JPS6134795B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化された酵素又は微生物の製造法
に関する。更に詳しくは、酵素又は生きた微生物
を水不溶性高分子物質で包括することからなる固
定化された酵素又は微生物の製造法に関する。

今日、酵素や微生物は食品工業，医薬品工業な
どの幅広い分野で利用されており、その重要性が
増々認識されつつある。しかしながら従来の利用
形態は酵素は水に溶解し、微生物は水に懸濁して
反応を行なわしめる場合を常とし、反応終了後は
反応液からこれの回収が容易でないため一度使用
したのち廃棄している。このため酵素や微生物を
用いる反応の工程は回分式にならざかるを得ず、
これらの利用効率は極めて低いという欠点があつ
た。そこで近年酵素を活性を維持したままで水不
溶性にするとか、微生物を生きたままで回収が容
易な大きさに成型するとかして反復あるいは連続
反応に供しようとする固定化酵素や固定化微生物
の研究が盛んに行なわれるようになつた。

従来、酵素や微生物を水不溶性高分子物質で包
括して固定化する方法として、水溶性単量体ある
いは水溶性高分子物質と水溶性架橋剤を酵素ある
いは微生物とともに水に溶解せしめたのちこれを
過硫酸カリ等の重合触媒あるいはγ線等の放射線
で重合を起こさせると同時に架橋構造を与え生成
した水不溶性高分子ゲル中に酵素や微生物を包括
する方法とか、水不溶性単量体あるいは水不溶性
高分子物質が溶解している有機溶媒中に酵素や微
生物を含有する水溶液を微小な水滴として分散せ
しめたのち重合を行なわしめたり、あるいは水不
溶性高分子物質を溶解している有機溶媒を除去し
たりしてこの水滴を水不溶性高分子物質で包括す
る方法などが知られている。

しかしながら、これら従来の方法は次のような
欠点を有するものである。即ち、酵素や微生物は
一般に水中においては比較的安定であるが有機溶
媒中では不安定であり、従来の方法では包括材料
としては水溶性のものが多い。水溶性の材料を用
いる場合には、重合や架橋などによつて水溶性の
材料を不溶性にする操作が必要であり、それらの
操作によつて酵素や微生物の変質は免れない。ま
た包括材料として水不溶性高分子物質を用いよう
とすると、これらを溶解するために有機溶媒を用
いる必要があり、有機溶媒により酵素が失活した
り微生物が死滅したりする場合が多い。

本発明者らは、これら従来の方法がもつ欠点を
解決すべく研究し、有機溶媒中で酵素や微生物を
水不溶生高分子物質で安定に包括する方法に関し
いくつかの提案を行なつている。（出願番号 昭
53―9176，昭54―42725）本発明者らは、この方
法に関し、更に一層の研究をした結果、固体構造
物の表面を酵素又は微生物を包括した水不溶性高
分子物質で被覆することにより機械的強度が優
れ、しかも固体構造物の形状に合わせた各種の成
型された薄膜状の固定化酵素又は固定化微生物が
容易に製造できることを見い出し本発明に至つ
た。

即ち、本発明は酵素又は微生物を含有した氷塊
と水不溶性高分子物質を溶解した有機溶媒との混
合物で固体構造物を被覆したのち有機溶媒を除去
することを特徴とする固定化された酵素又は微生
物の製造法である。

本発明で使用される酵素は動植物組織から得ら
れたものでも、あるいは微生物が産生したもので
もその給源を問わず使用できる。また酵素は精製
されたものでも未精製のもの、例えば酵素含有組
織のホモジネートや微生物細胞のようなものでも
差しつかえない。本発明で使用される酵素は特に
制限されないが、例えば特願昭53―9176号に記載
された各種酵素が全て使用されうる。

又、本発明で使用される微生物はカビ，酵母，
細菌，放射菌，不完全菌に分類される微生物であ
り、その種類は特に制限されないが、例えば特願
昭54―42725号に記載された各種の微生物が全て
使用されうる。

