JPS6017512B2 - 不溶性酵素の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は不溶性酵素の製造法に関する。

更に詳しくは、酵素を水不綾性高分子物質で包括するこ
とからなる不溶性酵素の製造法に関する。今日、酵素は
食品工業、医薬品工業などの幅広い分野で利用されてお
り、その重要性が増々認識されつつある。

しかしながら従来の酵素の利用形態は酵素を水に溶解し
て反応を行なわしめる場合を常とし、反応終了後は反応
液からの酵素の回収が容易でないため一度使用された酵
素は廃棄せられており、このため酵素反応の工程は回分
式にならざるを得ず、酵素の利用効率は極めて低いとい
う欠点があった。そこで近年酵素を活性を維持したまま
で水不溶性にして反復あるいは連続使用が可能な、いわ
ゆる固体触媒として反応に供しようとする不溶性酵素の
製造研究が盛んに行なわれるようになった。従釆、不溶
性酵素の製造法としては、有機あるいは無機の水不溶性
物質に酵素を共有結合、イオン結合、あるいは吸着等に
より担持させて不溶化する方法、二官能性試薬等で酵素
蛋白どうしを共有結合し巨大分子化して不溶化する方法
、酵素を水不溶性高分子物質で包括してみかけ上酵素を
不熔化する方法（以下この方法を包括法と略記する。

）などに大別される各種各様の製造法が報告されている
。包括法に関しては例えばアクリルアミド、ビニルピロ
リドソ、ハイドオキシエチルアクリレート、アクリル酸
塩等の水溶性単量体、ポリビニルァルコール、ポリアリ
ルアミド等の水溶性高分子物質、Ｎ・Ｎ′ーメチレンビ
スアクリルァミド等の水溶性架橋剤などを酵素とともに
水に溶解せしめたのちこれを過流酸カリ等の重合触媒あ
るいはｙ線等の放射線で重合を起こさせると同時に架橋
構造を与え生成した水不溶性高分子ゲル中に酵素を包括
する方法とか、水不落・性単量体あるいは水不熔性高分
子物質が溶解している有機溶媒中に酵素水溶液を微小な
水滴として分散せしめたのち、酵素が水に溶解している
状態で重合を行なわしめたり、あるいは水不溶性高分子
物質を溶解している有機溶媒を除去したりして、酵素が
溶解している微小な水滴を水不落・性高分子物質で包括
する方法などが知られている。しかしながら、これら公
知の方法は次のような欠点を有するものである。

即ち、酵素を高分子ゲル中に包括する方法においては包
括に使用される単量体あるいは高分子物質がいずれも水
溶性のものに限られており、工業的に広く利用されてい
る水不瀞性の単量体あるいは高分子物質などはこの方法
では使用できない欠点をもつ。更に、この方法は触媒あ
るいは放射線で重合反応あるいは舞新海反応を起こすこ
とにより、最終的には水溶性の単量体あるいは高分子物
質を水不縄性高分子物質に変換する方法であるため、重
合あるいは架橋反応の制御が容易でなく、しかも重合熱
による酵素の失活あるいは放射線照射による酵素の損傷
などが起こりがちであり、このため活性を安定に維持し
た状態で酵素が包括されにくい欠点もあわせて有する。
一方、酵素水溶液を有機溶媒中に分散して有機溶媒中で
包括する方法においては、水不瀞性の単量体あるいは高
分子物質を使用しているものの、酵素は常に水に溶解し
た状態で微小な水滴として有機溶媒中に分散しているた
め有機溶媒による失活の危険にさらされており、このた
め活性を安定に維持したままで酵素を包括するというこ
とを簸かしくするという欠点を有する。そこで本発明者
らは、これら従来法が持つ欠点は酵素が水溶液であり、
有機溶媒中では失活しやすいという酵素の特性に起因し
ているとの認識のもとに酵素を有機溶媒中で活性を安定
に維持した状態で存在せしめ、広く工業的に利用されて
いる水不癖性高分子物質で酵素を包括する方法に関して
更に鋭意研究した結果、酵素を一旦氷塊の内部に包含せ
しめることにより、酵素活性を安定に維持したまま有機
溶媒中で酵素を水不溶性高分子物質で好都合に包括でき
ることを見いだし本発明に至った。

