DK167286B1 - Fremgangsmaade til fremstilling af mikroporoese legemer, der okkluderer et eller flere aktive midler - Google Patents

Description

DK 167286 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af mikroporøse legemer, der okklu-derer ét eller flere aktive midler, hvorved en organisk opløsning af et polymermateriale blandes med det pågæl-5 dende aktive middel, hvorefter den opnåede blanding formes.

Der kendes fremgangsmåder til fremstilling af mikroporøse legemer, der okkluderer et aktivt middel, ved hvilke man, tørt eller i opløsning, emulgerer eller 10 dispergerer det aktive middel i en organisk opløsning af en polymermatriks og derefter formgiver blandingen. Se GB patentskrifter nr. 953 414, 1 453 744 og 1 474 594 samt DE fremlæggelsesskrift nr. 25 52 613.

• Ydermere er det fra italiensk patentskrift nr. 836.462 15 kendt, at det er muligt at immobilisere enzymer og enzym-holdige præparater i det indre af filamentære polymerstrukturer. Fremgangsmaden går ifølge patentskriftet ud på forud at fremstille en emulsion af en vandig opløsning af enzymet og af en opløsning af den polymere op-20 løst i et opløsningsmiddel, der er blandbart med vand, hvilken emulsion derefter ekstruderes gennem en spinde-dyse ind i et koaguleringsbad til dannelse af et filament, der i dets indre okkluderer enzymopløsningen, der indledningsvis var til stede i emulsionen.

25 Herved vindes biologiske katalysatorer med høj ak tivitet, men deres praktiske anvendelighed er ofte begrænset af den form, som de bibringes ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåde, og af fremstillingens relative vanskelighed.

30 Det har nu overraskende vist sig, at man ved i fremgangsmåder som ovenfor nævnt at sætte et additiv til det aktive middel, der aggregerer eller danner tværbindinger i dette, og ved at benytte et medium til disper-gering eller opløsning for det aktive middel, der er 35 blandbart med opløsningsmidlet for polymermaterialet, kan opnå mikroporøse legemer okkluderende et aktivt middel, i en vilkårlig ønsket form, og at det heri okkluderede aktive middel opretholder sin aktivitet længere end ved DK 167286 B1 2 legemer fremstillet uden et sådant additiv.

I overensstemmelse hermed er fremgangsmåden ifølge opfindelsen ejendommelig ved, at polymermaterialet er valgt blandt cellulosepolymere, esterificerede og etherifice-5 rede cellulosepolymere,polyamider,polymere eller copolymere af acryl-nitril, butadien, isopren, acrylater, methacrylater, vinylestre, vi-nylchlorid, vinylidenchlorid, styren, γ-methylglutamat eller kombinationer deraf, at det aktive middel er valgt blandt enzymer, enzymholdige 10 celler, antigener, antistoffer, antisera, hormoner, co-enzymer bundet til makromolekylære matricer, sekvestre-ringsmidler, farvestoffer og kombinationer deraf, at det aktive middel tilsættes et additiv, som aggregerer det aktive middel eller danner tværbindinger heri, valgt 15 blandt a) polymere af forskellig molekylvægt og ikke-opløse-lige i opløsningsmidlet for polymermaterialet, valgt blandt polyaminer som polyethylenimin, kat-ioniske og anioniske polyacrylamider, polyamino- 20 syrer som polylysin, sulfoneret polystyren, poly- carboxylsyrer, polyvinylalkoholer og polyvinyl-pyrrolidon, og b) polyfunktionelle reagenser valgt blandt alifatiske aldehyder, isocyanater og thioisocyanater, hvor- 25 efter den organiske opløsning af polymermaterialet blandes med en dispersion eller opløsning af det aktive middel i et medium, der er blandbart med det organiske opløsningsmiddel for polymermaterialet, og den opnåede blanding formes ved koagulering i et medium, der er et 30 ikke-opløsningsmiddel for polymermaterialet.

Den foreliggende opfindelse angår således en forbedret fremgangsmåde til fremstilling af mikroporøse legemer, der okkluderer et eller flere aktive midler, 35 og navnlig sådanne, der har en biologisk aktivitet, og i en vilkårlig ønsket form, således at deres praktiske anvendelse, dvs. deres anvendelse ved kommerciel gennemførelse af de reaktioner, hvori sådanne midler er involveret, på ingen måde er begrænset. Der vin DK 167286 B1 3 des f.eks. biologiske katalysatorer med høj effektivitet, hvis udnyttelse, netop på grund af de forskellige former, hvori de kan vindes, ikke er ubetinget begrænset af nødvendige praktiske arrangementer.