これらの微生物は栄養培地で生育せしめられた
のち生きた状態で使用される。ここに生きた状態
とは微生物が自己再生能力を有することであり、
微生物の生育に適する環境下で培養することによ
り確認することができる。

本発明で使用される酵素又は微生物を含有する
氷塊は、上記の酵素や微生物を含有する水溶液を
０℃以下で凍結し、氷塊の内部にこれらを包含せ
しめたものである。この氷塊は酵素や微生物を含
有する水溶液を深冷された雰囲気中に分散せしめ
ると同時に急速凍結を行ない調節することができ
る。深冷された雰囲気としては冷却されたガスで
あるいは液のいずれでもよいが、好ましくは液状
の冷却媒体を用いるのがよい。液状の冷却媒体と
しては凝固点が０℃以下の液状物、例えばメタノ
ール，エタノール，アセトン，酢酸エチル，二塩
化メチレン，クロロホルム，四塩化炭素，エチル
エーテル，テトラヒドロフラン，トルエン，ｎ―
ヘキサン，石油エーテル，液体窒素，液体酸素な
どであり、これらを冷却するには蒸発熱を利用し
たり、ドライアイス等を投入して直接冷却する
か、又は冷凍機などにより間接に冷却する方法な
どがとられる。

酵素又は微生物を含有する水溶液を液状冷却媒
体を用いて凍結するに際しては、これらを含有す
る水溶液を容器等に入れて間接的に凍結してもよ
く、又液状冷却媒体中で直接凍結させてもよい。
冷却媒体中で直接凍結する場合においては、酵素
の失活あるいは微生物の死滅を極力抑えるため
に、冷却媒体の温度をできるだけ低温にし、更に
水溶液を噴霧器などを用いて微小水滴化して急速
凍結することが望ましい。

又、本発明で使用される氷塊は、酵素や微生物
以外に次の物質を共含したものでもよい。例え
ば、ポリビニルアルコール，ポリエチレングリコ
ール，タンパク質，核酸，多糖等の水溶性高分子
物質，グリセリン等の多価アルコール類、ジメチ
ルスルホオキサイド等の極性有機溶媒、シヨ糖，
乳糖などの少糖類、グルタミン酸，アスパラギン
酸等のアミノ酸類、α―ケトグルタール酸，リン
ゴ酸等の有機物、マグネシウム，マンガン，コバ
ルト，カルシウム等の金属塩類、粉末活性炭，珪
藻土，ラテツクス等の微小な固形物が挙げられ
る。その他特に酵素の場合は該酵素の基質，反応
生成物，補酵素なども共含してもよい。これらの
物質は主に固定化操作中における酵素や微生物の
保護、あるいは固定化後の製品の物性改良を目的
として使用されるのであり、酵素や微生物を含有
する水溶液に加えられたのち、急速凍結されて氷
塊中に共含せしめられる。

本発明で使用される水不溶性高分子物質とは有
機溶媒に溶解し水に不溶な高分子量の重合体であ
り、０℃以下の有機溶媒にわずかでも溶解するも
のならばすべて本発明に使用できるが、好ましく
は０℃以下の有機溶媒に0.1重量％以上溶解する
水不溶性高分子物質が適当である。ここで水不溶
性高分子物質が有機溶媒に溶解するとは水不溶性
高分子物質が有機溶媒と相分離を起こさない濃度
で有機溶媒と均一に混合していることである。

