SE452160B - Forfarande for framstellning av mikroporosa kroppar inneslutande ett eller flera aktiva medel - Google Patents

Description

20 25 30 35 _på annat sätt. 452 160 för framställning av mikroporösa kroppar, som innesluter ett eller flera av nedan angivna aktiva medel, varvid för- farandet omfattar följande förfarandesteg: a) bildning av en förberedande lösning av en polymer matris i ett organiskt lösningsmedel, b) bildning av en dispersion eller lösning av ifrågavarande aktiva medel i ett medium, som är både kompatibelt med det aktiva medlet och blandbart med det organiska lösningsmed- let för den polymera matrisen, c) tillsats till det som erhållits vid förfarandesteget b), av ett additiv, vars natur och funktion förklaras närmare i det följande, d) blandning av lösningen av den polymera matrisen med en lös- ning eller med en dispersion av det aktiva medlet enligt förfarandesteget b), vilken innehåller additivet enligt för- farandesteget c), e) formning av den vid förfarandesteget d) erhållna bland- ningen.

De aktiva medel som kan ockluderas enligt förfaran- det är biologiska kompositioner, exempelvis enzymer eller enzymceller, antigener, antikroppar, antisera, hormoner, koenzym som är tillfredsställande bundna vid makromolekylä- ra matriser eller substanser, som har annat slag av aktivi- tet eller som har speciella egenskaper, exempelvis sekves- teringsmedel, färgämnen med lämpligt vald molekylvikt och i allmänhet alla sådana substanser som inte skall återvinnas, men som i stället kan âterställas för förnyad användning el- ler reaktiveras för återanvändning. Tillägas må, att det vid tillämpning av förfarandet enligt uppfinningen också är möjligt att ockludera kroppar som redan har ockluderat de aktiva medlen i enlighet med föreliggande förfarande eller Det är också möjligt att ockludera andra substanser härrörande från fysisk eller kemisk förbindelse av aktiva medel med lämpliga substrat. Därigenom är det möj- ligt att exempelvis uppnå kraftigt skydd för det aktiva med- let. Det aktiva medlet kan också ockluderas som sådant el- ler efter att ha kompletterats med lämpliga inerta fyllmedel.

Förfarandet enligt uppfinningen har visat sig vara särskilt 10 15 20 25 30 35 452 160 effektivt för framställning av biologiska katalysatorer, É även tack vare den ovan nämnda möjligheten att framställa sådana katalysatorer med mycket varierande formgivning.

Det är sålunda möjligt att framställa fibrer, fibriller, cylindriska kroppar av olika form, såsom ellipsoider eller sfärer, pulver av olika storlek, i det att den önskade for- men är en funktion av den sekvens av förfarandesteg, som tillämpas vid den slutliga formgivningsbehandlingen.

Den sistnämnda behandlingen kan genomföras genom att den av lösningen av den polymera matrisen och det ak- tiva medlet eller av dess dispersion bildade blandningen koaguleras i ett medium, som icke är ett lösningsmedel för den polymera matrisen.

Koaguleringen kan ske genom att man droppar bland- ningen i mediet varvid man där exempelvis får kroppar med sfärisk eller sfäroidisk form, eller att man låter bland- ningen strömma direkt in i mediets inre, så att man får fib- rer eller liknande strukturer.

En alternativ formningsprocedur är torr extrusion sh med förångning av blandningens lösningsmedel, varvid man kan få en kontinuerlig tråd, vilken kan uppdelas till cylindris- ka kroppar och liknande med tvärsektioner av olika form.

En annan formningsprocedur kan genomföras genom att man ur ett kärl under tryck, med eller utan hjälp av drivmedel, sprutar ut blandningen så att det bildas fibriller eller pulver av varierande storlek.

De polymera matriser som kan användas vid förfaran- det enligt uppfinningen är, bland andra: cellulosapolymerer, ' förestrade eller företrade cellulosapolymerer, polyamider, akrylnitrilpolymerer och sampolymerer, butadien och isopren, akrylat och metakrylat, vinylestrar, vinylklorider, polyme- rer och sampolymerer av vinylidenklorid, styren, vinylbuty- rat, Y-metylglutamatlocn liknande.

