第３図は、各側における尿素分解によるアンモ
ニア態窒素生成の時間経過を、反応時間と酵素活性との
関係で示したグラフである。 特許出願人　　株式会社　日立製作所

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ゲル基材溶液に生体触媒を添加混合する第１工程、
   第１工程で得られる混合物を処理してゲル化物を調製す
   る第２工程、第２工程で得られるゲル化物を冷却してゲ
   ル化物中の溶媒を凍結する第３工程、第３工程で得られ
   る凍結ゲル化物中の固体化した溶媒を減圧下で昇華して
   除去する第４工程、該第４工程で得られる乾燥ゲル化物
   を機械的に圧密化する第５工程、の各工程を包含するこ
   とを特徴とする生体触媒固定化多孔質ゲル化物の製造方
   法。 ２、ゲル基材溶液に生体触媒を添加混合する第１工程、
   第１工程で得られる混合物を処理してゲル化物を調製す
   る第２工程、第２工程で得られるゲル化物を冷却してゲ
   ル化物中の溶媒を凍結する第３工程、第３工程で得られ
   る凍結ゲル化物中の固体化した溶媒を減圧下で昇華して
   除去する第４工程、該第４工程で得られる乾燥ゲル化物
   を機械的に圧密化する第５工程、第５工程で得られる圧
   密化した乾燥ゲル化物に溶媒を添加して膨潤させる第６
   工程、の各工程を包含することを特徴とする生体触媒固
   定化多孔質ゲル化物の製造方法。 ３、該第２工程における処理が、第１工程で得られる混
   合物をゲル化してから粒子化するものである特許請求の
   範囲第１項又は第２項記載の生体触媒固定化多孔質ゲル
   化物の製造方法。 ４、該第２工程における処理が、第１工程で得られる混
   合物を粒子化してから各粒子体ごとにゲル化するもので
   ある特許請求の範囲第１項又は第２項記載の生体触媒固
   定化多孔質ゲル化物の製造方法。 ５、該第２工程における処理が、第１工程で得られる混
   合物をゲル化してから線状化するものである特許請求の
   範囲第１項又は第２項に記載の生体触媒固定化多孔質ゲ
   ル化物の製造方法。 ６、該第２工程における処理が、第１工程で得られる混
   合物を線状化してから各線状体ごとにゲル化するもので
   ある特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の生体触媒
   固定化多孔質ゲル化物の製造方法。