本発明で使用される代表的な水不溶性高分子物
質としてはポリアクリロニトリル，ポリアクリル
酸エステル，ポリメタクリル酸エステル，ポリス
チレン，ポリ酢酸ビニル，ポリ塩化ビニル，ポリ
カーボネートなどのホモポリマーまたはこれらホ
モポリマーを構成する単量体を成分とするような
コポリマー、あるいは酢酸セルロース，エチルセ
ルロースのようなセルロース誘導体などがある
が、もちろんこれだけに限定されるものではな
い。これらの水不溶性高分子物質を０℃以下で
0.1重量％以上溶解する有機溶媒は０℃以下で液
体で存在するもののなかから選ばれ、例えばメタ
ノール，エタノール，プロパノール，アセトン，
メチルエチルケトン，酢酸エチル，二塩化メチレ
ン，クロロホルム，四塩化炭素，エチルエーテ
ル，トルエン，キシレン，ｎ―ヘキサン，石油エ
ーテル，テトラヒドロフラン，シクロヘキセン，
Ｎ，N′―ジメチルホルムアミド，γ―ブチロチ
クトン，アセトニトリルなどが好ましくは使用さ
れるが、もちろんこれらに限定されるものではな
い。水不溶性高分子物質はこれらの有機溶媒に溶
解せしめられたのち、０℃以下に冷却されて使用
される。

酵素又は微生物を含有した氷解と水不溶性高分
子物質を溶解した有機溶媒との混合物とは、氷塊
を水不溶性高分子物質を溶解した０℃以下の有機
溶媒中に懸濁状態で分散せしめたものである。分
散せしめるにあたつては水不溶性高分子物質を溶
解した有機溶媒に別途調製した氷塊も加えて急速
撹拌などにより懸濁状に分散せしめてもよく、ま
た冷却下の水不溶性高分子物質を溶解した有機溶
媒中に酵素又は微生物を含有する水溶液を微小水
滴として直接分散させて急速凍結しこれらを含有
する氷塊を生成させてもよい。

氷塊を有機溶媒に均一に分散させるためには氷
塊の粒径が小さい程効果的であり氷塊の大きさと
して直径が１mm以下のものを使用することが好ま
しい。又、一旦分散された氷塊を有機溶媒中で安
定に維持するためには、氷塊分散時に氷塊ととも
に該水不溶性高分子物質の非溶媒を適当量加えて
もよい。特に氷塊の比重と水不溶性高分子物質を
溶解した有機溶媒との比重が異なる場合は、一旦
分散された氷塊は撹拌を停止すると有機溶媒と分
離してしまう。このような場合には非溶媒を加え
ることにより氷塊を有機溶媒中に安定に分散せし
めることができる。氷塊とともに該水不溶性高分
子物質の非溶媒を加えるときは、氷塊を該不溶性
高分子物質の非溶媒に一旦スラリー化したのち、
このスラリーを水不溶性高分子物質を溶解した有
機溶媒中に急速撹拌下で加えれば良い。この場
合、氷塊は非溶媒とともに水不溶性高分子物質を
溶解した有機溶媒中に分散されるため、氷塊の周
辺で水不溶性高分子物質が凝固し、更にこの凝固
した水不溶性高分子物質が過剰の有機溶藺になか
ば溶解された状態が形成され、その結果氷塊は水
不溶性高分子物質を溶解した有機溶媒中に安定に
分散される。更に又、これをより効果的に行なう
ために氷塊中にポリビニルアルコール，ポリエチ
レングリコール等の水溶性高分子物質あるいはグ
リセリン，エチレングリコール等の多価アルコー
ルなどを共含させることもできる。氷塊の分散性
の向上を目的として使用される非溶媒は水不溶性
高分子物質を溶解せず０℃以下で液状の溶媒であ
り、水不溶性高分子物質を溶解した有機溶媒と混
和するものから選ばれる。

本発明で使用される固体構造物は、水に溶解し
ない固体状の無機物あるいは有機物の中から選ば
れ、その形態が粒状，粉末状，繊維状，棒状，板
状，管状等いかなる形態であつても使用できる。

この固体の構造物を前記の氷塊を含む混合物で
被覆せしめるときは、例えば、構造物を氷塊や水
不溶性高分子物質を含む有機溶媒中に浸漬した
り、あるいは構造物の表面に塗布したり、更に又
微小な構造物の場合は混練したりすることにより
構造物の表面の全部又は一部を混合物で被覆する
ことができる。これらの操作は連続的でも回分的
でも可能である。次いで構造物の表面を被覆した
混合物から有機溶媒を除去するには、減圧下で有
機溶媒を蒸発させてもよく、あるいは水不溶性高
分子物質の非溶媒中で凝固させるなどの方法によ
つてもよい。