即ち本発明は、酵素を含有する氷塊を水不落‘性高分子
物質を溶解した有機溶媒中に分散させついで有機溶媒を
除去することにより該氷塊を水不熔性高分子物質で包括
せしめることを特徴とする不溶性酵素の製造法である。

本発明で使用される酵素は動植物組織から得られたもの
でも、あるいは微生物が産生したものでもその給源を問
わず使用できる。また酵素は精製されたものでも未精製
のもの、例えば酵素含有組織のホモジネートや微生物細
胞のようなものでも差しつかえない。本発明で使用され
る酵素は特に制限されないが、例えばアルコールデヒド
ロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、カタラーゼなど
の酸化還元酵素、アスパラギン酸トランスカルバミラー
ゼ、ヘキソキナーゼ、リボヌクレアーゼなどの転移酵素
、Ｑーアミラーゼ、８−アミラ−ゼ、グルコアミラーゼ
、８−ガラクトシダーゼ、インベルターゼ、リバーゼ、
ウレアーゼ、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、
アミノアシラーゼなどの加水分解酵素、アスパラギン酸
テカルボキシラーゼ、アルドラ−ゼ、クエン酸リアーゼ
などの脱離酵素、グルコースィソメラーゼ、グルタミン
酸ラセマーゼなどの異性化酵素、アスパラギン酸シンセ
ターゼ、グルタチオンシンセターゼなどの合成酵素など
が例示される。本発明で使用される酵素を含有する氷魂
とは、上記の酵素を含有する水溶液を０℃以下で凍結し
、氷塊の内部に酵素を包含せしめたものである。

この氷塊は酵素を含有する水溶液を深冷された雰囲気中
に分散せしめると同時に急速凍結を行ない調製すること
ができる。深冷された雰囲気としては冷却されたガスあ
るいは液のいずれでもよいが、好ましくは液状の冷却媒
体を用いるのがよい。液状の冷却媒体としては凝固点が
０℃以下の有機化合物あるいは無機化合物の中から選ば
れ、例えばメタノール、エタノール、アセトン、酢酸エ
チル、二塩化メチレン、クロロホルム、四塩化炭素、エ
チルエーテル、テトラヒド。フラン、トルェン、ｎ−へ
キサン、石油エーテルなどの有機溶媒又は液体窒素、液
体酸素に代表される無機化合物などであり、これらの媒
体を冷却するにはドライアイス等で直接あるいは冷凍機
などで間接的に０℃以下に冷却されて液状冷却媒体とし
て供される。また蒸発熱を利用して冷却することもでき
る。酵素含有する水溶液を液状冷却媒体を用いて凍結す
るに際しては、酵素を含有する水溶液を容器等に入れて
間接的に凍結してもよく、又液状冷却媒体中で直接凍結
させてもよい。冷却媒体中で直接凍結する場合において
は、酵素の冷却媒体による失活を極力抑えるために、冷
却媒体の温度をできるだけ低温し、更に水溶液を噴霧器
などを用いて微小水滴化して急速凍結することが望まし
い。ひとたび氷塊の内部に包含された酵素は氷が融解す
る温度以下ならば各種の有機溶媒中に放置されても活性
が安定に維持されている。本発明で使用される水不溶性
高分子物質とは、有機溶媒に溶解し水に不溶な高分子量
の重合体であり、０℃以下の有機溶媒にわずかでも溶解
するものならばすべて本発明に使用できるが、好ましく
は０℃以下の有機溶媒に０．１重量％以上溶解する水不
潟性高分子物質が適当である。

