JPS5936B2 - 固定化酵素用担体およびその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は固定化酵素用担体およびその製造法に関するも
のである。

酵素を共有結合法により担体に固定化する方法において
、従来あ・ら担体として多糖類誘導体、ポリアミノ酸共
重合体、スチレン系樹脂、エチレン−マレイン酸共重合
体の誘導体、多孔性ガラスのアミノシラン誘導体などが
知られている。

しかしながら、これらの担体は非常に高価であったり、
官能基を導入するために手の込んだ反応を必要とし、そ
のため所要量の官能基を導入するのが困難であったりす
る欠点を有し、必ずしも、固定化酵素用担体として満足
できるものではない。

また、これらの担体に固定化した酵素をカラムに詰めて
酵素反応を生じさせた場合、微粉末による詰りや水によ
る膨潤により基質溶液の流速が乱される現像が起こる。

一般に酵素を担体上に共有結合させる場合、酵素の活性
中心の官能基を保護する目的で用いる酵素により結合試
薬を選ばなければならない。

また担体上の官能基の分布は少なすぎれば固定化率が悪
く固定化酵素の活性は低くなり、多すぎれば酵素分子と
不必要に多くの共有結合点を持ち、基質分子と活性中心
との結合を立体的に阻害したり、酵素分子の立体構造を
変化させることにより、固定化酵素の活性低下の原因と
なる。

したがって、酵素と同じ官能基を適度の分布で持つ担体
としては蛋白質が好ましい。

ところで、水溶性蛋白質は酵素と混合して架橋反応させ
て不溶化することにより酵素を固定化したり、あるいは
架橋反応等で不溶化した蛋白質は共有結合試薬を用いて
酵素を固定化することができる。

しかしながら、このようにして製造した固定化酵素は成
型が困難であり、乾燥状態では脆くて砕けやすく、湿潤
状態では膨潤して変形しやすいため、取扱いが困難であ
り、また用途も限られる。

本発明者らは従来の固定化酵素が有する欠点を解消する
ために種々鋭意検討したところ、不活性な蛋白質にビニ
ル系単量体をグラフト重合した共重合体を担体として用
いると所期の目的を達成することを見出し、本発明に到
達した。

すなわち本発明は蛋白質−ビニル系単量体グラフト共重
合体からなる固定化酵素用担体および蛋白質−ビニル系
単量体グラフト共重合体水溶ｉｔ水中で凝固させ、未延
伸状態で乾燥させることを特徴とする固定化酵素用担体
の製造法である。

本発明の固定化酵素用担体は素材が安価であって、成型
方法が容易であり、繊維、糸、フィルム、粉末、ビーズ
などの各種形状のものが得られる。

また酵素固定化方法として、格別複雑な工程を採る必要
がない。

さらに本発明の担体は乾燥状態において強固であり、湿
潤状態においても膨潤したり変形したすせず、取扱いが
容易である。

本発明に用いる蛋白質−ビニル系単量体共重合体とは牛
乳、酵母、とうもろこし、大豆等の蛋白質にビニル系単
量体、特にアクリロニトリル単独またはアクリロニトリ
ルを主体とするビニル系単量体をグラフト重合させた共
重合体である。

共重合体中に占める蛋白質の割合は特に制限はないが適
当な割合は５〜７０％Ｘ好ましくは１０〜５０俸である
。

上記共重合体を得る方法としては、だとえは蛋白質を一
旦稀薄アルカリ水溶液に溶解後、酸を添加して蛋白質の
等電点以上乃至ＰＨ７，０以下の範囲にＰＨを保持して
、蛋白質の溶解状態において、ビニル系単量体の重合を
行なう方法がある。

蛋白質としては牛乳カゼイン、大豆分離蛋白質、血清蛋
白質、酵母やバクテリアから抽出した蛋白質など不活性
な蛋白質ならいずれでも使用できる。

ビニル系単量体としてはアクリロニトリル、アクリル酸
またはそのエステル、メタクリル酸またはそのエステル
、酢酸ビニル、スチレン、塩化ビニノに塩化ビニリデン
、弗化ビニル等が挙げられる。

