SE423718B - Samtidigt immobiliserade enzym(er) och mikroorganism(er) och deras framstellning - Google Patents

Description

-8102554f6 2 Cellulosa -gå oLigosackarider -ga cellobios M ïrgïfiæššïääšt g1“k°S sagëšïïäšït e*a“°1* cellulosa -ga oligosackaríder -gå cellobios -9 E M ërgïaíašïäzšt g1“k°S saíïazïzs* b“*a“°1* . M sfärkelSe g1Uk0S Gfñn01§ E galaktos 1aktos(vassle) íjšâïäíïašïääšä glukos -ä M 61231101; E M XylOS XylulOS etahOl.

Ett exempel på en konverteringsreaktion av den andra typen är M _ . . E substrat Penlcllllum SP benzylpeniclllin âëšïâšà -> 8-aminopenicillanic acid(6-APA).

Detta är endast några få exempel på det stora antalet kända biokemiska konverteringsreaktioner av detta slag.

A _ Utmärkande för dessa biokemiska reaktioner är, att reaktionshastigheten påverkas av närvaron av den bildade produkten, så att reaktionen förlöper allt långsammare och till slut helt avstannar, då halten av den bildade produk- ten ökar. Vid ett satsvis genomförande av de olika reak- tionsstegen i en såå process avbrytes sålunda reaktionen automatiskt vid en oftast förhållandevis låg utbytesnivå, varefter den bildade produkten måste separeras från ut- gångssubstratet och den använda katalysatorn, dvs. det an- vända enzymet eller mikroorganismen, så att den ofta dyr- bara katalysatorn kan användas på nytt och ej heller kommer att ingå i den avlägsnade slutprodukten, vilket ofta ej är önskvärt. Dessa separeringsoperationer äremellertid 8102554-6 3 ofta omständliga och dyra att genomföra. Det är därför önskvärt att kunna genomföra de olika stegen i en process av detta slag medelst ett kontinuerligt förfarande, vid vilket reaktionsprodukterna fortlöpande avlägsnas från reaktionsutrymmet, så att reaktionen kan förlöpa ohindrad med ett högt utbyte. Ett sådant kontinuerligt förfarande kräver emellertid, att den använda katalysatorn, dvs. det använda enzymet eller den använda mikroorganismen, är på något sätt immobiliserad, så att den förblir kvar i reak- tionsutrymmet och ej följer med den kontinuerliga strömmen av reaktionsprodukter ut ur reaktionsutrymmet. Ur ekonomisk och praktisk synpunkt skulle det vidare vara mycket fördel- aktigt, om man kunde genomföra två eller flera av stegen i en biokemisk konverteringsreaktion av det ifrågavarande slaget kontinuerligt i ett och samma reaktionsutrymme, exempelvis i en och samma kolonn. Detta kräver dock, att de för de olika reaktionsstegen erforderliga enzymerna och mikroorganismerna förefínnes samtidigt och i ímmobiliserat tillstånd i reaktionsutrymmet. Vissa processer har tidigare föreslagits, vid vilka såväl ett enzym som en mikroorga- nism är samtidigt närvarande i reaktionsutrymmet för sam- tidigt genomförande av två olika steg i en biokemisk kon- verteringsreaktion. Eftersom det härvid varit frågan om satsvisa processer, har man emellertid erhållit ett lågt utbyte och varit tvungen att efter reaktionens avslutande försöka frânskilja det använda enzymet och den använda mikroorganismen från reaktionsprodukterna. För ett konti- nuerligt genomförande av de olika reaktionsstegen har man även föreslagit sätt att var för sig immobilisera enzymer respektive mikroorganismer i olika typer av bärare. Vid immobilisering av enzymer föreligger därvid det väsentliga problemet, att enzymerna i allmänhet har en förhållandevis liten molekylstorlek, varför de ej lätt kan immobilisera enbart genom adsorption eller ren fysisk inneslutning i en bärare. Det uppstår härvid en väsentlig förlust eller "läckage" av enzymet från bäraren, varigenom aktiviteten snabbt avtar och enzymkatalysatorn förlorar sin verkan och mäste ersättas. För ett effektivt genomförande av flera -8102554-6 H olika reaktionssteg i en biokemisk konverteringsreaktion samtidigt i ett och samma reaktíonsutrymme kräves vidare, att den produkt som bildas i ett föregående reaktionssteg, exempelvis under inverkan av ett enzym, så snabbt och effek- tivt som möjligt kommer i kontakt med det enzym eller den mikroorganism som kräves för det efterföljande reaktions- stegets genomförande. Detta synes vara svårt att uppnå, om de erforderliga enzymerna och mikororganismerna är immobi- liserade var för sig på olika bärare.

