CN114317513A - 一种壳聚糖-羧甲基纤维素固定化酶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种壳聚糖‑羧甲基纤维素固定化酶的制备方法，其包括以下步骤：分别配置壳聚糖醋酸溶液和羧甲基纤维素溶液，将两种溶液混合形成混合溶液，配置木瓜蛋白酶溶液，以及在液体石蜡、石油醚中加入乳化剂形成油相预混液，然后在搅拌条件下，将混合溶液通过多孔膜压入油相预混液中，重复步骤⑥1h，⑦降温固化壳聚糖‑羧甲基纤维素微球，将微球洗涤后真空冻干，在将冻干的壳聚糖‑羧甲基纤维素微球加入浓度为木瓜蛋白酶溶液中，震荡吸附，再加入戊二醛溶液交联，后洗去多余的戊二醛溶液，干燥后得到壳聚糖‑羧甲基纤维素微球固定化木瓜蛋白酶。本发明制得的壳聚糖‑羧甲基纤维素微球固定化木瓜蛋白酶，微球孔隙多可负载更多的木瓜蛋白酶。
Description
技术领域
本发明涉及固定化酶的技术领域，尤其是一种壳聚糖-羧甲基纤维素固定化酶及其制备方法。
背景技术
固定化酶，是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。通常酶催化反应都是在水溶液中进行的，而固定化酶是将水溶性酶用物理或化学方法处理，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的状态。
如中国专利公开号为CN105316232A的《一种用于固定化酶制备反应的装置及其应用》所公开的，目前固定化酶最常用的制备方法有交联法和包埋法。
交联法是指借助多功能试剂使游离酶的氨基酸残基与双官能团或多官能团交联剂反应而发生交联的固定化方法。常用的双功能试剂有戊二醛、双重氮联苯胺-2-2’-二磺酸等，常用的多功能试剂为甲苯-2-异氰-4-异硫氰，其中应用最广泛的是戊二醛。戊二醛具有两个醛基，均可与酶或蛋白质的游离氨基反应，形成Schiff碱，从而使酶分子交联，制成固定化酶。
包埋法是将酶包埋在多孔载体中使酶固定的方法，其制备工艺简便且条件较为温和。载体不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变酶的高级结构，可获得较高的酶活力回收率。因此，相对来说，采用包埋法制备的固定化酶具有更大的优势。然而，由于包埋法制备固定化酶常用的载体如明胶、琼脂、琼脂糖、壳聚糖、海藻酸钠等，都具有高粘度的特性，因此制备过程中存在成型难、生产效率低的技术问题，以致无法实现大规模工业化生产。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种壳聚糖-羧甲基纤维素固定化酶的制备方法，该方法制得的微球形状规整、粒径均一、具有层级结构，其孔隙、层级间隙多可负载更多的木瓜蛋白酶。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种壳聚糖-羧甲基纤维素固定化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：①将壳聚糖粉末溶于醋酸溶液制成浓度为1～4mg/ml壳聚糖醋酸溶液，②将羧甲基纤维素中经乙醇润湿后，加入纯化水溶解制成浓度为1～2mg/ml的羧甲基纤维素溶液，③将羧甲基纤维素溶液壳聚和糖醋酸溶液混合均匀，形成混合溶液，④将木