NL8020306A - Katalysatoren voor biochemische omzettingen, en werkwijze voor het bereiden van zulke katalysatoren. - Google Patents

Description

ι i -1 - 80 2 03 0 6

Katalysatoren voor biochemische omzettingen, en werkwijze voor het bereiden van zulke katalysatoren.

Deze uitvinding betreft een katalysator voor biochemische omzettingen van het soort dat in twee of meer j stappen verloopt van een substraat of mengsel van substraten tot s ! het gewenste eindprodukt via één of meer tussenprodukten, waarbij | 5 sommige stappen de aanwezigheid van een of meer enzymen vergen ; en andere stappen de aanwezigheid van een of meer microörganis- | men vergen. !

De uitvinding betreft ook een werkwijze voor de bereiding van zo'n katalysator.

10 Een zeer groot aantal verschillende bioche- j mische omzettingen is bekend die in principe in de vorm verlopen j van een keten van een aantal opeenvolgende reacties, waarbij voor! sommige stappen de aanwezigheid van enzymen en in andere stappen de aanwezigheid van microörganismen nodig is. Deze bioche- j 15 mische omzettingen zijn dus in principe van het soort j | i i

I ' E M

| Substraat -—> Produkt 1 -—> Produkt 2, of

Μ E

Substraat -—> Produkt 1 --—> Produkt 2, 20 waarin E een of meer enzymen voorstelt en M een of meer micro-organismen voorstelt. Men zal begrijpen dat de reactieketen vaak meer dan twee stappen zal omvatten.

Voorbeelden van omzettingen van het eerste 25 soort zijn

Ie e i I Cellulose-> oligosacchariden-> cellobiose | M i 3-glucosidase 8lucose Bakkërsgïst^ ethan°l>

; E . E

cellulose--—oligosacchariden--—^ cellobiose ; ι 30 -—^—r-—> glucose -————r -> butanol; p-glucosidase bacteriën 8020306 - 2 - I zetmeel --- glucose ^ . ^-:—--- ethanol; j ! amulase ° Bakkersgist ’ j

lactose (wei) -=—. E. ,—>· { galactose ^I

β-galactosidase glucose

M

5 Bakkersgist > ethanol; xylose —r——-r—^ -> xylulose ., --——ethanol.

xylose isomerase J Bakkersgist

Een voorbeeld van een omzetting van het andere type is

M . . . E

10 substraat - -—> benzylpenicillme -=->>

Penicillium sp J acylase -^ 6-aminopenicillaanzuur (6-ΔΡΑ).

j Dit zijn slechts enkele voorbeelden uit 15 een groot aantal in de techniek bekende biochemische omzettingen.

Een kenmerk van deze biochemische reacties is dat de reactiesnelheid door de aanwezigheid van het gevormde produkt beïnvloed wordt, zodanig dat de reactie steeds langzamer j gaat lopen en tenslotte helemaal tot stilstand komt als het j 20 gehalte aan gevormd produkt toeneemt. Als de verschillende j reactiestappen van de bereiding in porties uitgevoerd worden zal de reactie dus automatisch bij een betrekkelijk lage opbrengst stoppen, waarna het nodig is het gevormde produkt van het substraat en de gebruikte katalysator te scheiden, dus van het ge-25 bruikte enzym of microörganisme, zodat de katalysator, die vaak kostbaar is, opnieuw gebruikt kan worden. Ook mag de katalysator | niet in het afgescheiden eindprodukt aanwezig zijn, daar die j j # · . · ' | aanwezigheid vaak ongewenst is. Deze scheidingen zijn echter vaak! I ingewikkeld en kostbaar om uit te voeren. Het is dan ook wense- j 30 lijk dat de verschillende stappen van zo'n proces op een continue! ; wijze uitgevoerd kunnen worden waarbij de reactieprodukten con- j | tinu uit de reactieruimte afgevoerd worden, opdat de reactie zon-| der hinder kan verlopen en men aldus een hoge opbrengst krijgt. Bij zo'n continue werkwijze moet de gebruikte katalysator, dat ; 35 is het enzym of het microörganisme, op een of andere wijze vast- j 8020306 ι - 3 - gelegd zijn, zodat genoemde katalysator de continue stroom van j reactieprodukten uit de reactieruimte niet begeleidt, maar in ge- j noemde ruimte blijft. Verder zou het erg voordelig zijn, zowel | economisch als praktisch, twee of meer stappen van de biochemische; 5 omzetting van het bedoelde soort in ëên en hetzelfde reactievat uit te voeren, bijvoorbeeld in ëën en dezelfde kolom. Maar daarvoor is echter de gelijktijdige aanwezigheid in het reactievat van enzymen en microörganismen voor de verschillende stappen nodig, I en dat genoemde enzymen en microörganismen in onbeweeglijke toe-10 stand in het reactievat verkeren. Bepaalde werkwijzen zijn voorge- i steld waarbij zowel een enzym als een microörganisme tegelijkertijd in het reactievat aanwezig zijn voor een gelijktijdig uit- ! voeren van twee onderling verschillende stappen van een biochemische omzetting. Daar men in deze gevallen echter met portiegewijze ] 15 bereidingen te maken had werden slechts lage opbrengsten bereikt j en was het nodig na het aflopen van de reactie te trachten enzym j en microörganismen van de reactieprodukten te scheiden. Met het doel de diverse reactiestappen continu uit te voeren zijn werk- j wijzen voor het vastleggen van elk der enzymen en microörganismen j 20 op zich in onderling verschillende soorten dragers voorgesteld. | 4 i