Ett ändamål med föreliggande uppfinning är därför att åstadkomma en ny och effektiv katalysator, som kan an- vändas för ett kontinuerligt genomförande i samma reaktions- utrymme av tvâ eller flera olika steg i en biokemisk kon- verteringsreaktion, som för vissa reaktíonssteg kräver när- varo av minst ett enzym och för andra reaktionssteg kräver närvaro av minst en mikroorganism.

Detta uppnås medelst en katalysator enligt uppfin- ningen, som väsentligen kännetecknas av att den innefattar fasta bärarkroppar av en eller flera polymerer, varav åt- minstone en är en rymdnätsbunden polymer, och att minst ett enzym är kovalent bundet till bärarkropparnas polymer- material och att minst en mikroorganism är fysiskt inne- sluten i bärarkropparnas tredimensionella rymdnätsstruktur.

Genom att enzymet är kovalent bundet till bärar- kropparnas polymermaterial uppnås, att förlusten eller "läckningen" av enzymet från barärkropparna blir mycket liten under reaktionens förlopp, varigenom katalysatorn får en lång livslängd. Mikroorganismerna har en sådan stor molekylstorlek, att de utan svårighet kan hållas effektivt bundna vid bärarkropparna, genom att de är fysiskt inne- slutna i det tredimensionella fackverk som bildas av bärarkropparnas rymdnätsbundna polymer. Genom att såväl enzym som mikroorganism är bundna i samma bärarkroppar, kommer enzym och mikroorganism att rumsmässigt befinna sig mycket nära intill varandra, varigenom de olika stegen i konverteringsreaktíonen kan förlöpa mycket snabbt efter varandra, vilket visat sig ge ett högt utbyte.

En katalysator enligt uppfinningen kan framställas på 8192554-6 = 5 i princip följande sätt: Till en polymer eller monomer i lösning eller suspen- sion sättes ett enzym, sedan dessförinnan lämpliga bindnings- grupper hos antingen polymeren respektive monomeren eller enzymet aktiverats, så att efter sammanförandet av polyme- ren respektive monomeren och enzymet en kovalent bindning av enzymet till polymerens eller monomerens molekyler er- hålles. Till den så erhållna suspensionen eller lösningen av polymer eller monomer med kovalent bundet enzym sättes därefter ytterligare polymer eller monomer, som kan vara av ett annat eller samma slag som den först använda poly- meren respektive monomeren men som måste vara i stånd till rymdnätspolymerisering, och vidare en mikroorganism, var- efter systemet underkastas en rymdnätspolymerisering, så att fasta kroppar av en rymdnätspolymer med tredimensio- nellstruktur erhålles, i vilka enzymet är kovalent bundet till polymermaterialet och mikroorganismen är fysiskt innesluten i rymdnätspolymerens tredimensionella struktur.

Vid en sådan framställning av en katalysator enligt uppfinningen synes man kunna tänka sig två olika möjlig- heter. Den ena är, att enzymet genom sin kovalenta bind- ning till den första polymeren får sin "skenbara" molekyl- storlek så "förstorad", att dessa polymer-enzym-aggregat utan svårighet kan inneslutas och hållas fast i den därefter framställda rymdnätspolymerens tredimensionella struktur på samma sätt som mikroorganismen. Den andra möjligheten är, att den med kovalent bundet enzym försedda polymeren eller monomeren kommer att ingå som en del i den därefter framställda rymdnätspolymerens struktur.

