NO161077B - Fremgangsmaate for fremstilling av mikroporoese legemer somokkluderer ett eller flere aktive midler. - Google Patents

Abstract

En ny metode for tildanning av mikroporøse legemer som i deres indre okkluderer aktive midler, som f.eks. enzymer. Metoden omfatter trinnet med a sammenblande en polymerløsning med det angjeldende aktive middel, opplost eller dispergert i en flytende fase sorr, er forlikelig og blandbar med det løsningsmiddel som anvendes for opplesning av polymeren.Den endelige form for de mikroporøse legemer kan meddeles ved ekstrudering, drypping eller på annen måte-

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av mikroporøse legemer som okkluderer ett eller flere aktive midler, hvorved en løsning av et polymert material i et organisk løsningsmiddel blandes med det aktive middel, hvoretter den oppnådde blanding formes, og det

særegne ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er at polymermaterialet utgjøres av cellulosepolymerer, forestrede eller foretrede cellulosepolymerer, polyamider, polymerer eller kopolymerer av akrylnitril, butadien, isopren , akrylater, metakrylater, vinylestere, vinylklorid, vinylidenklorid, styren, 'y-metylglutamat eller kombinasjoner derav,

- det aktive middel utgjøres av enzymer, enzymholdige celler, antigener, antistoff, antisera, hormoner, koenzymer bundet til makromolekylære forbindelser, sekvestreringsmidler, fargestoff eller kombinasjoner derav, - det aktive middel tilsettes en substans som aggregerer eller danner tverrbindinger i det aktive middel, valgt blant a) polymerer med ulik molekylvekt som ikke er opp-løselige i løsningsmiddelet for polymermaterialet og valgt blant polyaminer som polyetylenimin, kationiske og anioniske polyakrylamider, polyaminosyrer som polylysin, sulfonert polystyren, polykarboksylsyrer, polyvinylalkoholer og polyvinylpyrrolidon, og b) polyfunksjonelle forbindelser valgt blant alifatiske aldehyder, isocyanater og tioisocyanater, - hvoretter løsningen av polymermaterialet i det organiske løsningsmiddel blandes med en dispersjon eller løsning av det aktive middel i et medium som er blandbart med det organiske løsningsmiddel, og - den oppnådde blanding formes ved koagulering i et medium som ikke er et løsningsmiddel for polymermaterialet.

Disse og andre trekk ved oppfinnelsen fremgår av patent-kravene.

Det er fra italiensk patentskrift 836.482 kjent at det er mulig å immobilisere enzymer og preparater inneholdende dem i det indre av filamentære polymere strukturer. Den angjeldende prosess innebærer at det først fremstilles en emulsjon av en vandig løsning av enzymet og av en oppløsning av polymeren oppløst i et løsningsmiddel som er ikke-blandbart med vann, idet emulsjonen deretter ekstruderes gjennom en spinnedyse i et koagulasjonsbad for å frembringe et filament som i sitt indre okkluderer den enzymatiske oppløsning som til å begynne med var tilstede i emulsjonen.

Ved å gå frem på denne måte oppnås biologiske katalysatorer, som har en høy aktivitet, men deres praktiske brukbarhet er ofte begrenset ved den form de er gitt ved den ovenfor skisserte prosess og ved; den forholdsvis komplekse fremstil-lingsmåte .

Den foreliggende oppfinnelse vedrører således en forbedret fremgangsmåte for fremstilling av mikroporøse legemer som okkluderer ett eller flere aktive midler og spesielt slike som fremviser en biologisk aktivitet, og i enhver valgt form, slik at deres praktiskejanvendelse, d.v.s. deres anvendelse ved den kommersielle gjennomføring av reaksjoner hvori slike midler,inngår, ikke på noen måte begrenses. Det oppnås f.eks.<!>biologiske katalysatorer med en høy virkningsgrad og hvis utnyttelse ikke absolutt er begrenset ved praktiske foranstaltninger som de; må underkastes, nettopp på grunn av de forskjellige former hvori de kan oppnås.

Ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er det også mulig å okkludere legemer som allerede har okkludert de aktive midler en gang til. Det er også mulig å okkludere andre substanser avledet fra den fysikalske eller kjemiske forening av aktive midler med passende substrater. Ved å gjøre dette blir det f:.eks. mulig å oppnå en høy beskyttelse for det aktive middel.' Det aktive middel kan også okkluderes som sådant, eller etter at det er supplert med passende inerte fyllstoffer, fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen har vist seg å være spesielt effektiv for fremstilling av biologiske katalysatorer, også på grunn av den ovenfor skisserte mulighet til å oppnå disse katalysatorer med svært variert form. Det er'således blitt mulig å oppnå fibre, fibrider, sylindriske|legemer av forskjellige størrelser, ellipsoider, kuleformede legemer og pulvere med mange kornstørrelser, i og med at den ønskede form er en funksjon av sekvensen av trinn som følges i den endelige formebehand-ling.

Forming ved koagulering kan foregå ved å dryppe blandingen inn i mediet og det kan oppnås f.eks. legemer med en :sfærisk eller sfæroidal form, eller ved at man lar blandingen strømme direkte inn i det indre av mediet, slik at det kan oppnås fibre eller lignende strukturer.

En alternativ formemetode er tørrekstrudering med avdamping av løsningsmiddelet i blandingen som definert ovenfor. Det oppnås således et kontinuerlig filament, som kan oppdeles for oppnåelse av sylindriske legemer og lignende med tverrsnitts-former ved forskjellige konturer.

En ytterligere formemetode er utsprøyting fra et lukket rom, med eller uten bruk av et drivmiddel, av blandingen angitt ovenfor, slik at det dannes fibrider eller pulvere med forskjellige kornstørrelser.

Et polymermaterial som utgjøres av celluloseesterne har vist seg å være spesielt egnet for oppfinnelsens formål.

De medier hvori de aktive midler oppløses eller dispergeres velges blant dem som er forlikelige med angjeldende middel og som er blandbare med løsningsmiddelet for polymermaterialet.

De kan velges fra følgende grupper av forbindelser, idet de foretrukne grupper er inkludert i parentesene:

vann,

alkoholer (metanol, etanol, propanol, butanol, tert.-butanol, etylenglykol, glyserol),

ketoner (aceton, metyletylketon),

etere (dioksan, tetrahydrofuran, etoksyetanol),

estere (etyl- og metylacetat, propylacetat, etylformat og andre),

syrer (eddiksyre, propionsyre og maursyre), pyridin, acetonitril, cykloheksan, dimetylformåmid.

I sin tur kan løsningsmidlene for polymermaterialet velges innenfor en rekke forbindelser, i samsvar med naturen av angjeldende polymermaterial, som f.eks.: Aceton,.; metylisobutylketon, cykloheksanon, metylacetat, metylcéllosolve, etyllaktat, metylenklorid, propylenklorid, tetrakloretan, nitrometan, klorfenol, metakresol, eddiksyre,

i

maursyre, dimetylformamid; dimetylsulfoksyd, alkoholer, dioksan, hydrokarboner som benzen, toluen, ketoner, estere, pyridin, kloroform, blandinger av etanol og vann, etanol og CCI4, isopropanol, metyletylketon.

De etterfølgende eksempler er gitt for å illustrere oppfinnelsen.

EKSEMPEL 1 - Kuler av beta- aalaktooksvdase oppnådd ved

okkluderina av celler av Saccharomvces lactis. En 10 vekt% løsning av celluloseacetat i aceton fremstilles.

375 g av denne polymerløsning forsynes med 154 g cellepasta (tørrvekt 35,8 g) som kommer fra 2 liter fermentering av Saccharomyces lactis under omrøring.

Det oppnås således en celledispersjon som innført i en stålbeholder ekstruderes! gjennom et kapillarrør med en diameter på 0,4 mm ved enkel utøvelse av et nitrogentrykk.

1

Det tynne ekstruderte filament omdannes til en krans av kuler etter et fall på omtrent 20 cm, som ved å falle inn i vannbadet koaguleres i form av kuler.