本発明に用いるグラフト共重合体の１種、蛋白質−アク
リロニトリル共重合体はすでに特公昭３７−１８３８７
号公報などにより広く知られており、この共重合体は従
来、衣料用繊維の原料として用いられてきている。

本発明における固定化酵素用担体とは上記共重合体から
成形される繊維、糸、フィルム、粉末、ビーズなどの各
種形状の成形品をいう。

このような成形品を得る方法としては、蛋白質−ビニル
系単量体グラフト共重合体の水溶液を水中で凝固させ、
未延伸状態で乾燥させる方法を用いる。

繊維を得る具体的方法としては、たとえば蛋白質−アク
リロニトリル共重合体の塩化亜鉛ドープを紡糸用ノズル
から低温の水系凝固浴中に押し出した後に、塩化並塩溶
液の代わりに水中で急速に凝固させて比較的ゆるんだ構
造のゲルを形成させ、十分水洗してゲル中の塩化亜鉛を
除去した後、延伸することなく室温にて風乾あるいは凍
結乾燥すれば表面積の大きい多孔性の繊維が得られる。

フィルムを得る具体的方法としてはたとえば蛋白質−ア
クリロニトリル共重合体の濃厚塩化亜鉛ドープをガラス
板あるいはテフロＺ阪上に均一な薄層状に拡げた後、水
または５〜４０％塩化亜鉛水溶液中で凝固させることに
より膜状に成型できる。

また、この繊維または膜を乾燥させた後、粉砕すること
により粒状にも成形できる。

粒子の大きさは繊維径、膜の厚みを変えて、粉砕した粒
子を篩分けることにより希望の大きさの粒子を得ること
ができる。

なお、従来の衣料繊維は蛋白質−アクリロニトリル共重
合体の塩化亜鉛水溶液を紡糸用ノズルより押出して塩化
亜鉛水溶液中にて一５〜１０℃で凝固させ、できるだけ
強固なゲルを形成させ、水洗後、９０〜１１５℃にて４
〜１５倍延伸することにより、共重合体を繊維方向に配
向させ、熱風および乾熱ローラーにて１０〜１５チの収
縮を伴なう乾燥工程を経ることによシ得られる。

このような衣料用繊維は繊維状あるいは粉砕して微細繊
維状にて固定化酵素用担体として使用することも可能で
あるが、本来、衣料用の繊維であるため構造が緻密であ
り、単位重量当りの表面積が小さく、また強固なため粉
砕が困難である。

本発明の蛋白質−ビニル単量体グラフト共重合体よりな
る担体に酵素を固定化させるには、通常知られている共
有結合方法を使用すればよい。

すなわち担体中の蛋白質を構成しているアミノ酸の種々
の官能基（たとえばα−またはε−アミノ基、α−９β
−マタはγ−カルボキシル基、スルフヒドリル基または
水酸基、イミダゾール基、フェノール基など）と酵素と
をジアゾニウム塩、酸アジド、インシアネートあるいは
活性型のノ・ロゲン化アルキルなどの試薬を用い、適当
な条件下に反応させると固定化酵素が得られる。

ジアゾニウム化合物としては、たとえば２，２′〜ジメ
トキシ−４，４′−ジアゾビフェニールなどが挙げられ
、酸アジド化合物としては、たとえばテレフタル酸ジア
ジド、アジピン酸ジアジドあるいはセバシン酸ジアジド
などが挙げられる。

またイソシアネート化合物としてはたとえば２，４−ト
リレンジイソシアネート、４，４′−ジフェニルメタン
ジイソシアネートあるいはフェニレンジイソシアネート
などが挙げられうさらにジグリシジルエーテルなどのエ
ポキシ化合物、グルタルアルデヒドなどのアルデヒド化
合物、あるいはテレフタル酸塩化物、アジピン酸塩化物
、セバシン酸塩化物などの酸塩化物なども上記試薬とし
て用いられる。

本発明の担体に固定化させる酵素は蛋白質分解活性を有
しない酵素である。

何故ならば蛋白質分解活性を有する酵素は担体の蛋白質
−ビニル系単量体共重合体の蛋白質部分を分解して、担
体の強度を低下させるばかりでなく、酵素の離脱を容易
にするからである。