ここで水不溶性高分子物質が有機溶媒に熔解するとは水
不溶性高分子物質が有機溶媒と相分離を起こさない濃度
で有機溶媒と均一に混合していることである。本発明で
使用される代表的な水不溶性高分子物質としてはポリア
クリロニトリル、ポリアクリル酸ヱステル、ポリメタク
リル酸ェステル、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、ポリ
カーボネート、ポリ塩化ビニルなどのホモポリマーまた
はこれらホモポリマーを構成する単量体を成分とするよ
うなコポリマー、あるいは酢酸セルロース、エチルセル
ロースのようなセルロース誘導体などであるが、もちろ
んこれだけに限定されるものではなし・。これらの水不
溶性高分子物質を０℃以下で０．１重量％以上熔解する
有機溶媒は０℃以下で液体で存在するもののなかから選
ばれ、例えばメタノール、エタノール、プロパノール、
アセトン、メチルエチルケトン、酢酸エチル、二塩化メ
チレン、クロロホルム、四塩化炭素、エチルエーブル、
トルェン、キシレン、ｎーヘキサン、石油エーテル、テ
トラヒドロフラン、シクロヘキセン、Ｎ・Ｎ′−ジメチ
ルホルムアミド、アセトニトリルなどがよく使用される
が、もちろんこれらに限定されるものではない。水不綾
性高分子物質はこれらの有機溶媒に溶解せしめられたの
ち、０℃以下に冷却されて使用される。また有機溶媒を
除去して酵素を含有する氷魂を水不溶性高分子物質で包
括するとは、氷塊を水不溶性高分子物質を溶解した０℃
以下の有機溶媒中に懸濁状態で分散せしめたのち、水不
綾性高分子物質を溶解している有機溶媒を除去すること
により氷塊の周囲に水不潟性高分子物質を析出させて氷
塊を水不熔性高分子物質で包み込むことである。

酵素を含有する氷塊を水不溶性高分子物質を溶解した有
機溶媒中に分散せしめるにあたっては、水不溶性高分子
物質を有機溶媒に溶解せしめたのち、この有機溶媒と別
途調製した氷塊とを混合して急速鷹梓などにり懸濁状態
に分散せしめてもよく、また冷却下の水不落・性高分子
物質を溶解した有機溶媒中に酵素を含有する水溶液を微
小水滴として直接分散させて急速凍結し酵素を含有する
氷塊を生成させてもよい。氷塊を有機溶媒に分散させる
ためには、機械的に急速縄梓を行なう他に、氷塊の粒径
が小さい程効果的であるため、氷塊の大きさとして直径
が１肋以下のものを使用することが好ましい。水不綾性
高分子物質を溶解している有機溶媒を除去して氷塊を水
不溶性高分子物質で包括するには、減圧下で蒸発させて
排気してもよく、あるいは水不溶性高分子物質の非溶媒
中に浸債することにより水不溶性高分子物質を凝固させ
て固形物を分離するなどの方法によってもよい。ここで
水不溶性高分子物質の非溶媒とは、水不溶性高分子物質
を溶解せず０℃以下で液状の溶媒であり水不落性高分子
物質を溶解する有機溶媒と混和するものから選ばれ、例
えば三酢酸セルロースの溶媒として二塩化メチレンを用
いたときは非溶媒としてトルェンが使用される如くであ
る。酵素は氷魂の内部に包含せられている間は有機溶媒
が共存していても活性が安定に維持されているが、氷が
融解すると有機溶媒による酵素の失活が起こる危険性が
あるため、有機溶媒が氷魂と共存している間は氷が融解
する温度以下で水不溶性高分子物質による氷塊の包括を
行なう事が好ましい。更に又、氷塊を包括した水不落・
性高分子物質中に非溶媒等の有機溶媒が残存している場
合は減圧下で蒸発させて除去する事が好ましい。本発明
の水不溶性高分子物質で包括された酵素を含有する氷塊
は、氷塊の周囲が水不綾性高分子物質で被覆されている
ため、氷塊が融解しても酵素は水不漆性高分子物質で包
括されており、すでにこの段階で酵素はみかけ上不落化
されたことになるが、更にこのものを凍結乾燥を行なう
ことにより多孔性の多表面積を有する不溶性酵素を得る
こともできる。