酵素や微生物は氷の内部に包含されている間は
有機溶媒が共存しても安定であるが、氷が融解す
ると有機溶媒による酵素の失活あるいは微生物の
死滅が起こる危険性があるため氷が融解する前に
包括物から有機溶媒を除去することが好ましい。

このようにして有機溶媒を除去した氷の包括物
は、そのまま冷凍保存し使用前に融解して固定化
酵素あるいは固定化微生物として用いることがで
きるが、更にこのものを真空凍結乾燥装置等を用
いて凍結乾燥することにより保存や輪送に便利な
形態とすることができる。

本発明は、固体構造物の表面に酵素や微生物を
包括した水不溶性高分子物質を形成させるという
全く新規な固定化された酵素又は微生物の製造法
を提供するものである。

従来法が酵素又は微生物を有機溶媒中に安定に
保存せしめた状態で包括を行なつていないため、
既に述べたような種々の欠点が生じるのに対し、
本発明によればこれら従来の欠点は解決され、現
在工業的に汎用されている各種の水不溶性高分子
物質の使用が可能になり、しかも、固体の構造体
に支持された機械的強度の優れた固定化酵素又は
固定化微生物が容易に製造できる利点を有する。
又、本発明は構造体の形状を選択しておくことに
より粒状，棒状，管状，繊維状，フイルム状等は
もとより目的に応じた複雑な形状に成型された固
定化酵素又は固定化微生物を得ることができる。

更に又、本発明は構造体の表面に薄膜状に酵素
や微生物を包括した水不溶性高分子物質膜を形成
させるため反応に関与する物質の透過性が著しく
改善された効率のよい固定化酵素又は固定化微生
物が製造できる利点も有する。

本発明により製造された固定化された酵素又は
微生物は、これらの特異性に着目した各種の有用
物質の生産工程の触媒として、また廃水処理手段
として、あるいは分析手段として広く利用でき
る。更に又、固定化微生物の場合は、微生物が生
きた状態で包括されているため、その使用に際し
ては栄養培地で使用することにより長期間自己再
生を行なわしめながら反応に供することができ
る。

以下実施例により具体的に説明する。

実施例 １ 糸状菌グルコアミラーゼ（長瀬産業社製，粗製
品）を溶解した水溶液に5.0重量％になるように
グリセリンをを溶解せしめた。ついでこれをスプ
レーで微小な水滴としてドライアイスに冷却され
た―70℃のｎ―ヘキサン中へ吹き込み急速凍結を
行なつてグルコアミラーゼを含有する微小な氷塊
を生成せしめた。この氷塊を手早くブフナーロー
トで別して回収したのち約60ｇのｎ―ヘキサン
及び約100ｇの氷塊を−50℃に冷却された二塩化
メチレン400ｇ中に加え氷塊のスラリーを調整し
た。このスラリー約400ｇを別途調整した20重量
％のセルローストリアセテート（三菱アセテート
社製）を溶解した−15℃の二塩化メチレン500ｇ
中に急速撹拌下徐々に加え氷塊を分散したセルロ
ーストリアセテート／二塩化メチレンのドープを
得た。ドープの温度を−30℃付近にしてドープの
粘度を調整したのち、このドープを−20℃に冷却
されたポリエステル製の不織布の片面にほゞ均一
に薄膜状に塗布した。ひきつづいて−50℃に冷却
されたトルエン浴に浸漬することにより氷塊を包
括したセルローストリアセテート凝固物を得た。
この凝固物に含浸されているトルエンを冷却され
た石油エーテルで抽出除去したのちひきつづき減
圧下で石油エーテルを蒸発して除去した。次いで
このものを５℃のイオン交換水浴に浸漬してセル
ローストリアセテート凝固膜内に包括されている
氷塊を融解せしめることによりグルコアミラーゼ
を包括したセルローストリアセテート膜で被覆さ
れた不織布を得た。セルローストリアセテートの
膜厚は水で膨潤した状態の時平均150μｍであつ
た。