Een ernstig probleem dat men bij het vastleggen van enzymen te- j genkomt is dat enzymen betrekkelijk kleine moleculaire afmetingen ; hebben en dus niet gemakkelijk vastgelegd kunnen worden door alleen i absorptie of fysiek insluiten in een drager. Dit leidt tot een 25 belangrijk verlies of "weglekken" van het enzym uit de drager, waardoor de activiteit snel achteruit loopt en de enzym-katalysa-tor zijn effect verliest, waarna de katalysator verwisseld moet j | worden. Om de verschillende, onderling uiteenlopende reactie- j I stappen van een biochemische omzetting effectief tegelijkertijd | 30 in ëën en dezelfde ruimte uit te voeren is het verder nodig dat het in een voorafgaande stap (bijvoorbeeld onder invloed van een ; enzym) gevormde produkt zo snel en doeltreffend mogelijk in con- I tact gebracht wordt met het enzym of het microörganisme dat men voor de volgende reactiestap nodig heeft. Dit lijkt moeilijk te 35 realiseren als de benodigde enzymen en microörganismen op zich j in onderling verschillende dragers vastgelegd zijn. j 8020306 t - 4 - ! Het is daarom een doel van de uitvinding j ! . . ! | een nieuwe en doeltreffende katalysator te verschaffen die ge- j | bruikt kan worden door het continu in ëën en dezelfde reactie- |

; J

! ruimte uitvoeren van twee of meer verschillende stappen van een j | 5 biochemische omzetting die voor bepaalde reactiestappen de aan- | wezigheid van tenminste ëën enzym en voor andere reactiestappen de aanwezigheid van tenminste ëën microörganisme vereist. !

Dit doel wordt bereikt met een katalysator volgens de uitvinding, die in hoofdzaak gekenmerkt wordt doordat 10 genoemde katalysator uit vaste dragerlichamen van ëën of meer polymeren bestaat, waarvan er tenminste ëën een verknoopt polymeer is, doordat tenminste ëën enzym door covalente bindingen aan het polymere materiaal van de dragerlichamen gebonden is, j en doordat tenminste ëën microörganisme fysiek ingesloten is j 15 in het driedimensionele ruimtenetwerk van genoemde lichamen.