瓜蛋白酶溶解于pH为5.5的磷酸缓冲溶液制成浓度为3.5mg/ml的木瓜蛋白酶溶液，⑤液体石蜡和石油醚按重量比1:3混合，在液体石蜡和石油醚的混合液中加入乳化剂形成油相预混液，乳化剂在油相预混液中的质量百分比为2-3%，⑥在搅拌条件下，将壳聚糖醋酸溶液和羧甲基纤维素溶液的混合溶液通过多孔膜压入油相预混液中，重复步骤⑥1h，⑦冰浴0-5℃并继续搅拌，得到固化的壳聚糖-羧甲基纤维素微球，将固化的壳聚糖-羧甲基纤维素微球用石油醚离心洗涤3次，用无水乙醇抽洗4-5次，真空冻干得到壳聚糖-羧甲基纤维素微球，其中，羧甲基纤维素在壳聚糖-羧甲基纤维素微球中的质量百分比为11-20%，⑧将冻干的壳聚糖-羧甲基纤维素微球加入浓度为3.5mg/ml的木瓜蛋白酶溶液中，震荡吸附4h，⑨加入质量百分浓度为1-2.5%的戊二醛溶液交联1h，再用浓度为1.5mg/ml的甘氨酸溶液洗去多余的戊二醛溶液，干燥后得到壳聚糖-羧甲基纤维素微球固定化木瓜蛋白酶。
进一步的，所述乳化剂为司盘60、司盘40或司盘20。
进一步的，所述步骤⑧中，壳聚糖-羧甲基纤维素微球与木瓜蛋白酶的重量比为1000：1.16-1000:2.05。
进一步的，壳聚糖醋酸溶液和羧甲基纤维素溶液的混合溶液和油相预混液的体积比为1:2000-3000。
另一份发明目的：本发明还提供了一种采用上述方法制得的壳聚糖-羧甲基纤维素固定化酶。
采用上述方案，本发明的壳聚糖-羧甲基纤维素水凝胶所形成的凝胶网络结构，由于其含义大量的氨基和羧基基团，当其通过膜乳化反应形成微球时，该微球具有多层级状的网格或镂空面，而不是光滑或单层状的网格结构，从而使得该微球不仅在其表面，在其内部也具有更多的孔隙、更大的比表面积，再者，羧甲基纤维素先经过乙醇的浸润，当乙醇蒸发后会留下更多的孔隙，进一步增大微球的比表面积。因此该微球用于负载木瓜蛋白酶，其具有酶负载量高的优点，而且该微球结构大小更均匀，酶负载量均一性好，还具有酶量可控性好的优势。但是，如果羧甲基纤维素量过多，则会因壳聚糖-羧甲基纤维素微球中有大量的氨基和羧基在交联剂戊二醛的作用下发生分子间和分子内的交联，反而会将部分酶包覆在其内，降低酶的活性，如果羧甲基纤维素量过少，则达不到形成多层级状的网格结构，无法实现酶负载量高的特性。
下面结合附图对本发明作进一步描述。
附图说明
附图1为本发明具体实施例1的微球结构均一性示意图；
附图2为本发明具体实施例1微球表面的层级结构及酶的附着情况示意图。
具体实施方式
本发明的具体实施例壳聚糖-羧甲基纤维素固定化酶采用以下方法制备。
实施例1
①将壳聚糖粉末溶于醋酸溶液制成浓度为4mg/ml壳聚糖醋酸溶液，
②将羧甲基纤维素中经乙醇润湿后，加入纯化水溶解制成浓度为1mg/ml的羧甲基纤维素溶液，
③取100ml羧甲基纤维素溶液缓慢加入100ml壳聚糖醋酸溶液中，搅拌均匀，形成混合溶液，
④将木瓜蛋白酶溶解于pH为5.5的磷酸缓冲溶液制成浓度为3.5g/ml的木瓜蛋白酶溶液，
⑤液体石蜡和石油醚按重量比1:3混合，在液体石蜡和石油醚的混合液中加入司盘60形成油相预混液，乳化剂在油相预混液中的质量百分比为2%，
⑥在搅拌条件下，将壳聚糖醋酸溶液和羧甲基纤维素溶液的混合溶液通过多孔膜压入油相预混液中，壳聚糖醋酸溶液、羧甲基纤维素溶液的混合溶液和油相预混液的体积比为1:2000，重复步骤⑥1h，