この不織布を５mm四方に切断後、切断物1.0ｇ
を5.0重量％のマルトースを含有するＭ／10酢酸
緩衝液（PH4.5）150mlに加えたのち、40℃の温
度で振盪下マルトースの加水分解反応を行なつ
た。マルトースの分解生成物であるグルコースを
グルコスタツト試薬（藤沢メデイカルサブライ社
発売品）で定量したところ１時間の反応で915mg
のグルコースが生成し、包括前のブルコアミラー
ゼの活性に比べて39.8％の活性発現率を示した。

実施例 ２ Saccharomyces cerevisiae IFO0304をグルコ
ース1.0重量％、酵母エキス0.3重量％、マルトエ
キス0.3重量％、ペプトン0.5重量％含有するYM
培地（PH6.0）に植菌し、30℃で24時間振盪培養
した。この培養液1.6に含まれるS.cerevisiaeを
遠心分離（3000r.p.m×15分）して回収したの
ち、上記組成のYM培地200mlに懸濁せしめた。
このS.cerevisiae懸濁液に10.0重量％のグリセリ
ンを共有せしめたのち、スプレーで微小な水滴に
してドライアイスで冷却された−70℃のｎ―ヘキ
サン中で急速凍結することによりS.cerevisiaeを
含有した氷塊を生成せしめた。この氷塊を手早く
ブフナーロートで回収したのち、氷塊150ｇをｎ
―ヘキサン約100ｇとともに700ｇの−50℃の二塩
化メチレン中加えて氷塊スラリーを調整した。こ
のスラリー750ｇを別途調整した2.5重量％のセル
ローストリアセテートを溶解した−15℃の二塩化
メチレン800ｇ中に急速撹拌下徐々に加え氷塊を
分散したドープを得た。ついでこのドープ中に20
メツシユのステンレス製網（縦1.0cm、横15cm）
を浸漬して網の表面にドープを付着せしめたのち
冷トルエン浴に浸漬してセルローストリアセテー
トを凝固させた。トルエン浴からとり出した網を
再度ドープ中に浸漬し、ついでトルエン浴で凝固
させることにより網の表面を氷塊を包括したセル
ローストリアセテート膜で被覆せしめた。この凝
固膜に含浸されているトルエンを冷却されたｎ―
ヘキサンで抽出除去したのち、減圧下でｎ―ヘキ
サンを蒸発除去し、ひきつづいて一晩凍結乾燥を
行なうことにより、ステンレス網の表面を被覆
し、かつS.cerevisiaeを包括したセルローストリ
アセテート膜を得た。

この網15枚を円筒型カラム（内径3.0cm、高さ
20cm）内に、カラム中心軸のまわりにほぼ均一に
配置したのち、カラム内に10重量％のグルコー
ス、0.3重量％のマルトエキス、0.3重量％の酵母
エキス、0.5重量％のペプトンを含有する培地
（PH6.0）を連続的に供給したところ30℃の温度で
約３カ月間約３％濃度のエタノールが生産され
た。

実施例 ３ ウレアーゼ（関東化学社製、粗製品）をイオン
交換水に溶解後、実施例１と同様にして氷塊を調
整した。この氷塊約90ｇ及びｎ―ヘキサン約65ｇ
を冷却された二塩化メチレン300ｇ中に加えて、
氷塊スラリーを調整した。このスラリー320ｇを
別途調整した2.5重量％のセルローストリアセテ
ートを溶解した−15℃の二塩化メチレン400ｇ中
に急速撹拌下徐々に加えて氷塊を分散したセルロ
ーストリアセテート／二塩化メチレンのドープを
調整した。このドープを−35℃付近まで冷却して
粘度を調整したのち、ドープ中に固体構造物であ
るガラス棒（直径５mm）、紙（東洋紙No.２）、
ガーゼを浸漬してドープを付着せしめ、ついで冷
却されたトルエン浴中でセルローストリアセテー
トを凝固させた。トルエン浴から取り出したのち
再度ドープ中に浸漬し、ついでトルエン浴中で凝
固させることによりガラス棒，紙，ガーゼの表
面を氷塊を包括したセルローストリアセテート凝
固膜で被覆せしめた。この凝固膜に含浸されてい
るトルエンを冷却された石油エーテルで抽出除去
し、ついで石油エーテルを減圧下で蒸発させて除
去した。この後、凝固膜内に包括されている氷塊
を融解せしめて、平均200μｍのセルローストリ
アセテート膜で被覆されたガラス棒，紙，ガー
ゼを得た。