Cellulosaestrarna har visat sig vara speciellt läm- pade för ändamålet.

De media, i vilka de aktiva medlen skall lösas eller dispergeras, väljs, som ovan antytt, bland sådan som är kompatibla med ifrågavarande medel eller som 452 160 10 15 20 25 30 35 4 kan blandas med lösningsmedlet för den polymera matrisen.

De kan väljas bland följande klasser av föreningar, varvid de föredragna är angivna inom parenteser: _ vatten, alkoholer (metanol, etanol, propanol, butanol, tert-butanol, etylenglykol, glycerol), ketoner (aceton, metyletylketon), etrar (dioxan, tetrahydrofuran, etoxietanol), estrar (etyl och metylacetat, propylacetat, etyl- format och andra), syror (ättiksyra, propionsyra och myrsyra), pyridin, acetonitril, cyklohexan, dimetylformamid.

Lösningsmedlen för den polymera matrisen kan väljas bland en mångfald föreningar-áfberoende'šgtslaget av använt polymer matris.

Som exempel kan följande anges: Aceton, metylisobutylketon, cyklohexanon, metylace- tat, metylcellosolve, etyllaktat, metylenklorid, propylen- klorid, tetrakloretan, nitrometan, klorfenol, metakresol, fiä ättiksyra, myrsyra, dimetylformamid, dimetylsulfoxid, alko- holer, dioxan, kolväten såsom bensen, toluen, ketoner, est- rar, pyridin, kloroform, blandningar av etanol och vatten, etanol och CCI4, isopropanol, metyletylketon.

De ovan nämnda additiven har till uppgift att aggre- gera eller bilda tvärförbindningar i det aktiva medlet vid blandningen av detta med den polymera matrisen.

Bland användbara additiv må följande nämnas som spe- ciellt lämpade: a) Polymerer med olika molekylvikt som inte är lösliga i lös- ningsmedlet för den polymera matrisen, exempelvis polyami- ner, såsom polyetylenimin, katjoniska och anjoniska poly- E akrylamider, polyaminosyror, exempelvis polyläsiner, sul- fonerad polystyren, polykarboxylsyror, polyvinylalkoholer, polyvinylpyrrolidon. b) Polyfunktionella reagenter, exempelvis alifatiska aldehy- der, isocyanater, tioisocyanater och liknande.

Alla operativa detaljer framgår närmare av de följan- de exemplen, vilka illustrerar uppfinningen, men naturligtvis pa intet sätt begränsar densamma. 5 10 15 20 25 30 35 5 _ 452 160 Exempel 1: Smâkulor av B-galaktooxidas erhållen genom ock- ludering av celler av Saccharomyces lactis En 10-procentig (vikt) lösning av cellulosaacetatö (Fluka) i aceton (Carlo Erba) framställs. polymera lösning tillsätts 154 g cellulär pasta (torrvikt 375 g av denna 35,8 g) härrörande från 2 l fermentering av Saccharomyces lactis, under omrörning.

Man får därvid en cellulär dispersion, som sätts till en stålbehâllare och extruderas genom ett kapillärrör med diametern 0,4 mm genom pressning med kväveundertryck.

Efter utpressning av omkring 20 cm formas den tunna utpres- sade tråden till ett radband av pärlor, som släpps i vatten- bad och då koagulerar i form av smâkulor. 7 Därefter uppsamlas omkring 800 g fuktiga smâkulor, som efter att ha torkats i luftström, väger sammanlagt 73 g.

Ett gram av dessa smâkulor inkuberas vid ZSOC med 200 ml av en lösning av vattenfri laktos (4,75 viktprocent), som inne- håller 2 mmol MgSO4.7H20, l mlol EDTA, i en 0,1-molär, pH7 fosfatbuffer. Efter två timmars reaktion har 80% av lakto- sen omvandlats till glukos och galaktos, som visat av glu- kosanalys genomförd med glukostest (Boehringer).