⑦冰浴0-5℃并继续搅拌，得到固化的壳聚糖-羧甲基纤维素微球，将固化的壳聚糖-羧甲基纤维素微球用石油醚离心洗涤3次，用无水乙醇抽洗4-5次，真空冻干得到壳聚糖-羧甲基纤维素微球，其中羧甲基纤维素含量为19.2%，
⑧取2g冻干的壳聚糖-羧甲基纤维素微球加入100ml浓度为3.5mg/ml的木瓜蛋白酶溶液中，震荡吸附4h，
⑨加入质量百分浓度为1-2.5%的戊二醛溶液交联1h，再用浓度为1.5mg/ml的甘氨酸溶液洗去多余的戊二醛溶液，干燥后得到壳聚糖-羧甲基纤维素微球固定化木瓜蛋白酶，固化的壳聚糖-羧甲基纤维素微球粒径为50-72微米，固定化酶的酶活力达33.00U/g（蛋白酶在一定温度与pH条件下，水解酪蛋白底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪蛋白沉淀出去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定，根据吸收度计算酶活力，下同）。
实施例2
①将壳聚糖粉末溶于醋酸溶液制成浓度为4mg/ml壳聚糖醋酸溶液，
②将羧甲基纤维素中经乙醇润湿后，加入纯化水溶解制成浓度为1mg/ml的羧甲基纤维素溶液，
③取50ml羧甲基纤维素溶液缓慢加入100ml壳聚糖醋酸溶液中，搅拌均匀，形成混合溶液，
④将木瓜蛋白酶溶解于pH为5.5的磷酸缓冲溶液制成浓度为3.5g/ml的木瓜蛋白酶溶液，
⑤液体石蜡和石油醚按重量比1:3混合，在液体石蜡和石油醚的混合液中加入司盘60形成油相预混液，乳化剂在油相预混液中的质量百分比为2%，
⑥在搅拌条件下，将壳聚糖醋酸溶液和羧甲基纤维素溶液的混合溶液通过多孔膜压入油相预混液中，壳聚糖醋酸溶液和羧甲基纤维素溶液的混合溶液和油相预混液的体积比为1:2000，重复步骤⑥1h，
⑦冰浴0-5℃并继续搅拌，得到固化的壳聚糖-羧甲基纤维素微球，将固化的壳聚糖-羧甲基纤维素微球用石油醚离心洗涤3次，用无水乙醇抽洗4-5次，真空冻干得到壳聚糖-羧甲基纤维素微球，其中羧甲基纤维素含量为9.3%，
⑧取2g冻干的壳聚糖-羧甲基纤维素微球加入100ml浓度为3.5mg/ml的木瓜蛋白酶溶液中，震荡吸附4h，
⑨加入质量百分浓度为1-2.5%的戊二醛溶液交联1h，再用浓度为1.5mg/ml的甘氨酸溶液洗去多余的戊二醛溶液，干燥后得到壳聚糖-羧甲基纤维素微球固定化木瓜蛋白酶，固化的壳聚糖-羧甲基纤维素微球粒径为50-65微米，固定化酶的酶活力达22.24U/g。
实施例3
①将壳聚糖粉末溶于醋酸溶液制成浓度为3mg/ml壳聚糖醋酸溶液，
②将羧甲基纤维素中经乙醇润湿后，加入纯化水溶解制成浓度为1mg/ml的羧甲基纤维素溶液，
③取50ml羧甲基纤维素溶液缓慢加入100ml壳聚糖醋酸溶液中，搅拌均匀，形成混合溶液，
④将木瓜蛋白酶溶解于pH为5.5的磷酸缓冲溶液制成浓度为3.5g/ml的木瓜蛋白酶溶液，
⑤液体石蜡和石油醚按重量比1:3混合，在液体石蜡和石油醚的混合液中加入司盘60形成油相预混液，乳化剂在油相预混液中的质量百分比为2%，
⑥在搅拌条件下，将壳聚糖醋酸溶液和羧甲基纤维素溶液的混合溶液通过多孔膜压入油相预混液中，壳聚糖醋酸溶液和羧甲基纤维素溶液的混合溶液和油相预混液的体积比为1:2000，重复步骤⑥1h，