この固定化されたウレアーゼを1.0重量％の尿
素を溶解したＭ／10リン酸緩衝液（PH7.0）に浸
漬したところアンモニアの生成がみられた。なお
アンモニアの検出はネスラー試薬で行なつた。更
にこの操作を10回くり返して行なつたが、ガラス
棒，紙，ガーゼのいずれの場合もほゞ安定して
アンモニアが生成した。

実施例 ４ 実施例３と同様にして調整したドープにシリカ
及びアルミナを主成分とする粗面の球状の担体
（直径３mm）を浸漬して担体の表面にドープを付
着せしめたのち、−50℃に冷却されたトルエン浴
に加えてセルローストリアセテートを凝固せしめ
た。凝固物に含浸されているトルエンを実施例３
と同様にして除去したのち、セルローストリアセ
テート膜内に包括されている氷塊を融解せしめ
た。

この担体50ｇを直径５cmのカラムに充填したの
ち、空間速度0.5（hr^-1）で1.0重量％の尿素を含
有するＭ／10リン酸緩衝液（PH7.0）を通液した
とき、25℃で１時間当り15mgのアンモニアが生成
した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 酵素又は微生物を含有した氷塊と水不溶性高
   分子物質を溶解した有機溶媒との混合物で固体構
   造物を被覆したのち有機溶媒を除去することを特
   徴とする固定化された酵素又は微生物の製造法。 ２ 水不溶性高分子物質を溶解している有機溶媒
   を減圧下で除去することを特徴とする特許請求の
   範囲第１項記載の固定化された酵素又は微生物の
   製造法。 ３ 水不溶性高分子物質を溶解している有機溶媒
   を該水不溶性高分子物質の非溶媒で除去すること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の固定化
   された酵素又は微生物の製造法。 ４ 酵素又は微生物を含有する氷塊が、酵素又は
   微生物を含有する水溶液を冷却媒体中で凍結させ
   て生成されたものであることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項又は第２項又は第３項記載の固定
   化された酵素又は微生物の製造法。 ５ 冷却媒体が凝固点が０℃以下の液状物である
   ことを特徴とする特許請求の範囲第４項記載の固
   定化された酵素又は微生物の製造法。 ６ 酵素又は微生物を含有する氷塊が直径１mm以
   上のものであることを特徴とする特許請求の範囲
   第１項，第２項，第３項，第４項又は第５項記載
   の固定化された酵素又は微生物の製造法。 ７ 有機溶媒が０℃以下の温度において0.1重量
   ％以上の水不溶性高分子物質を溶解するものであ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項，第２
   項，第３項，第４項，第５項又は第６項記載の固
   定化された酵素又は微生物の製造法。 ８ 水不溶性高分子物質が酢酸セルロース，エチ
   ルセルローズであることを特徴とする特許請求の
   範囲第７項記載の固定化された酵素又は微生物の
   製造法。 ９ 水不溶性高分子物質がポリアクリロニトリ
   ル，ポリアクリル酸エステル，ポリメタクリル酸
   エステル，ポリスチレン，ポリ酢酸ビニル，ポリ
   塩化ビニル，ポリカーボネートであるか、又はこ
   れらホモポリマーを構成する単量体を成分とする
   ようなコポリマーであることを特徴とする特許請
   求の範囲第７項記載の固定化された酸素又は微生
   物の製造法。