Laktoshydrolysen med dessa småkulor upprepades 20 gånger utan att någon förlust av aktivitet kunde iakttas.

Exempel 2: Smâkulor av penicillinacylas, framställd genom ockludering av E.coli-celler som dessförinnan behandlats med polyetylenimin Celler av E.coli (torrvikt 20 g) innehållande l.l06 enheter uppslammas i 875 g vatten och behandlas under l0”mi- nuter under omrörning med 25 g av en 3,3-procentig (vikt) lösning av polyetylenimin (Polysciences). Lätt avsatta cell- aggfegat bildades.

Den erhållna cellulära pastan uppslammades därefter' i en mindre mängd vatten (total vikt 127 g) och omrördes .häftigt med 157 g av en 10-procentig (vikt) lösning av cel- lulosaacetat (Fluka) i aceton (Carlo Erba). På samma sätt som i exempel l framställes 35 g småkulor (torrvikt). En del av dessa småkulor (5 g) inkuberades vid 37°C i 400 ml av en lösning av penicillin G (Squibb), koncentration 6%, i 0,02-molär pH8 fosfatbuffer. Den ursprungliga aktivite- 10 15 20 25 30 35 452 160 ten, som var så stor som 60.000 (umol per timme hydrolyse- rad penicillin G) och fullständig hydrolys uppnåddes inom omkring 4 h. Samma smâkulor bibehöll när de återanvändes 20 gånger (hydrolys) bibehöll 60% av sin ursprungliga akti- vitet.

Exempel 3: Småkulor av penicillinacylas erhållen genom ock- ludering av celler av E.coli som dessförinnan behandlats med polyetylenimin och glutaralde- Exë celler av stall (torrvlkt zo g) innehållande 1.105 enheter uppslammades i 400 g vatten och behandlades under omrörning under 10 min med,25 g av en 3,3-procentig lösning av polyetylenimin (Polysciences, Inc.) och 5 g av en 25-pro- centig lösning av glutaraldehyd (Merck).

De efter avsättning uppsamlade cellerna omröres häf- tigt med 157 g av en 10-procentig lösning av cellulosaacetat (Fluka) i aceton (Carlo Erba).

Framställningen av småkulorna genomföras på det sätt som beskrivits i föregående exempel. Man får 40 g torra små- kulor, varav 5 g används för provning av aktiviteten under samma förhållanden som i exempel 2. Aktiviteten var 50.000 enheten och hydrolysen fullbordas inom något mer än 4 h.

Till skillnad från de smâkulor som framställts utan glutar- aldehyd, bibehåller småkulorna enligt detta exempel sin ak- tivitet oförändrad i förhållande till den ursprungliga.

Exempel 4: Småkulor av glukosisomeras erhållen genom ocklu- dering av celler av Arthrobacter sp. som dess- förinnan behandlats med polyakrylamid (Prode- floc A/lS) Till 10 l av en badkultur av celler av Arthrobacter sp. innehållande glukosisomerasenzym sätts efter avslutandet av fermenteringen 500 g av en 0,3-procentig lösning av poly- akrylamid. Den cellulära uppslamningen omrörs under 20 min,m varefter cellerna får sjunka. Den erhållna cellulära pastan (torrvikt 150 g) uppsamlas och âteruppslammas med vattenifills vikten blir 600 g och blandas energiskt med 1500 g av en 10- -procentig lösning av cellulosaacetat (Fluka) i aceton. Pâ samma sätt som i föregående exempel framställs smâkulor. Ett gram av dessa inkuberas vid 60°C i 100 ml av en 50-procentig 10 15 20 25 30 35 ' *man :nam 452 160 7 (vikt) lösning av glukos innehållande 5.10-3 1o'4 moi coc12, 0,1 mal Na2so3, pa 7. ningar bestämdes aktiviteten till 100 internationella enheter mol 'Mgso4 . 7H2o, Med polarimetriska mät- (umol fruktos bildad på en minut) med ett utbyte (öppen ak- tivitet/ackluderad aktivitet) på 56%. Dessa småkulor använ- des kontinuerligt under 20 på varandra följande dygn under provningsförhållanden, förlorade ingen aktivitet.