För den kovalenta bindningen mellan enzym och polymer eller monomer kan flera olika grupper i enzymets eller polymerens respektive monomerens molekyler utnyttjas. Så- dana användbara grupper är exempelvis hydroxylgrupper, karboxylgrupper, fenylgrupper, tyrosingrupper, amino- grupper och tiolgrupper. Samtliga dessa aktiverbara grupper förekommer i allmänhet hos enzymet, medan polymeren eller monomeren som regel innehåller bara en eller två aktiver- bara molekylgrupper. Aktiveringen av de använda bindnings- ai1ozss4-e i 6 grupperna kan antingen ske på enzymet eller på polymeren respektive monomeren, varvid det i allmänhet är att före- _ draga aktivering på polymeren respektive monomeren, efter- som enzymet i många fall är av sådant slag, att det kan pâ- verkas ofördelaktigt av aktiveringsreaktionen. De kovalenta bindningarna mellan enzym och polymer eller monomer kan vara reversibla eller irreversibla.

För aktivering av de ovan nämnda aktiverbara grupperna kan flera olika aktiveringsreaktioner användas. Sådana ak- tiveringsreaktioner är exempelvis acylering, arylering, alkylering,cyanogenbromidaktívering, karbamylering, tio- karbamylering, amidinering, reaktioner med polymera alde- hyder, glutaraldehydreaktioner, diazotering, tiol-disulfid- utbytesreaktioner och fyr-komponent-kondenseringsreaktioner.

Sådana aktiveríngsreaktioner för kovalent bindning mellan olika molekyler är i och för sig väl kända.

Uppfinningen kan genomföras med användning av många olika polymerer. Exempel på användbara polymerer är poly- sackarider såsom cellulosa, stärkelse, agaros, dextran (löslig eller olöslig), karrageenan, alginat och kitin; vinylpolymerer; polyaminer; proteiner; polyamider samt poly-, uretan.

Den för inneslutningen av det först framställda enzym- polymer-komplexet eller enzym-monomer-komplexet och mikro- organismen erforderliga rymdnätspolymeriseringen kan genom- föras på olika sätt beroende av den använda polymeren, exempelvis genom temperaturändring (exempelvis för karra- geenan), ändring av jonsammansättningen i mediet (exempel- vis för alginat), på fotometrisk väg (exempelvis för uretan)¶ och genom tillsättning av lämplig polymeriseringskatalysa- tor (exempelvis för polyakrylamid). De framställda polymer- kropparna med kovalent bundet enzym och fysiskt innesluten mikroorganism har med fördel formen av små kulor med en diameter om några tiondels millimeter eller några milli- meter. Naturligtvis kan dock även katalysatorkroppar med annan form och/eller storlek användas; Praktiskt taget alla typer av mikroorganismer kan användas enligt uppfinningen, såsom exempelvis alger, 8102554-6 I bakterier, bakteriofager, svampar, virus, protozoer och jäst. Exempel på sådana mikroorganismer âterfinnes i: The American Type Culture Collection, Catalogue of Strains I, 1978, Stainer, R.Y., Adelberg,E.A. and Ingraham, J.L.; och "General Microbiology", Fourth Edition, 1979, The Macmillan Press Ltd.

Uppfinningen kan även tillämpas för praktiskt taget alla typer av enzymer, såsom oxidoreduktaser, transferaser, hydrolaser, lyaser, isomeraser och ligaser. Enzymer till- hörande dessa sex grupper finnes uppräknade i: Enzyme Nomenclature, Recommendations (1978) of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry; published for the International Union of Biochemistry by Academic Press (AP), Inc.

Uppfinningen har i första hand provats för framställ- ning av katalysatorer innehållande kovalent bundet B- glukosidas som enzym och fysiskt innesluten bagerijäst (Saccharomyces cerivisiae) som mikroorganism för konver- tering av cellobios till etanol via glukos i enlighet med den inledningsvis lämnade reaktionsformeln, varvid alginat används som polymermaterial.