5 Ved den omhandlede fremgangsmåde er det endvidere muligt at okkludere legemer, der allerede har okkluderet de aktive midler.

Det er også muligt at okkludere andre stoffer stammende fra fysisk eller kemisk forening af aktive midler med 10 passende substrater. Herved bliver det muligt for eksempel at opnå høj beskyttelse for det aktive middel. Det aktive middel kan også okkluderes som sådant eller efter at være suppleret med passende indifferente fyldstoffer. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen har vist sig at være 15 særligt effektiv til fremstilling af biologiske katalysatorer, også på grund af den ovenfor nævnte mulighed af at vinde en sådan katalysator i mange forskellige former.

Det er således blevet muligt at vinde fibre, fibrider, cylindriske legemer af forskellige størrelser, ellipsoi-20 der, sfæriske legemer eller pulvere af mange partikeldimensioner, idet den ønskede form er en funktion af den trinfølge, der følges ved den endelige formningsbehandling.

Formning ved koagulering kan finde sted ved at dryppe blan-25 dingen ind i mediet, hvorved der vindes for eksempel legemer med sfærisk eller sfæroid form, eller ved at lade blandingen strømme direkte ind i det indre af mediet, hvorved der kan vindes fibre eller lignende strukturer.

En alternativ formnirigsmetode er tørekstrudering 30 med fordampning af opløsningsmidlet fra blandingen som ovenfor defineret. Herved vindes et kontinuert filament, der kan tjene til at vinde cylindriske legemer og lignende med tværsnitsformer med forskellige omrids.

DK 167286 B1 4

Endnu en formningsmetode består i uddrivning fra et under tryk stående indelukke, med eller uden hjælp af et fremdrivningsmiddel, af den ovenfor angivne blanding, hvorved der kan opnås dannelse af fibrider eller pulvere 5 med forskellige partikelstørrelser.

Et polymermateriale, der udgøres af celluloseestre har vist sig særligt egnede til formålet for den foreliggende fremgangsmåde.

De medier, hvori de aktive midler skal opløses el-10 ler dispergeres, vælges som nævnt blandt de medier, der er forenelige med det pågældende middel, og som kan blandes med opløsningsmidlet for polymermatricen. De kan vælges fra de følgende klasser af forbindelser, idet de foretrukne er anført i parentes: 1 5 Vand alkoholer (methanol, ethanol, propanol, butanol, tert.-butanol, ethylenglycol, glycerol), ketoner (acetone, methylethylketon), ethere (dioxan, tetrahydrofuran, ethoxyethanol), estre (ethyl- og methyl-acetater, propylacetat, ethyl-formiat og andre), syrer (eddikesyre, propionsyre og myresyre), pyridin, acetonitril, cyclohexan, dimethylformamid.

Opløsningsmidlerne for polymermatricen kan vælges blandt mange forskellige forbindelser, der er forenelige med arten af den pågældende polymermateriale.

Der kan eksempelvis anføres følgende forbindelser:

Acetone, methylisobutylketon, cyclohexanon, methyl-acetat, methylcellosove, ethyllactat, methylenchlorid, propylenchlorid, tetrachlorethan, nitromethan, chlorphe-nol, metacresol, eddikesyre, myresyre, dimethylformamid, dimethylsulfoxid, alkoholer, dioxan, carbonhydrider, såsom benzen, toluen, ketoner, estre, pyridin, chloroform, blandinger af ethanol og vand, ethanol og CCl^, isopropa-^ 5 nol, methylethylketon.

De følgende eksempler skal illustrere opfindelsen.

DK 167286 B1 5

Eksempel 1

Kugler af $-galactooxidase vundet ved at okkludere Saccharomyces lactis-celler.

Der blev fremstillet en 10% opløsning (vægtbasis) 5 af celluloseacetat (Fluka) i acetone (Carlo Erba). Til 375 g af denne polymeropløsning blev der under omrøring sat 154 g cellulær pasta (tørvægt 35,8 g) stammende fra en 2 liters forgæring af Saccharomyces lactis.