Exempel 5: Smâkulor av glukosisomeras erhållna genom ocklu- dering av enzymet i lösning efter behandling med polyetylenimin och glutaraldehyd Enzymlösningen framställes genom upplösning av 2 g 1 glukosisomeraspulver (Godo Shusei) i 8 g vatten. Denna lös- ning tillsätts under omrörning 4 g av en 3,3-procentig lös- ning av polyetylenimin (Polysciences, Inc.) och 4 g av en 2,5-procentig lösning av glutaraldehyd (Merck). Detta enzym- preparat blandas med l00 g av en 10-procentig lösning av cel- lulosaacetat (Fluka) i aceton (Carlo Erba) vid rumstempera- tur. På samma sätt som i föregående exempel framställes små- kulor, vilkas vikt efter torkning i luft är 12 g. En del av * dessa småkulor, 2 g, inkuberades vid 60°C med 100 ml av en 50-procentig (vikt) lösning av glukos innehållande 5.l0_3 moi mgso4.7H2o, 1o'4 moi coc12, 0,1 moi Na2so3 pa? för be- stämning av aktiviteten, som är SOO internationella enheter med ett utbyte på 30-40%.

Exempel 6: Cylindriska kroppar av cellulosaacetat ocklude- rande polyetylenimin som sekvesteringsmedel 15 g cellulosaacetat (Fluka) löses i 85 g aceton (Carlo Erba). Till den polymera lösningen sätts långsamt och under omrörning 15 g av en 33-procentig (vikt) vatten- lösning av polyetyleniminhydroklorid (Polysciences, Inc.) och 5 g av en l-procentig lösning av glutaraldehyd (Merck).

Blandningen sätts till en stâlcylinder, som upptill är anslu- ten till en kvävebehållare och med botten till ett spinnmun- stycke som är nedsänkt i ett vattenbad. kvävetrycket utpressas blandningen från munstycket och koa- Denna tråd Ett gram av dessa cy- lindriska kroppar behandlas under 4 h med en kopparsulfat- Under ökning av gulerar, varvid man får en kontinuerlig tråd. uppdelas i l-2 cm långa provstycken. lösning med koncentrationen 18,3 ppm, erhâllen genom upplös- 10 15 20 25 30 35 452 160 . ua ning av CuSO4.5H2O i destillerat vatten. Med atomabsorp- tionsspektrofotometer (Varian-Techtron 1200) bestäms koppar- innehållet (l,l ppm) i den med cylindrarna behandlade lös- ningen. Efter tvättning av cylindrarna med 50 ml E-normal HCl, erhölls 17 ppm koppar som resultat.

Cylindrarna behandlades åter under 4 h med den an- givna kopparlösningen och kopparinnehållet i lösningen mät- tes än en gâng och visade sig vara 1,2 ppm. Denna arbets- sekvens upprepas 10 gånger och det visar sig att cylindrar- na inte förlorar sin kopparutskiljande förmåga.

Exempel 7: Fibriller av invertas erhållna genom ockludering av enzymet i en lösning, till vilken polyvinyl- pyrrolidon tfïlsatts En lösning av 50 g invertas (B.D.H.) omrörs kraftigt efter tillsats av 10 g polyvinylpyrrolidon (K30, Fluka) med 333 g av en l5-procentig lösning av cellulosaacetat (Fluka) i aceton (Carlo Erba). Efter införande i en autoklav sträng- pressas preparatet med kvävetryck (5000 kPa) genom ett 500- -um-munstycke och ett torrt pulver uppsamlas av fibrilltyp, vars partikelstorlek ligger i omrâdet 160-1600 um. Aktivi- teten hos det ockluderade invertasenzymet i fibrillerna mät- tes på en lösning av 20% sukros i en 0,1-molär, pH4 vid 25°C fosfatbuffer. Aktiviteten räknat i mg inverterad sukros per minut och per g fibriller ligger i området 8-50 i beroende av fibrillstorleken.