⑦冰浴0-5℃并继续搅拌，得到固化的壳聚糖-羧甲基纤维素微球，将固化的壳聚糖-羧甲基纤维素微球用石油醚离心洗涤3次，用无水乙醇抽洗4-5次，真空冻干得到壳聚糖-羧甲基纤维素微球，其中羧甲基纤维素含量为11.4%，
⑧取2g冻干的壳聚糖-羧甲基纤维素微球加入100ml浓度为3.5mg/ml的木瓜蛋白酶溶液中，震荡吸附4h，
⑨加入质量百分浓度为1-2.5%的戊二醛溶液交联1h，再用浓度为1.5mg/ml的甘氨酸溶液洗去多余的戊二醛溶液，干燥后得到壳聚糖-羧甲基纤维素微球固定化木瓜蛋白酶，固化的壳聚糖-羧甲基纤维素微球粒径为52-72微米，固定化酶的酶活力达28.34U/g。
实施例4
①将壳聚糖粉末溶于醋酸溶液制成浓度为2mg/ml壳聚糖醋酸溶液，
②将羧甲基纤维素中经乙醇润湿后，加入纯化水溶解制成浓度为1mg/ml的羧甲基纤维素溶液，
③取50ml羧甲基纤维素溶液缓慢加入100ml壳聚糖醋酸溶液中，搅拌均匀，形成混合溶液，
④将木瓜蛋白酶溶解于pH为5.5的磷酸缓冲溶液制成浓度为3.5g/ml的木瓜蛋白酶溶液，
⑤液体石蜡和石油醚按重量比1:3混合，在液体石蜡和石油醚的混合液中加入司盘60形成油相预混液，乳化剂在油相预混液中的质量百分比为2%，
⑥在搅拌条件下，将壳聚糖醋酸溶液和羧甲基纤维素溶液的混合溶液通过多孔膜压入油相预混液中，壳聚糖醋酸溶液和羧甲基纤维素溶液的混合溶液和油相预混液的体积比为1:2000，重复步骤⑥1h，
⑦冰浴0-5℃并继续搅拌，得到固化的壳聚糖-羧甲基纤维素微球，将固化的壳聚糖-羧甲基纤维素微球用石油醚离心洗涤3次，用无水乙醇抽洗4-5次，真空冻干得到壳聚糖-羧甲基纤维素微球，其中羧甲基纤维素含量为18.3%，
⑧取2g冻干的壳聚糖-羧甲基纤维素微球加入100ml浓度为3.5mg/ml的木瓜蛋白酶溶液中，震荡吸附4h，
⑨加入质量百分浓度为1-2.5%的戊二醛溶液交联1h，再用浓度为1.5mg/ml的甘氨酸溶液洗去多余的戊二醛溶液，干燥后得到壳聚糖-羧甲基纤维素微球固定化木瓜蛋白酶，固化的壳聚糖-羧甲基纤维素微球粒径为52-68微米，固定化酶的酶活力达31.00U/g
实施例5
①将壳聚糖粉末溶于醋酸溶液制成浓度为1mg/ml壳聚糖醋酸溶液，
②将羧甲基纤维素中经乙醇润湿后，加入纯化水溶解制成浓度为1mg/ml的羧甲基纤维素溶液，
③取25ml羧甲基纤维素溶液缓慢加入100ml壳聚糖醋酸溶液中，搅拌均匀，形成混合溶液，
④将木瓜蛋白酶溶解于pH为5.5的磷酸缓冲溶液制成浓度为3.5g/ml的木瓜蛋白酶溶液，
⑤液体石蜡和石油醚按重量比1:3混合，在液体石蜡和石油醚的混合液中加入司盘60形成油相预混液，乳化剂在油相预混液中的质量百分比为2%，
⑥在搅拌条件下，将壳聚糖醋酸溶液和羧甲基纤维素溶液的混合溶液通过多孔膜压入油相预混液中，壳聚糖醋酸溶液和羧甲基纤维素溶液的混合溶液和油相预混液的体积比为1:2000，重复步骤⑥1h，
⑦冰浴0-5℃并继续搅拌，得到固化的壳聚糖-羧甲基纤维素微球，将固化的壳聚糖-羧甲基纤维素微球用石油醚离心洗涤3次，用无水乙醇抽洗4-5次，真空冻干得到壳聚糖-羧甲基纤维素微球，其中羧甲基纤维素含量为18.5%，
⑧取2g冻干的壳聚糖-羧甲基纤维素微球加入100ml浓度为3.5mg/ml的木瓜蛋白酶溶液中，震荡吸附4h，