Herved vandtes en celledispersion, der efter ind-10 føring i en stålbeholder blev ekstruderet gennem et kapillarrør med en diameter på 0,4 mm ved blot at presse med nitrogen. Den tynde ekstruderede filament blev, efter et fald på ca. 20 cm, omdannet til en perlerække, der ved fald ned i et vandbad blev koaguleret i form af 15 kugler.

Der blev opsamlet ca. 800 g fugtige kugler, der efter tørring i en luftstrøm havde en total vægt på 73 g.

Af disse kugler blev 1 g inkuberet ved 25°C med 200 ml af en opløsning af vandfri lactose (4,75 vægt%), der in-20 deholdt 2 millimol MgS0^,7H20 og 1 millimol EDTA, i en 0,1 molær phosphatpuffer (pH 7). Efter to timers reaktion var 80% af lactosen omdannet til glucose og galactose, som vist ved analysen af glucose foretaget med glucose-prøven (Boehringer).

25 Hydrolysen af lactose med disse kugler blev genta get 20 på hinanden følgende gange, uden at der blev påvist tab i aktivitet.

Eksempel 2 3g Kugler af penicillin-acylase vundet ved at okkludere E.-coli-celler forud behandlet med polyethylenimin.

g E.coli-celler (tørvægt 20 g) indeholdende 1 x 10 enheder blev opslæmmet i 875 g vand og behandlet i 10 minutter under omrøring med 25 g af en 3,3 vægt% opløs-35 ning af polyethylenimin (Polysciences). Der dannedes celleaggregater, som let aflejredes.

DK 167286 B1 6

Celle-pastaen blev derefter atter opslæmmet i et lille volumen vand (total vægt 127 g) og omrørt kraftigt med 157 g af en 10 vægt% opløsning af celluloseacetat (Fluka) i acetone (Carlo Erba). Ved den i Eksempel 1 be-5 skrevne fremgangsmåde blev der fremstillet 35 g kugler (tørvægt). En portion af disse kugler (5 g) blev inkuberet ved 37°C i 400 ml af en opløsning af penicillina G (Squibb), koncentration 6% i 0f02 molær phosphatpuffer (pH 8). Den indledende aktivitet var så høj som 60.000 10 enheder (mikromol pr.time af hydrolyseret penicillin G), og den totale hydrolyse blev opnået på ca. 4 timer. De samme kugler viste sig ved gentagen anvendelse 20 på hinanden følgende gange (hydrolyse) at bevare 60% af deres oprindelige aktivitet.

15

Eksempel 3

Kugler af penicillin-acylase vundet ved at okkludere E.-coli-celler forud behandlet med polyethylenimin og glu-taraldehyd.

g 20 E.coli-celler (tørvægt 20 g) indeholdende 1 x 10 enheder blev opslæmmet i 400 g vand og behandlet under omrøring i 10 minutter med 25 g af en 3f3% opløsning af polyethylenimin (Polysciences, Inc.) og 5 g af en 25% opløsning af glutaraldehyd (Merck).

25 De efter aflejring indsamlede celler blev omrørt kraftigt med 157 g af en 10% opløsning af celluloseacetat (Fluka) i acetone (Carlo Erba).

Fremstillingen af kuglerne foregik ved fremgangsmåden beskrevet i de foregående Eksempler. Der vandtes 40 g 30 tørre kugler# hvoraf en del, 5 g, anvendtes til at bestemme aktiviteten under de samme betingelser som i Eksempel 2. Den udviste aktivitet var 50.000 enheder, og hydrolysen var fuldendt på lidt mere end 4 timer. Til forskel fra kuglerne fremstillet uden glutaraldehyd be-35 varede kuglerne ifølge det foreliggende Eksempel deres aktivitet uændret sammenlignet med den oprindelige aktivitet .

DK 167286 B1 7

Eksempel 4

Kugler af glucose-isomerase vundet ved at okkludere Ar-throbacter sp.-celler forud behandlet med polyacrylamid (Prodefloc A/lS).