Exempel 8: Fibrer av hydroxipyrimidinhydrolas och N-karba- mgyl-D-aminosyra-hydrolas erhållen genom ocklu- dering av celler av Agrobacterium radiobacter, vartill satts polyetylenimin Celler av Agrobacterium radiobacter (torrvikt 4 g) uppslammas i 100 g vatten och behandlas under omrörning med 2 g av en 3-procentig lösning av polyetylenimin (Polyscien- ces, Inc.). Efter 10 min avbryts omrörningen, varefter av- satta celler uppsamlas och uppslammas i 25 g vatten. Upp- slamningen omrörs häftigt med 20 g av en 20-procentig lös- ning av cellulosaacetat (Fluka) i aceton (Carlo Erba). Pre- paratet införs i en stålcylinder, som vid toppen är anslu- ten till en kvävetryckkälla och vid botten till ett munstyc- ke med en öppning på l mm. Med en portioneringspumg sträng- 10 452 160 pressas preparatet genom munstycket i form av en kontinuer- lig tråd, som får torka i luft under avdunstning av aceton under ett fall på 4 meter. Hela tråden (torrvikt 8 g) in- kuberas vid 4006 under kvävetäcke i en 0,1-molär, pH8 fos- fatbuffer innehållande 4 g DL-fenylhydantoin för dosering av aktiviteten hos de båda enzymerna. Efter reaktion under 20 h fås fullständig omvandling av hydantoinet till D(-)fenylglycin, som framgår av analys på en aminosyraana- lysator. Samma tråd förlorar efter användning 10 gånger för lika många successiva hydrolyser 30% av sin ursprung- liga aktivitet.

Claims (3)

452 160 ' 1D PATENTKRAV

1. F örfarande för framställning av mikroporösa kroppar inneslutande ett eller flera aktiva medel, varvid en lösning av ett polymert material i ett organiskt lösningsmedel blandas med det aktiva medlet, varefter den erhållna blandningen formas, k ä n n e t e c k n a t av _ att det polymera materialet utgöres av cellulosapolymerer, förestrade eller företrade cellulosapolymerer, polyamider, polymerer eller sampolymerer av akrylnitril, butadien, isopren, akrylater, metakrylater, vinylestrar, vinyl- klorid, vinylidenklorid, styren, V-metylglutamat eller kombinationer därav, att det aktiva medlet utgöres av enzymer, enzymhaltiga celler, antigener, antikroppar, entisera, hormoner, koenzymer bundna till högmolekylära ämnen, sekvestreringsmedel, färgämnen eller kombinationer därav, att det aktiva medlet försättes med ett additiv, med uppgift att aggregera eller bilda tvärbindningar i det aktiva medlet, valt bland a) polymerer med olika molekylvikt, som inte är lösliga i lösningsmedlet för det polymera materialet, valda bland polyaminer såsom polyetylenimin, katjoniska och anjoniska polyakrylamider, polyaminosyror såsom polylysin, sulfonerad polystyren, polykarboxylsyror, polyvinylalkoholer och polyvinyl- pyrrolidon och b) polyfunktionella föreningar valda bland alifatiska aldehyder, isocyanater och isotiocyanater, -att lösningen av de polymera materialet blandas med en dispersion eller lösning av det aktiva medlet i ett medium som är blandbart med det organiska lösningsmedlet, samt av att den erhållna blandningen formas genom koagulering i ett medium, som icke är ett lösningsmedel för den polymera matrisen.

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av, att bland- ningen koaguleras genom att man droppar blandningen i mediet, varvid kroppar med sfärisk eller sfäroidisk form erhålles, eller genom att man later blandningen strömma direkt in i medietåinre, varvid fibrer eller liknande strukturer erhålles.

3. Förfarande enligt krav 1 eller 2, k ä n n e t e c k n a t av, att det polymera materialet utgöres av cellulosaestrar. F13.