⑨加入质量百分浓度为1-2.5%的戊二醛溶液交联1h，再用浓度为1.5mg/ml的甘氨酸溶液洗去多余的戊二醛溶液，干燥后得到壳聚糖-羧甲基纤维素微球固定化木瓜蛋白酶，固化的壳聚糖-羧甲基纤维素微球粒径为52-72微米，该固定化酶的酶活力达33.04U/g。
实施例6
①将壳聚糖粉末溶于醋酸溶液制成浓度为4mg/ml壳聚糖醋酸溶液，
②将羧甲基纤维素中经乙醇润湿后，加入纯化水溶解制成浓度为1mg/ml的羧甲基纤维素溶液，
③取100ml羧甲基纤维素溶液缓慢加入100ml壳聚糖醋酸溶液中，搅拌均匀，形成混合溶液，
④将木瓜蛋白酶溶解于pH为5.5的磷酸缓冲溶液制成浓度为3.5g/ml的木瓜蛋白酶溶液，
⑤液体石蜡和石油醚按重量比1:3混合，在液体石蜡和石油醚的混合液中加入司盘60形成油相预混液，乳化剂在油相预混液中的质量百分比为2%，
⑥在搅拌条件下，将壳聚糖醋酸溶液和羧甲基纤维素溶液的混合溶液通过多孔膜压入油相预混液中，壳聚糖醋酸溶液、羧甲基纤维素溶液的混合溶液和油相预混液的体积比为1:3000，重复步骤⑥1h，
⑦冰浴0-5℃并继续搅拌，得到固化的壳聚糖-羧甲基纤维素微球，将固化的壳聚糖-羧甲基纤维素微球用石油醚离心洗涤3次，用无水乙醇抽洗4-5次，真空冻干得到壳聚糖-羧甲基纤维素微球，其中羧甲基纤维素含量为19.2%，
⑧取2g冻干的壳聚糖-羧甲基纤维素微球加入100ml浓度为3.5mg/ml的木瓜蛋白酶溶液中，震荡吸附4h，
⑨加入质量百分浓度为1-2.5%的戊二醛溶液交联1h，再用浓度为1.5mg/ml的甘氨酸溶液洗去多余的戊二醛溶液，干燥后得到壳聚糖-羧甲基纤维素微球固定化木瓜蛋白酶。固化的壳聚糖-羧甲基纤维素微球粒径为42-55微米，固定化酶的酶活力达30.24U/g。
上述实施1-6中，羧甲基纤维素在混合溶液中的质量分数不同，对羧甲基纤维素在微球中的含量的多少起到影响，当羧甲基纤维素含量在11-20%时，可以形成多层级状的网格或镂空面，使得木瓜蛋白酶不仅可以在层状表层固定，更多是固定于层状与层状之间的空隙或交叠之处，如图2所示，而且微球粒径较均一，如图1所示，粒径范围在50-72微米，而固定化酶的酶活力受微球结构（层级结构以及粒径大小）的影响。
实施例7
①将壳聚糖粉末溶于醋酸溶液制成浓度为1mg/ml壳聚糖醋酸溶液，
②将羧甲基纤维素中经乙醇润湿后，加入纯化水溶解制成浓度为1mg/ml的羧甲基纤维素溶液，
③取25ml羧甲基纤维素溶液缓慢加入100ml壳聚糖醋酸溶液中，搅拌均匀，形成混合溶液，
④将木瓜蛋白酶溶解于pH为5.5的磷酸缓冲溶液制成浓度为3.5g/ml的木瓜蛋白酶溶液，
⑤液体石蜡和石油醚按重量比1:3混合，在液体石蜡和石油醚的混合液中加入司盘60形成油相预混液，乳化剂在油相预混液中的质量百分比为2%，
⑥在搅拌条件下，将壳聚糖醋酸溶液和羧甲基纤维素溶液的混合溶液通过多孔膜压入油相预混液中，重复步骤⑥1h，
⑦冰浴0-5℃并继续搅拌，得到固化的壳聚糖-羧甲基纤维素微球，将固化的壳聚糖-羧甲基纤维素微球用石油醚离心洗涤3次，用无水乙醇抽洗4-5次，真空冻干得到壳聚糖-羧甲基纤维素微球，其中羧甲基纤维素含量为18.1%，
⑧取4g冻干的壳聚糖-羧甲基纤维素微球加入100ml浓度为3.5mg/ml的木瓜蛋白酶溶液中，震荡吸附4h，
⑨加入质量百分浓度为1-2.5%的戊二醛溶液交联1h，再用浓度为1.5mg/ml的甘氨酸溶液洗去多余的戊二醛溶液，干燥后得到壳聚糖-羧甲基纤维素微球固定化木瓜蛋白酶，该固定化酶的酶活力达30.42U/g。