Doordat het microörganisme door covalente j bindingen aan het polymere materiaal van de dragerlichamen ge-i bonden is is het verlies of "weglekken" van het enzym uit ge- i . ; noemde lichamen tijdens het verloop van de reactie erg klein, 20 waardoor de katalysator een lang nuttig leven heeft. De micro- j organismen zijn van zodanige moleculaire afmetingen dat ze zon- j der moeite effectief aan de dragerlichamen gehouden kunnen worden, dankzij het feit dat ze fysiek ingesloten zijn in het driedimen- j sionele rooster dat gevormd wordt door het verknoopte polymeer j 25 van de dragerlichamen. Doordat zowel het enzym als de microörga- | nismen in dezelfde dragerlichamen gebonden zijn liggen enzym en j j microörganisme ruimtelijk heel dicht bij elkaar, waardoor de j verschillende stappen van de omzetting zeer snel na elkaar kun- j nen verlopen, hetgeen gebleken is tot hoge opbrengsten te leiden.: 30 In principe kan een katalysator volgens de ! : uitvinding op de volgende wijze bereid worden: S Een enzym wordt aan een polymeer of mono- j meer in oplossing of suspensie toegevoegd, nadat eerst geschikte i | i bindende groepen van hetzij polymeer of monomeer hetzij van het 35 enzym geactiveerd zijn, zodat bij het samenbrengen van polymeer 1..... 1 of monomeer en enzym het enzym door covalente bindingen aan de i 8020306 - 5 - polymeer- of monomeer-moleculen gebonden wordt. Dan wordt aan de aldus ontstane suspensie of oplossing van polymeer of monomeer, met het covalent gebonden enzym, een ander polymeer of monomeer toegevoegd, dat gelijk aan of verschillend van het eerst gebruik-5 te polymeer of monomeer kan zijn, maar dat verknopen kan, en ook een microörganisme, waarna het systeem aan verknoping onderworpen wordt, zodat vaste lichamen van een driedimensioneel verknoopt polymeer ontstaan, waarin het enzym door covalente bindingen aan het polymere materiaal gebonden is en de microörganis-

J

10 men fysiek in het driedimensionele netwerk van het verknoopte | polymeer ingesloten liggen. |

Bij zo'n katalysatorbereiding volgens de j uitvinding zijn twee mogelijkheden denkbaar. Een mogelijkheid is j dat de "schijnbare" molecuulafmetingen van het enzym zodanig j 15 "vergroot" worden, doordat het met covalente bindingen aan het eerste polymeer verbonden is, dat deze polymeer-enzym-aggrega- j ten gemakkelijk in het driedimensionele netwerk van het daarna j te vormen verknoopte polymeer ingesloten en vastgehouden kunnen worden, net zoals het microörganisme. De andere mogelijkheid is i j 20 dat het polymeer of monomeer met daaraan het covalent gebonden enzym als integraal deel in de structuur van het daarna bereide ί verknoopte polymeer opgenomen wordt. j i

Voor het instellen van de covalente bindin- j gen tussen enzym en polymeer of monomeer kunnen verschillende j 25 chemische groepen in de moleculen van het enzym of polymeer of monomeer gebruikt worden. Hieronder vallen bijvoorbeeld hydroxy-, carboxy-, fenyl-, tyrosine-, amino- en thiol-groepen. Al deze j activeerbare groepen worden normaliter in het enzym gevonden, terwijl het polymeer of monomeer normaliter slechts ëën of twee 30 activeerbare groepen vertoont. Activering van de te gebruiken bin-| dende groepen kan hetzij aan het enzym hetzij aan het polymeer | of monomeer plaats vinden. Bij voorkeur is het het polymeer of j I monomeer dat geactiveerd wordt, daar het enzym in vele gevallen door de activeringsreactie schade kan oplopen. De covalente bin-35 dingen tussen enzym en polymeer of monomeer kunnen omkeerbaar ί i of onomkeerbaar zijn.

8020306 - 6 -

Diverse activeringsreacties kunnen gebruikt worden voor het activeren van de hierboven genoemde activeerbare groepen. Voorbeelden van zulke reacties zijn acyle-ring, arylering, alkylering, activering met broomcyaan, carbamy- i 5 lering, thiocarbamylering, amidine-vorming, reacties met poly- j mere aldehyden en glutaaraldehyde, diazotering, thiol-disulfide- | uitwisselingsreacties en vier-component-condensatiereacties. j Dergelijke activeringsreacties voor het scheppen van covalente j | bindingen tussen verschillende moleculen zijn voldoende bekend, j 10 De werkwijze volgens de uitvinding kan op j vele uiteenlopende polymeren toegepast worden. Voorbeelden van te i gebruiken polymeren omvatten polysacchariden zoals cellulose, j i zetmeel, agarose, dextran (oplosbaar of onoplosbaar), carrageee-j I nan, alginaten en chitine, vinyl-polymeren, polyaminen, eiwitten^ 15 polyaminen en polyurethanen. !