こに氷塊を包括した水不漆性高分子物質を凍結乾燥する
とは氷を昇華して除去ることであり、このために真空凍
結乾燥菱贋が使用される。本発明は、酵素を一旦氷塊の
内部に包括せしめて有機溶媒による酵素の失活を防止す
ることにより有機溶媒中で酵素を水不溶座高分子物質で
包括するという全く新規な不溶性酵素の製造法を提供す
るものである。

従来法が酵素を有機溶媒中に安定に存在せしめた状態で
酵素の包括を行なっているため、既に述べたような種々
の欠点が生じるのに対し、本発明によればこれら従来の
欠点は解決され、現在工業的に汎用されている各種の水
不溶性高分子物質の使用が可能になり、酵素活性が安定
に維持された不溶Ｉ性酵素が容易に製造できる利点を有
する。更に本発明によって製造された不熔性酵素はビー
ズ状、粉末状、繊維状、棒状、フィルム状等に成型され
た状態で得ることができ、酵素の特異性に着目した各種
の有用化学物質の生産工程の触媒として、あるいは分析
手段として広く利用される可能性があり、本発明はその
意味でも有意義である。以下実施例により具体的に説明
するが、これに限定されるものではない。

実施例 １ 糸状菌グルコアミラーゼ（長瀬産業社製）２０夕をイオ
ン交換水５０の‘に懸濁したのち不落物を炉紙で炉別し
、蛋白含量４５の９′の‘の炉液を調製した。

この炉液を薄層クロマトグラフィー用スプレーを用た粉
霧状の水滴にしてドライアイスで冷却された−８０ｏｏ
アセトン中へ吹き込み急速凍結を行なってグルコアミラ
ーゼを含有する微小な氷塊を生成せしめた。この氷魂を
ブフナーロートで手早く吸引炉別し、約３夕を３．の重
量％のトリアセテート（三菱アセテート社製）を溶解し
た５℃の二塩化メチレン２００叫中に急速燈梓により分
散させたのち、一２５ｑＣに冷却されたトルェン２００
机に加えトルアセテートを凝固させた。凝固したトリア
セテートを一８０午○のメタノール１５０柵で２回洗総
したのち一昼夜真空凍結乾燥を行なった。この乾燥物を
粉砕したのち、粉砕物１．０夕をＭ／１項酢酸緩衝液（
ｐＨ４．５）１００の上で３回洗練し、これを１．の重
量％のマルトースを含有するＭ／２０酢酸緩衝液（ｐＨ
４．５）１００の‘に加え、４０午０で振渇しながらマ
ルトースの加水分解反応を行なった。

反応液に含まれるグルコースをグルコスタット試薬（藤
沢メディカルサプライ社発売品）で定量したころ１時間
の反応で３８０倣のグルコースが生成しており、包括前
のグルコアミラーゼに対する比活性を求めたところ１９
．８％の活性を示した。実施例 ２糸状菌グルコアミラ
ーゼを２９の９／泌含有する水溶液をドライアイスで冷
却された−８０℃の二塩化メチレン中で実施例１と同機
に急速凍結を行ないグルコアミラーゼを含有する微小な
氷塊を生成せしめた。

この氷塊の約１．０夕を４．１重量％のトリアセテート
を溶解した−３℃の二塩化メチレン１００の‘中に急速
蝿拝により分散させながら一８０００のアセトン格で−
５０ｑｏ付近迄冷却したのち、減圧下で二塩化メチレン
を蒸発させひきつづいて真空凍結乾燥を一昼夜行なった
。この乾燥物を粉砕したのち実施例１と同様にして酸素
活性を測定したところ、包括前のグルコアミラーゼに対
して１７．２％の比活性を示した。