实施例8
①将壳聚糖粉末溶于醋酸溶液制成浓度为1mg/ml壳聚糖醋酸溶液，
②将羧甲基纤维素中经乙醇润湿后，加入纯化水溶解制成浓度为1mg/ml的羧甲基纤维素溶液，
③取25ml羧甲基纤维素溶液缓慢加入100ml壳聚糖醋酸溶液中，搅拌均匀，形成混合溶液，
④将木瓜蛋白酶溶解于pH为5.5的磷酸缓冲溶液制成浓度为3.5g/ml的木瓜蛋白酶溶液，
⑤液体石蜡和石油醚按重量比1:3混合，在液体石蜡和石油醚的混合液中加入司盘60形成油相预混液，乳化剂在油相预混液中的质量百分比为2%，
⑥在搅拌条件下，将壳聚糖醋酸溶液和羧甲基纤维素溶液的混合溶液通过多孔膜压入油相预混液中，重复步骤⑥1h，
⑦冰浴0-5℃并继续搅拌，得到固化的壳聚糖-羧甲基纤维素微球，将固化的壳聚糖-羧甲基纤维素微球用石油醚离心洗涤3次，用无水乙醇抽洗4-5次，真空冻干得到壳聚糖-羧甲基纤维素微球，其中羧甲基纤维素含量为18.3%，
⑧取2g冻干的壳聚糖-羧甲基纤维素微球加入100ml浓度为3.5mg/ml的木瓜蛋白酶溶液中，震荡吸附4h，
⑨加入质量百分浓度为1-2.5%的戊二醛溶液交联1h，再用浓度为1.5mg/ml的甘氨酸溶液洗去多余的戊二醛溶液，干燥后得到壳聚糖-羧甲基纤维素微球固定化木瓜蛋白酶，该固定化酶的酶活力达36.36U/g。
实施例9
①将壳聚糖粉末溶于醋酸溶液制成浓度为1mg/ml壳聚糖醋酸溶液，
②将羧甲基纤维素中经乙醇润湿后，加入纯化水溶解制成浓度为1mg/ml的羧甲基纤维素溶液，
③取25ml羧甲基纤维素溶液缓慢加入100ml壳聚糖醋酸溶液中，搅拌均匀，形成混合溶液，
④将木瓜蛋白酶溶解于pH为5.5的磷酸缓冲溶液制成浓度为3.5g/ml的木瓜蛋白酶溶液，
⑤液体石蜡和石油醚按重量比1:3混合，在液体石蜡和石油醚的混合液中加入司盘60形成油相预混液，乳化剂在油相预混液中的质量百分比为2%，
⑥在搅拌条件下，将壳聚糖醋酸溶液和羧甲基纤维素溶液的混合溶液通过多孔膜压入油相预混液中，重复步骤⑥1h，
⑦冰浴0-5℃并继续搅拌，得到固化的壳聚糖-羧甲基纤维素微球，将固化的壳聚糖-羧甲基纤维素微球用石油醚离心洗涤3次，用无水乙醇抽洗4-5次，真空冻干得到壳聚糖-羧甲基纤维素微球，其中羧甲基纤维素含量为18.5%，
⑧取1.5g冻干的壳聚糖-羧甲基纤维素微球加入100ml浓度为3.5mg/ml的木瓜蛋白酶溶液中，震荡吸附4h，
⑨加入质量百分浓度为1-2.5%的戊二醛溶液交联1h，再用浓度为1.5mg/ml的甘氨酸溶液洗去多余的戊二醛溶液，干燥后得到壳聚糖-羧甲基纤维素微球固定化木瓜蛋白酶，该固定化酶的酶活力达34.52U/g。
实施例10
①将壳聚糖粉末溶于醋酸溶液制成浓度为1mg/ml壳聚糖醋酸溶液，
②将羧甲基纤维素中经乙醇润湿后，加入纯化水溶解制成浓度为1mg/ml的羧甲基纤维素溶液，
③取25ml羧甲基纤维素溶液缓慢加入100ml壳聚糖醋酸溶液中，搅拌均匀，形成混合溶液，
④将木瓜蛋白酶溶解于pH为5.5的磷酸缓冲溶液制成浓度为3.5g/ml的木瓜蛋白酶溶液，
⑤液体石蜡和石油醚按重量比1:3混合，在液体石蜡和石油醚的混合液中加入司盘60形成油相预混液，乳化剂在油相预混液中的质量百分比为2%，
⑥在搅拌条件下，将壳聚糖醋酸溶液和羧甲基纤维素溶液的混合溶液通过多孔膜压入油相预混液中，重复步骤⑥1h，