De verknopende polymerisatie die nodig is voor het inkapselen van het eerst bereide enzym-polymeer-com-plex of enzym-monomeer-complex en het microörganisme kan op ver-j schillende wijze gerealiseerd worden, afhankelijk van het ge-20 bruikte polymeer, bijvoorbeeld door verandering van temperatuur j (bijvoorbeeld bij carrageenan), door verandering van de ionensamenstelling van het medium (bijvoorbeeld in het geval van al-ginaat), door fotometrische processen (bijv. in het geval van urethaan) en door toevoegen van een geschikte polymerisatie-25 katalysator (bijv. in het geval van polyacrylamide). Het is gemakkelijk als de bereide polymeer-lichamen met de covalent gebonden enzymen en de fysiek ingesloten microörganismen de vorm van kleine parels hebben, met een doorsnede van enige tienden van een millimeter tot enige millimeters. Men begrijpt natuur-30 lijk dat lichamen met andere vormen en/of afmetingen ook gebruikt kunnen worden.

| Praktisch alle soorten microörganismen kun-j j nen bij de werkwijze toegepast worden, waaronder wieren, bacteriën, ! bacteriofagen, schimmels, virussen en antisera, protozoën en 35 gisten. Voorbeelden van dergelijke microörganismen vindt men in j I de katalogus van stammen, deel I, (1978) van de American Type | 8020306 - 7 -

Culture Collection, en in "General Microbiology" van R.Y.Stainer,j E.A. Adelberg en J.L. Ingraham (Macmillan Press Ltd., 4^e uitgave’, 1979). ! i

De uitvinding kan ook toegepast worden op j 5 praktisch alle soorten enzymen, zoals oxidoreductasen, transferasen, hydrolasen, lyasen, isomerasen en ligasen. Enzymen die tot deze zes groepen behoren zijn opgesomd in "Enzyme Nomenclature, Recommendations" (1978) van het Nomenclatuur-Committee van de Internationale Vereniging voor Biochemie, 10 gepubliceerd voor deze Internationale Vereniging voor Biochemie door Academie Press Ine.

De uitvinding is voornamelijk beproefd op de vervaardiging van katalysatoren voor het omzetten van cello-biose via glucose in ethanol, in overeenstemming met de reactieke-15 ten die in het begin genoemd werd, in welke katalysator het cova-| lent gebonden enzym, het fysiek ingesloten microörganisme Bakkers- gist (Saccharomyces cerivisiae) en het polymere materiaal algi- i naat. \

De uitvinding wordt nu nader toegelicht aan ; 20 de hand van de volgende voorbeelden. j

Voorbeeld I j

In 2 ml gedestilleerd water werd 100 mg j natriumalginaat gesuspendeerd, en om het alginaat te activeren j werden 32 mg N-hydroxysuccinimide en 28 mg EDC in 1 ml gedestil- j | 25 leerd water toegevoegd. Het activeren van het alginaat vond in j 15 minuten bij kamertemperatuur plaats. Toen werd 15 mg (3-gluco- i i ! sidase in 1 ml water toegevoegd. Men liet het koppelen van het alginaat met het enzym zich overnacht in een koude omgeving vol- j | trekken. De volgende dag werd een suspensie van nog 200 mg algi- j j 30 naat in 6 ml gedestilleerd water met het aldus verkregen algi-naat-8-glucosidase-complex gemengd, zodat men een eindvolume van j 10 ml had. Toen werd 500 mg bakkersgist gesuspendeerd in 5 ml 0,1 M acetaat-buffer met pH = 4,9 aan de oplossing toegevoegd, zodat de suspensie nu een volume van ongeveer 15 ml had. Met 35 deze suspensie werd een calciumalginaat-gel gemaakt door de j

suspensie langzaam in een oplossing van 0,1 M CaCl^ in 0,1 M

8020306 - 8 - acetaat-buffer van pH = 4,9 te druppelen, waarbij kleine parels alginaat-gel met een gemiddelde doorsnede van 2 mm verkregen werden. De gel-parels liet men tenminste 3 uur in de calcium-chloride-oplossing, waarbij verknoping van het alginaat-gel 5 plaatsvond, waarna de parels afgescheiden en in een acetaat- ! buffer met 0,01 M CaC^ bewaard werden. Uit een suspensie van ongeveer 15 ml aglinaat-sol werd ongeveer 7,4 g (nat) gel verkregen. |