5 Til 10 liter af en kulturvæske af Arthrobacter sp.- celler indeholdende glucose-isomerase-enzymet blev der efter endt forgæring sat 500 g af en 0,3% opløsning af Prodefloc A/lS. Celle-opslæmningen blev omrørt i 20 minutter, hvorefter cellerne aflejredes. Cellepastaen (tør-10 vægt 150 g) blev indsamlet og genopslæmmet med vand indtil en total vægt på 600 g og blandet kraftigt med 1500 g af en 10% opløsning af celluloseacetat (Fluka) i acetone (Carlo Erba). Ved fremgangsmåden beskrevet i de foregående Eksempler blev der fremstillet kugler. Af disse 15 kugler blev 1 g inkuberet ved 60°C i 100 ml af en 50 -3 vægt% opløsning af glucose indeholdende 5 x 10 mol MgS04,7H20, 10 4 mol CoCl2 og 0,1 mol Na^SO^, pH 7. Ved polarimetriske målinger bestemtes aktiviteten til 100 internationale enheder (mikromol fruktose fremstillet på 20 1 minut) med et udbytte (udfoldet aktivitet/okkluderet aktivitet) på 56%. Disse kugler mistede ikke deres aktivitet ved kontinuert anvendelse 20 på hinanden følgende gange under forsøgsbetingelserne.

2^ Eksempel 5

Kugler af glucose-isomerase vundet ved at okkludere enzymet i opløsning efter behandling med polyethylenimin og glutaraldehyd.

Enzymopløsningen blev fremstillet ved at opløse 2 g 3Q glucose-isomerase-pulver (Godo Shusei) i 8 g vand. Til denne opløsning blev der under omrøring sat 4 g af en 3,3% opløsning af polyethylenimin (Polysciences, Inc.) og 4 g af en 2,5% opløsning af glutaraldehyd (Merck).

Dette enzyn-præparat blev blandet med 100 g af en 10% 35 opløsning af celluloseacetat (Fluka) i acetone (Carlo Erba) ved stuetemperatur. Ved fremgangsmåden beskrevet i de foregående Eksempler blev der fremstillet kugler, hvis DK 167286 B1 8 vægt efter tørring i luft var 12 g. En del af disse kugler (2 g) blev inkuberet ved 60°C med 100 ml af en 50 -3 vægt%'s opløsning af glucose indeholdende 5 x 10 mol MgSO^jTE^O, 10 ^ mol C0CI2 og 0,1 mol ^280.3/ pH 7, til 5 bestemmelse af aktiviteten, der var 500 internationale enheder med et udbytte på 30-40%.

Eksempel 6

Cylindriske legemer af celluloseacetat okkluderende poly 10 ethylenimin som sekvestreringsmiddel.

15 g Celluloseacetat (Fluka) blev opløst med 85 g acetone (Carlo Erba, rent reagens). Til polymeropløsningen blev der langsomt under omrøring sat 15 g af en 33 vægt% vandig opløsning af polyethyleniminhydrochlorid 15 (Polysciences, Inc.) og 5 g af en 1% opløsning af glu-taraldehyd (Merck). Blandingen blev overført til en stål-cylinder, der ved toppen var forbundet med en nitrogenflaske og ved bunden med en spindedyse neddykket i et vandbad. Ved hjælp af nitrogentryk passerede blandingen 20 fra spindedysen og koagulerede, hvorved vandtes et kontinuert filament. Dette blev med et skæreorgan opdelt i prøver med en længde på 1-2 cm. Af disse cylindriske legemer blev 1 g i 4 timer bragt i kontakt med en cupriop-løsning med en koncentration på 18,3 ppm vundet ved at 25 opløse CuS04,5H20 i destilleret vand. Med et atomabsorp-tions-spektrofotometer (Varian-Techtron 1200) måltes kobberindholdet (1,1 ppm) i den med cylindrene behandlede opløsning. Efter vask af cylindrene med 50 ml IN HC1 fandtes 17 ppm af kobber.

30 Cylindrene blev atter i 4 timer bragt i kontakt med kobberopløsningen omtalt ovenfor, og kobberindholdet i opløsningen måltes igen og fandtes at være 1,2 ppm.

Denne operationsrække blev gentaget 10 gange, og det fremgik, at cylindrene ikke mistede deres kobbersekve-3 5 strerende evne.

DK 167286 B1 9

Eksempel 7

Fibrider af invertase vundet ved at okkludere enzymet i en opløsning, hvortil der var sat polyvinylpyrrolidon.