蛋白質分解活性を有しない酵素の例としてはアミラーゼ
、インベルターゼ、ウレアーゼ、リパーゼ、グルコース
イソメラーゼ、ウリカーゼ、マルターベ セルラーゼ、
ペニシリナーゼ、エステラーゼ、デヒドロゲナーゼおよ
びグルコアミラーゼなどが含まれる。

これらの酵素は混合物として使用してもよい。

以下、本発明を実施例を用いて説明する。

本発明はこれらの実施例により限定されるものではなへ 実施例 １ カゼインを２．７％溶解した６０係塩化亜鉛水溶液３５
０部に、アクリロニトリル２２部を加え、さらに重合開
始剤として亜硫酸亜鉛を２％含む６０係塩化亜鉛水溶液
４５部と過硫酸亜鉛を１．５％含む６０％塩化亜鉛水溶
液３５部を加えて、２０℃にて３時間重合を行ない粘稠
な重合体ドープを得もこの重合体ドープを５０℃で一夜
脱泡後、紡糸ノズルを通し、１５〜２０℃の水中に吐出
し、十分水洗して蛋白質−アクリロニトリル共重合体よ
りなるゲル糸を得た。

このゲル糸を室温にて風乾した乾燥糸１．０１を２％グ
ルタルアルデヒド水溶液３０ｍ１に浸して室温にて３０
分間処理後、十分に水洗し、引続いてグルコースオキシ
ダーゼ（シグマ社製、Ｔｙ ｐｅ ＩＩ ）５０〜と一
酢酸緩衝Ｍ（ＰＨ５，１）２ｍｌを加０ え、５℃にて４８時間反応させ九次いで洗浄液中に酵素
活性が検出されなくなるまで水洗し、０．１モル／ｌの
グリシン水溶液で洗浄し、さらに１回水洗後、Ｍ／２０
酢酸緩衝液（ＰＨ５，１）にて洗浄した後、凍結乾燥し
た。

このようにして得られた固定化グルコースオキシダーゼ
繊維の活性は９．１単位／ｆ！であった。

実施例 ２ 実施例１と同様にして得た蛋白質−アクリロニトリル共
重合体のゲル糸を凍結乾燥後、粉砕して直径６０μｍ１
長さ１５０〜３００μｍの微細繊維を得た。

一方、２，２′−ジメトキシ−４，４′−ジアミノビフ
ェニル（ヘキスト・ジャパン社製、Ｆａｓｔ Ｂｌｕｅ
Ｂ Ｂａ５ｅ ） １ ？ ｆ ５ Ｎ−塩酸水溶液
２０ｍ１に溶解し、１０％亜硝酸水溶液６ｍ１に水冷下
に加えてジアゾ化した。

このジアゾ化水溶液を濾過後、泥液に上記蛋白質−アク
リロニトリル共重合体の微細繊維１２を加え、０℃にて
１時間反応させた。

次いで洗浄液のジアゾニウム塩の着色がなくなるまで蒸
留水で上記微細繊維を洗浄し、ウレアーゼ（シグマ社製
、ＴｙｐｅｌＩ ） ５０７１１？とリン酸緩衝１（Ｐ
Ｈ７，０）２ｍｌを加えて、５℃にて２４時間攪拌した
。

さらに水洗後、凍結乾燥して固定化ウレアーゼ微細繊維
を得た。

このようにして得られた固定化ウレアーゼ微細繊維の活
性は５１単位／１であつ九 実施例 ２ 実施例１におけるカゼインを２．７％溶解した６０係塩
化亜鉛水溶液３５０部の代わりに、大豆分離蛋白質′ｆ
：４．２％溶解した６５％塩化亜鉛水溶液３５０部を用
い、蛋白質−アクリロニトリル共重合体ドープを得た。

この重合体ドープを水平なガラス板上に厚さ５０μｍの
ナイフコーターを用いて均一に拡げ、０℃の３０％塩化
亜鉛水溶液に浸漬して凝固させ、蛋白質−アクリロニト
リル共重合体膜を形成させた。