Detta skall illustreras med följande utföringsexempelz Exempel 1 100 mg natriumalginat suspenderas i 2 ml destillerat vatten. För aktivering av alginatet tillsattes 32 mg N- hyaroxisuccinimid och 28 mg EDC Jfl-eryl-s-(a dimeryi- aminopropyl)-karbodiimid) HCÜ löst i 1 ml destillerat vatten. Alginatet tilläts aktiveras under 15 minuter vid rumstemperatur. Därefter tillsattes 15 mg ß-glukosidas löst i l ml vatten. Kopplingen mellan alginat och enzym tilläts fortgå över natten i kyla. Nästa dag blandades en suspen- sion av ytterligare 200 mg alginat i 6 ml destillerat vatten med det erhållna alginat-B-glukosídas-komplexet, så att en slutlig volym av 10 ml erhölls. Till denna suspen- sion sattes 500 mg bagerijästceller suspenderade i 5 ml 0,1 M acetatbuffert, pH = 4,9, så att en suspensionsvolym om ca 15 ml erhölls. Med användning av denna suspension framställdes ett kalciumalginatgel, genom att suspensionen långsamt droppades ned i en lösning om 0,1 M CaC12 i 8102554-5 8 0,1 M acetatbuffert, pH = U,9, varigenom små kulor av alginatgel med en medeldiameter av ca 2 mm erhölls. Gel- kulorna fick kvarstanna i kalciumkloridlösningen under åtminstone-3 timmar, under vilken tid rymdnätspolymerise- ringen av alginatgelen ägde rum, varefter kulorna togs upp och lagrades i acetatbuffert innehållande 0,01 M CaCl2.

Man erhöll ca 7,4 g (våtvikt) gel från en suspension om ca 15 ml alginatsol.

På detta sätt framställda alginatkulor innehållande kovalent bundet B-glukosidas och fysiskt inneslutna bageri- jästceller användes för framställning av etanol med an- vändning av 5% cellobios som utgångsmaterial. Alginatku- lorna anordnades i en kolonn med volymen 7,5 ml innehållande ,25 g (våt vikt) alginatkulor. Kolonnen drevs vid en temperatur av 2200. Omvandlingen av cellobios till etanol nådde nära det teoretiska värdet efter 3 dagar och etanol- produktionen nådde därefter ett fortfarighetstillstånd av 1,5 % (vikt/volym), svarande mot ca 60 % av det teore- tiska utbytet. Alginatkulornas aktivitet visade sig vara stabil under åtminstone fyra veckor vid den nämnda arbetstemperaturen.'Processförloppet illustreras av den undre kurvan i bifogade ritning.

Alginatkulor framställda på det ovan beskrivna sättet men innehållande tre gånger så mycket enzym provades på samma sätt, varvid ett resultat enligt den övre kurvan i bifogade ritning erhölls. Med dessa alginatkulor med högre enzymaktivitet höjdes sålunda utbytet från 60 % till 80 % av det teoretiska värdet. Även i detta fall förblev akti- viteten hos den av alginatkulorna bildade katalysatorn stabil under minst fyra veckor.

På samma sätt som beskrivits i Exempel l har även katalysatorer bestående av kulor av kalciumalginatgel framställts, vilka som kovalent bundet enzym haft B- galaktosidas resp. amylas resp. en blandning av endo- och exo-glukanaser och B-glukosidas. B-galaktosidas bryter ned ' laktosen i exempelvis vassle till glukos och de detta enzym innehållande alginatkulorna kunde sålunda användas för framställning av etanol från vassle. Enzymet amylas lÛ . 8102554-6 ' 9 bryter ned stärkelse till glukos och de detta enzym inne- hållande alginatkulorna kunde sålunda användas för fram- ställning av etanol ur stärkelse. De cellulolytiska enzy- merna endo- och exo-glukanaser och ß-glukosidas bryter tillsammans ned cellulosa till glukos enligt de inlednings- vis lämnade reaktíonsformlerna och de denna blandning av enzymer innehållande alginatkulorna kunde sålunda användas för framställning av etanol från cellulosahydrolysat.

Genom att vid framställning av alginatkulor enligt Exempel l som enzym använda xylosisomeras kan man erhålla en katalysator, som kan användas för framställning av etanol från xylos via xylulos som mellanprodukt.

Genom att använda Penicillium sg som mikroorganism och acylas som enzym är det möjligt att på det i Exempel l beskrivna sättet framställa en katalysator, som kan använ-J" das för framställning av 6-APA enligt den inledningsvis angivna reaktionsformeln.