⑦冰浴0-5℃并继续搅拌，得到固化的壳聚糖-羧甲基纤维素微球，将固化的壳聚糖-羧甲基纤维素微球用石油醚离心洗涤3次，用无水乙醇抽洗4-5次，真空冻干得到壳聚糖-羧甲基纤维素微球，其中羧甲基纤维素含量为18.3%，
⑧取1.7g冻干的壳聚糖-羧甲基纤维素微球加入100ml浓度为3.5mg/ml的木瓜蛋白酶溶液中，震荡吸附4h，
⑨加入质量百分浓度为1-2.5%的戊二醛溶液交联1h，再用浓度为1.5mg/ml的甘氨酸溶液洗去多余的戊二醛溶液，干燥后得到壳聚糖-羧甲基纤维素微球固定化木瓜蛋白酶，该固定化酶的酶活力达36.43U/g。
上述实施例7-10中，壳聚糖-羧甲基纤维素微球与木瓜蛋白酶的质量不同，同时也影响该固定化酶的酶活力。
本发明不局限于上述具体实施方式，本领域一般技术人员根据本发明公开的内容，可以采用其他多种具体实施方式实施本发明的，或者凡是采用本发明的设计结构和思路，做简单变化或更改的，都落入本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种壳聚糖-羧甲基纤维素固定化酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：①将壳聚糖粉末溶于醋酸溶液制成浓度为1～4mg/ml壳聚糖醋酸溶液，②将羧甲基纤维素中经乙醇润湿后，加入纯化水溶解制成浓度为1～2mg/ml的羧甲基纤维素溶液，③将羧甲基纤维素溶液壳聚和糖醋酸溶液混合均匀，形成混合溶液，④将木瓜蛋白酶溶解于pH为5.5的磷酸缓冲溶液制成浓度为3.5mg/ml的木瓜蛋白酶溶液，⑤液体石蜡和石油醚按重量比1:3混合，在液体石蜡和石油醚的混合液中加入乳化剂形成油相预混液，乳化剂在油相预混液中的质量百分比为2-3%，⑥在搅拌条件下，将壳聚糖醋酸溶液和羧甲基纤维素溶液的混合溶液通过多孔膜压入油相预混液中，重复步骤⑥1h，⑦冰浴0-5℃并继续搅拌，得到固化的壳聚糖-羧甲基纤维素微球，将固化的壳聚糖-羧甲基纤维素微球用石油醚离心洗涤3次，用无水乙醇抽洗4-5次，真空冻干得到壳聚糖-羧甲基纤维素微球，其中，羧甲基纤维素在壳聚糖-羧甲基纤维素微球中的质量百分比为11-20%，⑧将冻干的壳聚糖-羧甲基纤维素微球加入浓度为3.5mg/ml的木瓜蛋白酶溶液中，震荡吸附4h，⑨加入质量百分浓度为1-2.5%的戊二醛溶液交联1h，再用浓度为1.5mg/ml的甘氨酸溶液洗去多余的戊二醛溶液，干燥后得到壳聚糖-羧甲基纤维素微球固定化木瓜蛋白酶。
2.根据权利要求1所述的壳聚糖-羧甲基纤维素固定化酶的制备方法，其特征在于：所述乳化剂为司盘60、司盘40或司盘20。
3.根据权利要求1所述的壳聚糖-羧甲基纤维素固定化酶的制备方法，其特征在于：所述步骤⑧中，壳聚糖-羧甲基纤维素微球与木瓜蛋白酶的重量比为1000：1.16-1000:2.05。
4.根据权利要求1所述的壳聚糖-羧甲基纤维素固定化酶的制备方法，其特征在于：壳聚糖醋酸溶液和羧甲基纤维素溶液的混合溶液和油相预混液的体积比为1:2000-3000。
5.一种壳聚糖-羧甲基纤维素固定化酶，其特征在于：采用如权利要求1-4任意一项所述的壳聚糖-羧甲基纤维素固定化酶的制备方法制得。
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