De aldus gemaakte alginaat-parels, die j 10 covalent gebonden β-glucosidase en fysiek ingesloten bakkers- ί gist bevatten, werden gebruikt voor de bereiding van ethanol met i 5 % cellobiose als uitgangsstof. De alginaat-parels werden in een kolom opgesteld. Het volume van de kolom was 7,5 ml en hij bevatte 5,25 g (natte) alginaat-parels, en hij werd gebruikt bij 15 een temperatuur van 22°C. De omzetting van cellobiose in ethanol verliep na drie dagen bijna helemaal volgens de theorie, toen de ethanol-vorming een stationaire waarde van 1,5 % (gewicht/ j volume) bereikt had, wat overeenkomt met 60 % van de theoretische' waarde. De activiteit van de alginaat-parels bleek bij genoemde j ] 20 werktemperatuur tenminste 4 weken stabiel te zijn. Het verloop j van dit proces is weergegxeven in de onderste curve van de hierbij behorende tekening.

Alginaat-parels die op de beschreven wijze \ vervaardigd waren, maar driemaal zoveel enzym bevatten, werden 25 op eenzelfde wijze beproefd, en het resultaat daarvan wordt weergegeven door de bovenste curve van de tekening. Met de alginaat-parels van hogere enzym-activiteit werd de opbrengst van

60 % op 80 % van de theoretische waarde gebracht. De activiteit j van de aldus gevormde, uit alginaat bestaande parels bleek ook ! 30 in dit geval tenminste 4 weken stabiel te zijn. I

Op een wijze overeenkomstig die van voorbeeld I werden ook katalysatoren bestaande uit parels van calcium-I alginaat-gel bereid waarin het covalent gebonden enzym respec- j tievelijk β-galactosidase, amylase, een mengsel van endo- en exo-i 35 glucanasen met g-glucosidase of g-galactosidase was. Het g-galac-; tosidase ontleedt lactose, bijvoorbeeld in wei, in glucose, en dus 8020306 - 9 - j kunnen de alginaat-parels die dit enzym bevatten, gebruikt wor- i ! | den voor de bereiding van ethanol uit wei. Het enzym amylase ont leedt zetmeel tot glucose, en dus kunnen alginaat-parels die dit ; enzym bevatten gebruikt worden voor de bereiding van ethanol uit j 5 zetmeel. De cellolulytische enzymen endo-glucanase, exo-glucanase' en β-glucosidase breken samen cellulose tot glucose af, volgens | de reactievergelijkingen die in de inleiding genoemd zijn, en j dus kunnen alginaat-parels die een mengsel van deze enzymen be- j vatten gebruikt worden voor de bereiding van ethanol uit een cellii-10 lose-hydrolysaat.

Indien het enzym dat op de in voorbeeld I j beschreven wijze aan de alginaat-parels gebonden werd xylose-iso-! i merase is krijgt men een katalysator die gebruikt kan worden voor! de bereiding van ethanol uit xylose,met xylulose als tussenpro-15 dukt.

Bij gebruik van Penicillium sp„als micro-organisme en acylase als enzym is het mogelijk op de in voorbeeld I beschreven wijze een katalysator te bereiden die gebruikt kan worden voor de bereiding van 6-APA volgens de reactie-vergelijking 20 die in de inleiding genoemd is. j

Hoewel de uitvinding in het voorafgaande | voornamelijk toegelicht is betreffende katalysatoren bestaande uit polymere alginaat-parels die fysiek ingesloten bakkersgist als microörganisme en diverse covalent gebonden enzymen bevatten, ! 25 voor de bereiding van ethanol uit diverse substraten, begrijpt | ; men dat vele andere katalysatoren volgens de uitvinding bereid j kunnen worden uit vele andere soorten polymeer materiaal dan wat ! hier genoemd werd, met behulp van uiteenlopende enzymen en | microörganismen, in overeenstemming met de voorbeelden in het I 30 voorafgaande, voor het uitvoeren van vele uiteenlopende bioche- j mische omzettingen. j j i : ί i 8020306

Claims (11)

1. Katalysator voor biochemische omzettingen die de aanwezigheid van tenminste één enzym en tenminste één microörganisme vergen, waarbij genoemde katalysator uit vaste 5 dragerlichamen van een of meer polymeren bestaat, waarvan er tenminste één een verknoopt polymeer is, waarin tenminste één enzym door covalente bindingen aan het polymere materiaal van de j dragerlichamen gebonden is, en er tenminste één microörganisme j fysiek in de driedimensionele structuur van het verknoopte poly-10 meer ingesloten is.