Det samles omtrent 800 g fuktige kuler som ved tørking i en luftstrøm veier totalt 73 g. 1 g av disse kuler inkuberes ved 25°C med 200 ml av en løsning av vannfri laktose (4,75 vekt%) som inneholder 2' millimol MgSC>4.H20, 1 millimol EDTA, i en 0,1 molar, pH 7 fosfatbuffer. Etter en to timers reaksjon er 80 % av laktosen blitt omdannet til glukose og galaktose som vist ved analyse av glukose gjennomført med en glukosétest.

Hydrolyse av laktose med disse kuler ble gjentatt 20

i

t

påfølgende ganger uten påvisning av noe aktivitetstap.

EKSEMPEL 2 - Kuler av penicillinacvlase oppnådd ved okkluderina av celler av E.coll. på forhånd

behandlet med <p>olvetvlenimin.

Celler av E.coli (tørr vekt 20 g) inneholdende 1.10^ enheter oppslemmes i 87 5 g vann og behandles i ti minutter under omrøring med 25 g av en 3,3 vekt% løsning av polyetylenimin. Dannelse av celleaggregater som avsettes lett iakttas.

Cellepastaen oppslemmes så på nytt i et lite volum vann (total vekt 127 g) og omrøres kraftig med 157 g av en 10 vekt% oppløsning av celluloseacetat i aceton. I henhold til metoden beskrevet i eksempel 1 ovenfor fremstilles 35 g kuler (tørr vekt). En del av disse kuler (5 g) inkuberes ved 37°C i 400 ml av en oppløsning av penicillin G 6 % konsentrasjon i 0,02 molar, pH 8 fosfatbuffer. Den initiale aktivitet som utvises er så mye som 60.000 enheter (mikromol pr. time hydrolysert penicillin G), og den totale hydrolyse oppnås i løpet av omtrent fire timer. De samme kuler, ved fornyet anvendelse 20 påfølgende ganger (hydrolyse), bibeholder 60 % av deres initiale aktivitet.

EKSEMPEL 3 - Kuler av peniccillinacvlase oppnådd ved okkluderina av celler av E. coli. på forhånd

behandlet med <p>olvetvlenimin oa alutaraldehvd. Celler av E.coli (tørr vekt 20 g) inneholdende 1.10<6> enheter, oppslemmes i 400 g vann og behandles under omrøring i ti minutter med 25 g av en 3,3 vekt% løsning av polyetylenimin og 5 g av en 25 vekt% løsning av glutaraldehyd.

Cellene oppsamlet etter avsetning omrøres kraftig med 157 g av en 10 vekt% løsning av celluloseacetat i aceton.

Fremstillingen av kulene utføres i henhold til metoden beskrevet i de foregående eksempler. Det oppnås 40 g tørre kuler, hvorav en del på 5 g anvendes for bestemmelse av aktiviteten under de samme betingelser som i eksempel 2. Den utviste aktivitet er 50.000 enheter og hydrolysen fullføres i løpet av bare litt over fire timer. -Til forskjell fra kulene fremstilt uten glutaraldehyd ibibeholder kulene i dette eksempel deres aktivitet uendret i forhold til den initiale.

EKSEMPEL 4 - Kuler av <g>lukoseisomerase oppnådd ved okkluderina av celler av Arthrobacter sp., på

forhånd behandlet med polvakrvlamid.

Til 10 liter av en dyrkingskultur av celler av Arthrobacter sp. inneholdende glukoseisoméraseenzym tilsettes etter fullført gjæring 500 g av en1 0,3 vekt% løsning av poly-akrylamid. Celledispersjonen omrøres i 20 minutter hvoretter cellene får avsettes. Cellepastaen (tørr vekt 150 g) samles og oppslemmes på nytt med vann inntil det oppnås en total vekt på 600 g og omrøres kraftig med 1500 g av en 10 vekt% løsning av celluloseacetat i aceton. Kulene fremstilles i henhold til metoden omhandlét i det foregående eksempel .