Ehuru uppfinningen ovan exemplifierats i detalj i första hand med avseende på katalysatorer bestående av kulor av algínat som polymer innehållande fysiskt innesluten bagerijäst som mikroorganism och olika, kovalent bundna enzymer för framställning av etanol från olika utgångssub- strat, ínses det, att katalysatorer enligt uppfinningen kan framställas av många olika slag med användning av många andra polymermaterial, enzymer och mikroorganismer enligt de i det föregående lämnade exemplifieringarna för genom: förande av många olika biokemiska konverteringsreaktioner.

Claims (11)

8102554-6 10 Patentkrav

1. l. Katalysator för biokemiska konverteringsreaktioner, som kräver närvaro av minst ett enzym och minst en mikro- organism, k ä n n e_t e c k n a d av att den innefattar fasta kroppar av en eller flera polymerer, varav åtminstone en är en rymdnätspolymer, varvid minst ett enzym är kova- lent bundet till kropparnas polymermaterial och minst en mikroorganism är fysiskt innesluten i rymdnätspolymerens tredimensionella struktur.

2. Katalysator enligt krav l, k ä n n e t e c k n a d av att enzymet är kovalent bundet medelst karboxylgrupper, hydroxylgrupper, fenylgrupper, tyrosingrupper, aminogrupper eller tiolgrupper hos polymeren eller enzymet.

3. Katalysator enligt krav l eller 2, k ä n n e - t e c k n a d av att de fasta kropparna har formen av kulor med en diameter av storleksordningen några tiondels millimeter eller några millimeter.

4. U. Katalysator enligt något av kraven l - 3, k ä n n e - t e c k n a d av att polymermaterialet i de fasta kropparna utgöres av en polysackarid såsom exempelvis cellulosa, stärkelse, agaros, dextran, karrageenan, alginat och kitin,eller en vinylpolymer, en polyaminosyra, ett protein, en polyamid eller polyuretan.

5. Katalysator enligt något av kraven l - R, k ä n n e - t e c k n a d av att enzymet är en oxidoreduktas, trans- feras, hydrolas, lyas, isomeras eller ligas.

6. Katalysator enligt något av kraven l - 5, k ä n n e - t e c k n a d av att mikroorganismen utgöres av alger, bakterier, bakteriofager, svampar, virus, protozoer eller jäst.

7. Katalysator enligt krav 1 för framställning av etanol, k ä n n e t e c k n a d av att den utgöres av kulor av rymdnätsbundet kalciumalginat innehållande fysiskt inne- sluten bagerijäst och ett eller flera kovalent bundna 8102554-6 ll enzymer bestående av B-glukosidas, eller B-galaktosidas, eller amylas, eller en blandning av endo- och exo-glukanaser J och ß-glukosidas, eller xylosisomeras.

8. Förfarande för framställning av en katalysator för biokemiska konverteringsreaktioner, k ä n n e t e c k n a t av att till en polymer eller monomer i lösning eller sus- pension sättes minst ett enzym, sedan dessförinnan lämpliga màlekylgrupper hos enzymet eller polymeren respektive monomeren aktiverats, så att efter sammanförandet av enzy- met och polymeren respektive monomeren en kovalent bindning av enzymets molekyler till polymerens respektive monomerens molekyler erhålles, varefter den så erhållna polymeren eller monomeren med kovalent bundet enzym blandas i lösning eller suspension med minst en mikroorganism och en polymer eller monomer, som är i stånd till rymdnätspolymerisering, och den så erhållna blandningen underkastas en rymdnätspoly- merisation, så att fasta kroppar av polymer innehållande till polymermaterialet kovalent bundet enzym och i rymd- nätsstrukturen fysiskt innesluten mikroorganism erhålles.

9. Förfarande enligt krav 8, k ä n n e t e c k n a t av att för den kovalenta bindningen mellan enzym och polymer eller monomer utnyttjas hydroxylgrupper, karboxyl- grupper, fenylgrupper, tyrosingrupper, aminogrupper eller tiolgrupper hos enzymet eller polymeren respektive mono- meren.

10. Förfarande enligt krav 8 eller 9, k ä n n e - t e c k n a t av att de kovalenta bindningarna åstad- kommes genom aktivering av valda molekylgrupper hos polymeren eller monomeren.

11. ll. Förfarande enligt något av kraven 8 - 10, k ä n n e - t e c k n a t av att samma polymer eller monomer användes för den kovalenta bindningen av enzymet och den slutliga rymdnätspolymeriseringen.