実施例 ３糸状菌グルコアミラーゼを３物９／肌を含有
する水溶液をドライアイスで冷却された一８０午○のｎ
−へキサン中で実施例１と同様に急速凍結を行ないグル
コアミラーゼを含有する微小な氷塊を生成せしめた。

この氷塊の約１．０夕を２．５重量％のポリメタクリル
酸メチルを溶解した−１０午０の二塩化メチレン５０の
‘に分散させたのち、一３０午０に冷却されたｎ−へキ
サン２００泌を加えポリメタクリル酸メチルを凝固させ
た。容器の底に凝固した粘着性のなるポリマーをかきと
り、真空凍結乾燥を一昼夜行なった。この乾燥物を粉砕
後、実施例１と同様にして酵素活性を測定したところ、
包括前のグルコアミラーゼに対して１３．８％の比潜性
を示した。

実施例 ４実施例３と同様にして調製したグルコアミラ
ーゼを含有する微小な氷塊約１．０夕を２．５重量％の
ポリカーボネート（三菱化成社製）を熔解した一１３℃
の二塩化メチレン５０叫に分散させたのち、一５０℃に
冷却されたエタノール２００の‘を加えポリカーボネー
トを凝固させた。

凝固したポリカーボネートを一昼夜真空凍結乾燥をした
。この乾燥物を粉砕後、実施例１と同様にして酵素活性
を測定したところ、包括前のグルコアミラーゼに対して
１５．７％の比活性を示した。

実施例 ５実施例３と同様にして調製したグルコアミラ
−ゼを含有する微小な氷塊約１．０夕を２．５重量％の
アクリルニトリルとスチレンの共重合物（重量比アクリ
ロニトリルノスチレン＝２９ノ７１）を溶解した−１０
００のＮ・Ｎ′−ジメチルホルムアミド５０の【中に分
散させたのち、シャーレ内に薄膜状に塗布した。

このシャーレを−５び○付近迄冷却したのち、シャーレ
内に−５０ｑｏに冷却されたメタノールを流し込みアク
リロニトリルとスチレンの共重合物を凝固させた。凝固
した膜状の共重合物を取り出し一昼夜凍結乾燥した。こ
の乾燥物を切断後、実施例１と同様にして酵素活性を測
定したところ、包括前のグルコアミラーゼに対して１４
．２％の比活性を示した。

実施例 ６アクリロニトリルと酢酸ビニルの共重合物（
重量比 ァクリロニトリルノ酢酸ビニル＝９３／３）を
用い実施例５を同様な操作を行ない、グルコアミラーゼ
を包括したアクリロニトリルと酢酸ビニルの共重合物を
得た。

この共重合物の酵素活性を測定したところ、包括前のグ
ルコアミラーゼに対して１３．２％の比活性を示した。
実施例 ７ ィンベルターゼ（東京化成社製）を１３の２／の【舎有
するイオン交換水を−８０つ０の二塩化メチレン中で実
施例１と同様に急速凍結を行ない、ィンベルターゼを含
有する微４・な氷塊を生成せしめた。

この氷塊の約１．０夕を４．５重量％のエチルセルロー
ス（石津製薬社製）を溶解した−５℃の二塩化メチレン
１００地中に急速蝿拝により分散させながら８５℃のア
セトン俗で−５０℃付近迄冷却したのち、減圧下で二塩
化メチレンを蒸発させ、ひきつづいて真空凍結乾燥を一
昼夜行なった。この乾燥物を粉砕したのち、粉砕物１．
０夕をＭ／１０リン酸緩衝液（ｐＨ５．６）１００奴で
３回洗糠し、これを１．０重量％の庶糖を含有するＭ／
２０リン酸緩衝液（ｐＨ５．６）１００肌に加え、４０
ｑｏで振渇しながら庶糖の加水分解反応を行なった。