この膜を十分水洗後、エチルアルコールで洗浄し、引続
きベンゼンで洗浄した。

この膜（１０ＣｒｒｌｘｌＯｃｒｎ）を５％のへキサメ
チレンジイソシアネートのベンゼン溶ｆ’ｔ１５０ ｍ
ｌに浸漬して２時間処理した。

さらにベンゼンにて十分洗浄した後、減圧にてベンゼン
を蒸発させ、直ちにウリカーゼ（東洋紡績社製）１００
〜を溶解したホウ酸緩衝１（ＰＨ８，５）１０ｍｌに０
℃にて浸漬し、０℃にて２４時間保持した後、水洗した
。

このようにして得られた固定化ウリカーゼ膜の活性は０
．００８７単位／ｃｒｒｉであった。

実施例 ４ カゼインを２．７％溶解した６０％塩化亜鉛水溶液３５
０部に、メタアクリル酸メチル５部とスチレン１０部、
さらに重合開始剤として２％亜鴎亜鉛および１．５％過
硫酸亜鉛を含む６０％塩化亜鉛水溶液５０部を加えて、
２０℃にて３時間重合を行ない、粘稠な重合体ドープを
得た。

この重合体ドープを室温で一夜脱泡後、水平に保持した
、平滑で清浄なガラス板上に可変式コーターを用いて２
５０μｍの厚さに流延した。

次に１５〜２０℃の水中に静かにガラス板ごと浸漬し、
ドープを凝固させ、さらに新しい水と交換しなから１昼
夜水洗した。

ガラス板からゲル化した共重合体フィルムを注意深く剥
離し、４０μｍ厚さのポリエステルフィルムをスペーサ
ーとして再びガラス板で支持して風乾した。

この共重合体フィルム″ｆ：４％グルタルアルデヒド水
溶液に浸漬し、室温で３０分処理した。

蒸留水で十分に水洗してから、コレステロールオキシダ
ーゼ（東洋紡製、グレードＩ）２０■と０．０５Ｍリン
酸緩衝液（ＰＨ７，０） ０．２ｙｄからなる酵素溶液
を２５ｃ４の面積に均一に流延し、４℃で６０分共重合
体フィルムと反応させ４１Ｍのグリシンを含む０．０５
Ｍリン酸緩衝液に４℃で２０時間、後処理してから、０
．０５Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ７，０）で十分に洗浄した
。

このようにして得られた固定化コレステロールオキシダ
ーゼ膜の活性は０．０部７単位／ｃｒｒｉであつ九 実施例 ５ 牛血清アルブミン（シグマ社）４％（Ｗ／Ｖ）を含む水
溶液１００部に、酢酸ビニル５部、ノイゲンＨＣ，１部
、重合開始剤として、５％（Ｗ／Ｖ ）亜硫酸ナトリウ
ムおよび５％過硫酸カリウム（Ｗ／Ｖ）の水溶液２部を
加えて窒素気流下、４０℃で５時間重合した。

、得られたドープを実施例４と同様にしてガラス板上に
流延して、室温で１昼夜風乾して厚さ１５μｍの乳白色
の共重合体フィルムを得た。

水中で注意深くフィルムを剥離し、４０μｍ厚さのポリ
エステルフィルムをスペーサーとして再びガラス板で支
持して風乾した。

この共重合体フィルムを４多グルタルアルデヒド水溶液
に浸漬し、室温で３０分処理した。

蒸留水で十分に水洗してから、ウリカーゼ（東洋紡製、
グレードＩ）４０■と帆０５Ｍホウ酸緩衝液（ＰＨ８，
５） ０．２ゴからなる酵素溶液を２５ｃａの面積に均
一に流延し、４℃で１２０分共重合体フィルムと反応さ
せた。

１Ｍのグリシンを含む０．０５Ｍホウ酸緩衝液に浸漬し
４℃で２０時間放置した。

０．０５Ｍホウ酸緩衝液（ＰＨ８，５）で十分に洗浄し
、脱活性０．０００５４単位／ｃｄＨの固定化ウリカー
ゼ膜を得た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 蛋白質−ビニル系単量体グラフト共重合体からなる
   固定化酵素用担体。 ２ 蛋白質−ビニル系単量体グラフト共重合体水溶Ｍ’
   を水中で凝固させ、未延伸状態で乾燥させることを特徴
   とする固定化酵素用担体の製造法。