1 g av disse kuler inkuberes ved 60°C i 100 ml av en 50 vekt%

-3 oppløsning av glukose inneholdende 5.10 mol MgS04.7H20, 10~<4> mol C0CI2» 0,1 mol Na2S03, pH 7. Ved polarimetriske målinger bestemmes aktiviteten i 100 internasjonale enheter (mikromol fruktose fremstilt i løpet av ett minutt) med et utbytte (utfoldet aktivitet/okkludert aktivitet) på 56 %. Disse kuler mister ikke sin aktivitet ved kontinuerlig anvendelse i 20 døgn under testbetingelsene. EKSEMPEL 5 - Kuler av glukoseisomerase oppnådd ved okkluderina av enzymet i løsning ved behandling med polyet<y>lenimin og <g>lutaraldehvd. Enzymløsningen fremstilles ved oppløsning av 2 g glukoseiso-merasepulver i 8 g vann. Denne oppløsning tilføres under omrøring 4 g av en 3,3 vekt% løsning av polyetylenimin og 4 g av en 2,5 vekt% løsning av glutaraldehyd. Dette enzymprepa-rat blandes med 100 g av en 10 vekt% løsning av celluloseacetat i aceton ved romtemperatur. I henhold til metoden beskrevet i de foregående eksempler fremstilles kuler med en vekt på 12 g etter tørking i luft. En del av disse kuler (2 g) inkuberes ved 60°C med 100 ml av en 50 vekt% løsning av -3 -4 glukose inneholdende 5.10 mol MgS04.7H20, 10 mol C0CI2, .Aul .mol Itfa2S03 ,^ j?H 1, f pr bestemmelse av aktiviteten som er 500 internasjonale enheter, med et utbytte på 30 - 40 %.

EKSEMPEL 6 - Sylindriske legemer av celluloseacetat som okkluderer polvetvlenimin som et sekvestrerende middel.

15 g celluloseacetat oppløses i 85 g aceton. Til polymerløs-ningen tilsettes sakte og under omrøring 15 g av en 33 vekt% vandig løsning av polyetyleniminhydroklorid og 5 g av en 1 vekt% løsning av glutaraldehyd. Blandingen overføres i en

stålsylinder som på toppen er forbundet med en nitrogenflaske og ved bunnen med en spinnedyse neddykket i et vannbad. Ved å utøve nitrogentrykk kommer blandingen ut fra spinnedysen og koagulerer slik at det oppnås et kontinuerlig filament.

Dette kuttes opp ved hjelp av en kutteinnretning i stykker med lengde 1-2 cm. 1 g av disse sylindriske legemer bringes i fire timer i kontakt med en kobbersaltløsning med en konsentrasjon på 18,3 deler pr. million (ppm) ved oppløsning av CUSO4.5H2O i destillert vann. Med et atomab-sorpsjonspektrofotometer ble kobberinnholdet (1,1 ppm) i oppløsningen som behandles med sylindrene målt. Etter vasking av sylindrene med 50 ml 1-N HC1 finnes 17 ppm kobber.

Sylindrene bringes på nytt i kontakt i fire timer med den ovennevnte^ kobberløsning og kobberinnholdet i oppløsningen måles en gang til og finnes å være 1,2 ppm. Denne opera-sjonssekvens gjentas ti ganger og det sees at sylindrene ikke mister sin kobbersekvestreringsevne.

EKSEMPEL 7 - Fibrider av invertase oppnådd ved okkluderina av enzymet i en løsnin<g> hvortil <p>olvvinyl-pvrrolidon er blitt tilsatt.