反応液に含まれるグルコースをグルコスタツト試薬で定
量したところ１時間の反応で８５．１のｐのグルコース
が生成したおり、包括前のィンベルターゼに対して１６
．２％の比活‘性を示した。実施例 ８ 糸状菌グルコアミラーゼ３物９／泌を含有する水溶液を
ドライアイスで冷却された一８０ｑ○のｎーヘキサン中
で実施例１と同機に急速凍結を行ないグルコアミラーゼ
を含有する微小な氷塊を生成せしめた。

この氷塊の約５０夕を約１．肌ｔ％のトリァセテートを
溶解した−２０ｏｏの二塩化メチレン５００地中に急速
蝿拝により分散させたのち、これを一５０℃に冷却され
たトルェン浴中に液滴として落下させることにより粒状
のトリアセテート凝固物を得た。この凝固物に含浸され
ている有機溶媒を減圧下で蒸発除去し、ひきつづいて一
昼夜凍結乾燥を行ないグルコアミラーゼを包括した粒状
トリアセテート乾燥物を得た。この乾燥物１．０２を洗
総後５．肌ｔ％マルトースを含有したＭ／雌作酸緩衝液
（ｐＨ４．５）１５０の‘に加え、４０℃で１時間マル
トースの加水分解反応を行なったころ、１時間の反応で
３２９０の９のグルコースが生成し、包括前のグルコア
ミラーゼに対する比活性を求めたところ１８．０％の活
性を示した。

実施例 ９実施例８と同様にして調製した凝固物に含浸
されているトルェンを石油エーテルで抽出除去したのち
、減圧下で約５時間石油エーテルを蒸発除去して、氷塊
を包括したトリアセテート凝固物を得た。

これを約５℃の室温中に放置して氷塊を融解させて酵素
含有微小水滴を包括した粒状トリアセテート凝固物を得
た。この１．０夕（乾燥重量０．１２夕）の活性を実施
例８と同様にして測定したところ１時間の反応で９５３
の‘のグルコースを生成し、包括前のグルコアミラーゼ
に対する比活‘性を求めたころ３１．９％の活性を示し
た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 酵素を含有する氷塊を水溶性高分子物質を溶解した
   有機溶媒中に分散させ、ついで有機溶媒を除去すること
   により該氷塊を水不溶性高分子物質で包括せしめること
   を特徴とする不溶性酵素の製造法。 ２ 水不溶性高分子物質を溶解している有機溶媒を減圧
   下で除去することを特徴とする特許請求の範囲第１項記
   載の不溶性酵素の製造法。 ３ 水不溶性高分子物質を溶解している有機溶媒を該水
   不溶性高分子物質の非溶媒で除去することを特徴とする
   特許請求の範囲第１項記載の不溶性酵素の製造法。 ４ 酵素を含有する氷塊が、酵素を含有する水溶液を冷
   却媒体中で凍結させて生成されたものであることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項、第２項又は第３項記載の
   不溶性酵素の製造法。 ５ 冷却媒体が凝固点が０℃以下の液状物であることを
   特徴とする特許請求の範囲第４項記載の不溶性酵素の製
   造法。 ６ 酵素を含有する氷塊が直径１ｍｍ以下のものである
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項、第２項、第３
   項、第４項又は第５項記載の不溶性酵素の製造法。 ７ 有機溶媒が０℃以下の温度において０．１重量％以
   上の水不溶性高分子物質を溶解するものであることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項、第２項、第３項、第４
   項、第５項又は第６項の不溶性酵素の製造法。 ８ 水不溶性高分子物質が酢酸セルロース、エチルセル
   ロースであることを特徴とする特許請求の範囲第７項記
   載の不溶性酵素の製造法。 ９ 水不溶性高分子物質がポリアクリロニトリル、ポリ
   アクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、ポリ
   スチレン、ポリ酢酸ビニル、ポリカーボネート、ポリ塩
   化ビニルであるか、又はこれらホモポリマーを構成する
   単量体と成分とするようなコポリマーであることを特徴
   とする特許請求の範囲第７項記載の不溶性酵素の製造法
   。