2. Katalysator volgens conclusie 1, waarin I ! het enzym covalent gebonden is door middel van carboxy-, hydroxy-,: j fenyl-, tyrosine-, amino- of thiol-groepen van het polymeer of I het enzym. i

3. Katalysator volgens conclusie 1 of 2, waarin de vaste lichamen de vorm van parels met een doorsnede van j | de orde van enige tienden van een millimeter tot enige millimeters' | hebben.

4. Katalysator volgens een der conclusies 20. t/m 3, waarin het polymere materiaal in de vaste lichamen een polysaccharide, zoals cellulose, zetmeel, agarose, dextran, carra- # · · ' geenan, algmaat of chitme is, of een vinyl-polymeer of een poly- amine of een eiwit of een polyamide of een polyurethaan.

5. Katalysator volgens een der conclusies 25. t/m 4, waarin het enzym een oxidoreductase, een transferase, een hydrolase, een lyase, een isomerase of een ligase is. !

6. Katalysator volgens een der conclusies j 1 t/m 5, waarin het microörganisme tot de wieren, bacteriën, j bacteriofagen, schimmels, virussen, antisera, protozoën of j 3. gisten behoort.

7. Katalysator volgens conclusie 1 voor het j bereiden van ethanol, bestaande uit parels van verknoopt calcium- I j j alginaat met fysiek ingesloten bakkersgist en een of meer cova- | I lent gebonden enzymen uit de groep van β-glucosidase, β-galactosi-i 35 dase, amylase, een mengsel van endo-glucanasen en exo-glucanasen :___________________met g-glucosidase en xylose-isomerase.______________________ j 8020306 - 11 - \ ν'

8. Werkwijze voor het bereiden van een kata-j ] lysator voor biochemische omzettingen, waarbij aan een polymeer of monomeer in oplossing of suspensie tenminste één enzym toege-! : | voegd wordt, nadat eerst geëigende molecuulgroepen van het enzym j j | i 5 of van polymeer of monomeer geactiveerd zijn, zodat bij het samen- i ; i brengen van enzym en polymeer of monomeer het enzym de covalente j bindingen aan de moleculen van genoemde polymeer of monomeer gebonden wordt, waarna het polymeer of monomeer met het daaraan ! covalent gebonden enzym in oplossing of suspensie met tenminste | 10 ëën verknoopbaar polymeer of monomeer gemengd wordt, waarna het | | aldus verkregen mengsel onderworpen wordt aan een verknopende | ! polymerisatie zodat vaste lichamen ontstaan van polymeer dat een j I , . i | covalent aan het polymeer-materiaal gebonden enzym en een fysiek j j. in het driedimensionale netwerk van deze lichamen ingesloten micrq- i 15 organismen bevat. j

9. Werkwijze volgens conclusie 8, waarbij I met het oogmerk tussen het genoemde enzym en het genoemde poly- ! meer of monomeer covalente bindingen in te stellen, hydroxy-, | carboxy-, fenyl-, tyrosine-, amino- of thiol-groepen van het enzym 20 of van het polymeer of monomeer gebruikt worden.

10. Werkwijze volgens conclusie 8 of 9, waarbij genoemde covalente bindingen ingésteld worden door bepaalde molecuulgroepen van het polymeer of monomeer te activeren.

11. Werkwijze volgens een der conclusies 8 t/m 10, waarbij het polymeer of monomeer dat voor de uiteindelijke verknoopte, driedimensionele structuur gebruikt wordt, van j | hetzelfde soort is als het polymeer of monomeer dat voor het | covalent binden van het enzym gebruikt werd. ! 30 | ί I i... ! ; i ! j 8020306