En løsning (50 g) av invertase etter tilsetning av 10 g polyvinylpyrrolidon omrøres kraftig med 333 g av en 15 vekt% løsning av celluloseacetat i aceton. Preparatet, innført i en autoklav, ekstruderes med nitrogentrykk (50 atm) gjennom 500 mikrometers dyse og et tørt pulver oppsamles av fibrid-typen, med partikkelstørrelse i området 160 til 1600

mikrometer. Aktiviteten av invertaseenzymet okkludert i

Claims (3)

1. fibridene ble målt på en løsning av 20 % sukrose i en 0,1 molar, pH 4 fosfatbuffer ved 25°C. Aktiviteten uttrykt som mg invertert sukrose pr. minutt og pr. gram (g) av fibrid ligger i området 8 til 50, avhengig av fibridstørrelsen. EKSEMPEL 8 - Fibre av hydroksv<p>vrimidinhvdrolase oa N-

   karbamovl- D- aminosvrehvdrolase oppnådd ved okkluderina av celler av Aarobacterium radiobacter hvortil polvetvlenimin er blitt

   tilsatt. Celler av Agrobacterium radiobacter (tørr vekt 4 g) oppslemmes i 100 g vann og behandles under omrøring med 2 g av en 3 vekt% løsning av polyetylenimin. Etter ti minutter avbrytes omrøringen og cellene som er avsatt samles og oppslemmes i 25 g vann. Oppslemmingen omrøres kraftig med 20 g av en 20 vekt% løsning av celluloseacetat i aceton. Preparatet innføres i en stålsylinder, på toppen forbundet med en nitrogenflaske og ved bunnen til en monofilament-spinnedyse (diameter 1 mm). Ved hjelp av en doseringspumpe ekstruderes preparatet gjennom spinnedysen i form av et kontinuerlig filament som tillates å tørke i luften ved avdestillering av aceton under et fall på 4 meter. Hele filamentet (tørr vekt 8 g) inkuberes ved 40°C under en nitrogenatomosfære i 0,1 molar, pH 8 fosfatbuffer inneholdende 4 g DL-fenylhydantoin for bestemmelse av aktiviteten av de to enzymer. Etter 20 timers reaksjon oppnås fullstendig omdannelse av hydantoinet til D(-)-fenylglysin som vist ved analysen foretatt på en aminosyreanalysator. Det samme filament, anvendt ti ganger for like mange påfølgende hydrolyser, mistet 30 % av den initiale aktivitet. 1. Fremgangsmåte for fremstilling av mikroporøse legemer som okkluderer ett eller flere aktive midler, hvorved en løsning av et polymert material i :et organisk løsningsmiddel blandes med det aktive middel, hvoretter den oppnådde blanding formes,

   karakterisert ved at polymermaterialet utgjøres av cellulosepolymerer, forestrede eller\foretrede cellulosepolymerer, polyamider, polymerer éLler^opolymerer av akrylnitril, butadien, isopren-, akrylateir, metakrylater, vinylestere, vinylklorid, vinylidenklorid, styren, 7— metylglutamat eller kombinasjoner derav, - det aktive middel utgjøres av enzymer, enzymholdige celler, antigener, antistoff, antisera, hormoner, koenzymer bundet til makromolekylære forbindelser, sekvestreringsmidler,

   fargestoff eller kombinasjoner derav, - det aktive middel tilsettes en substans som aggregerer eller danner tverrbindinger i det aktive middel, valgt blant a) polymerer med ulik molekylvekt som ikke er opp-løselige i løsningsmiddelet for polymermaterialet og valgt blant polyaminer som polyetylenimin, kationiske og anioniske polyakrylamider, polyaminosyrer som polylysin, sulfonert polystyren, polykarboksylsyrer, polyvinylalkoholer og polyvinylpyrrolidon, og b) polyfunksjonelle forbindelser valgt blant alifatiske aldehyder, isocyanater og tioisocyanater, - hvoretter løsningen av polymermaterialet i det organiske løsningsmiddel blandes med en dispersjon eller løsning av det aktive middel i et medium som er blandbart med det organiske løsningsmiddel, og - den oppnådde blanding formes ved koagulering i et medium som ikke er et løsningsmiddel for polymermaterialet.
2. 2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at blandingen koaguleres ved at den dryppes inn i mediet, idet legemer med sfærisk eller sfæroidal form oppnås, eller ved at man lar blandingen strømme direkte inn i det indre av mediet idet fibrer eller lignende strukturer oppnås.
3. 3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at polymermaterialet utgjøres av celluloseestere.