En opløsning (50 g) af invertase (B-D.H.) blev ef-5 ter tilsætning af 10 g polyvinylpyrrolidon (K30, Fluka) omrørt kraftigt med 333 g af en 10%'s opløsning af celluloseacetat (Fluka) i acetone (Carlo Erba) . Præparatet blev efter indføring i en autoklav ekstruderet ved hjælp af nitrogentryk (50 atm.) gennem en dyse på 500 mikron, Ί0 Qg ^β2Γ blev opsamlet et tørt pulver af fibridtype, hvis partikelstørrelse lå inden for området 160-1600 mikron. Aktiviteten af invertase-enzymet okkluderet i fibriderne blev målt på en opløsning af 20% sucrose i en 0,1 molær phosphatpuffer, pH 4, ved 25°C. Aktiviteten udtrykt i mg ^ af inverteret sucrose pr.minut og pr.gram af fibrid lå inden for området 8-50 alt efter fibrid-størrelsen.

Eksempel 8

Fibre af hydroxypyrimidin-hydrolase og N-carbamoyl-D-aminosyre-hydrolase vundet ved at okkludere Agrobacterx-um radiobacter-celler, hvortil der var sat polyethyleni-min.

Agrobacterium radiobacter-celler (tørvægt 4 g) blev opslæmmet i 100 g vand og under omrøring behandlet med 2 g af en 3% opløsning af polyethylenimin (Poly-sciences, Inc.). Efter 10 minutter blev omrøring standset, og de celler, der var aflejret, blev indsamlet og opslæmmet i 25 g vand. Opslæmningen blev omrørt kraftigt med 20 g af en 20% opløsning af celluloseacetat (Fluka) 30 i acetone (Carlo Erba). Præparatet blev derefter indført i en stålcylinder, der ved toppen var forbundet med en nitrogenflaske og ved bunden var forbundet til en monofilament- spindedyse (diameter 1 mm) . Ved hjælp af en doseringspumpe blev præparatet ekstruderet gennem spinde-35 dysen i form af et kontinuert filament, der fik lov at tørre i atmosfærisk luft ved fordampning af acetone un-

Claims (3)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af mikroporøse legemer, der okkluderer ét eller flere aktive midler, 15 hvorved en organisk opløsning af et polymermateriale blandes med det pågældende aktive middel, hvorefter den opnåede blanding formes, kendetegnet ved, at polymermaterialet er valgt blandt cellulosepolymere, esterificerede og etherif icerede cellulosepolymere, polyami-20 der, polymere eller copolymere af acrylnitril, butadien, isopren, acrylater, methacrylater, vinylestre, vinyl-chlorid, vinylidenchlorid, styren, γ-methylglutamat eller kombinationer deraf, at det aktive middel er valgt blandt enzymer, enzymholdige 25 celler, antigener, antistoffer, antisera, hormoner, co-enzymer bundet til makromolekylære matricer, sekvestre-ringsmidler, farvestoffer og kombinationer deraf, at det aktive middel tilsættes et additiv, som aggregerer det aktive middel eller danner tværbindinger heri, valgt 30 blandt a) polymere af forskellig molekylvægt og ikke-opløse-lige i opløsningsmidlet for polymermaterialet, valgt blandt polyaminer som polyethylenimin, kat-ioniske og anioniske polyacrylamider, polyamino-35 syrer som polylysin, sulfoneret polystyren, poly- carboxylsyrer, polyvinylalkoholer og polyvinyl-pyrrolidon, og DK 167286 B1 11 b) polyfunktionelle reagenser valgt blandt alifatiske aldehyder, isocyanater og thioisocyanater, hvorefter den organiske opløsning af polymermaterialet blandes med en dispersion eller opløsning af det aktive mid-5 del i et medium, der er blandbart med det organiske opløsningsmiddel for polymermaterialet, og den opnåede blanding formes ved koagulering i et medium, der er et ikke-opløsningsmiddel for polymermaterialet.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendeteg-10 net ved, at koaguleringen finder sted ved at dryppe blandingen ind i mediet til opnåelse af legemer med sfærisk eller sfæroid form, eller ved at lade blandingen flyde direkte ind i det indre af mediet til opnåelse af fibre eller fiberagtige strukturer. 15

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, ken detegnet ved, at polymermaterialet udgøres af celluloseestere.