JP2656108B2

JP2656108B2 - 固定化酵素及びその製造方法

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Publication number: JP2656108B2
Application number: JP8574389A
Authority: JP
Inventors: 光堀本; 隆之緒方
Original assignee: Tokuyama Corp
Current assignee: Tokuyama Corp
Priority date: 1988-12-26
Filing date: 1989-04-06
Publication date: 1997-09-24
Anticipated expiration: 2012-09-24
Also published as: JPH02257882A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、新規な固定化酵素及びその製造方法に関す
る。詳しくは、高い酵素活性を有すると共に長寿命を達
成し得る固定化酵素及びその製造方法に関する。

〔従来の技術〕

酵素の固定化は、酵素を利用した反応により得られる
反応生成物からの酵素の分離を容易とし、酵素の反復利
用を行う上で酵素反応の工業的実施に欠くことのできな
い技術である。従来、酵素の固定化方法は大きく分けて
架橋法、包括法、担体結合法など、いくつか知られてい
る。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、高い酵素活性を有し、かつ長寿命の固
定化酵素を得ることのできる工業的な方法は見いだされ
ていない。これは、長期間にわたり失活することなく確
実に酵素を固定化し得ることと、高い酵素活性を発揮す
ることは一般に相反する特性とされており、両者を両立
させることは困難であるということによるものである。
即ち、一般に酵素を担体結合法等で強固に固定した場合
には寿命が長くなる反面、酵素固定量が限られる上に活
性低下を伴う場合が多く、全体の酵素活性は低くなる傾
向がある。逆に包括法等のように比較的弱く固定すると
高い酵素活性が得られるものの、固定が弱いため寿命は
短くなる場合が多い。

本発明者らは、上記した従来の酵素の固定化方法の欠
点を解決すべく研究を重ねた結果、膨潤状態にある、ポ
リパラベンズアミドおよびポリ塩化ビニルの組成物より
なる成形体に酵素を担持させることにより、高活性かつ
長寿命の固定化酵素が得られることを見い出し、本発明
を完成するに至った。

〔課題を解決するための手段〕

即ち、本発明は、膨潤状態にある、ポリパラベンズア
ミドおよびポリ塩化ビニルの組成物よりなる成形体に酵
素を担持してなる固定化酵素の製造方法である。

本発明において、ポリパラベンズアミドは、式で表される反復単位を有する重合体及び上記反復単位を
70モル％以上含有し、共重合体を30モル％以下の割合で
含有するポリアミド共重合体が好適に使用される。かか
る共重合単位としては例えば、式（但し、Ｚはフェニレン基以外の二価の有機基を示し、
Ｑ及びＱ′は水素、脂肪族炭化水素残基又は芳香族炭化
水素残基を示し、Ｒ及びＲ′は二価の有機基を表し、Ｙ
及びＹ′はである。）で表わされる共重合単位が好適である。これ
らの共重合体は例えば特公昭45−36852号等により公知
であり、本発明においては、これら公知の共重合体が特
に制限なく使用し得る。

また、本発明において、ポリ塩化ビニルは、特に制限
されるものではなく、塩化ビニル単独重合体および塩化
ビニルと共重合しうるエチレン性不飽和単量体を30モル
％以下の和割合で含有する共重合体およびその誘導体が
特に限定されず使用される。上記の塩化ビニルと共重合
しうるエチレン性不飽和単量体も特に限定されるもので
はないが、代表的なものを例示すれば、エチレン、プロ
ピレン等のオレフィン化合物；酢酸ビニル、プロピオン
酸等のビニルエステル類；アクリル酸、メタクリル酸、
アクリル酸メチル、メタクリル酸メチル、アクリル酸ブ
チル、アクリル酸アミド、メタクリル酸アミド等の不飽
和モノカルボン酸、そのアルキルエステル類及びそのア
ミド類；アクリロニトリル等の不飽和ニトリル類；マレ
イン酸、フマール酸等の不飽和ジカルボン酸及びそのア
ルキルエステル類；ビニルメチルエーテル、ビニルエチ
ルエーテル等のビニルアルキルエーテル類；及びその無
水物；等が好適に使用される。

本発明において、ポリパラベンズアミドおよびポリ塩
化ビニルの組成物（以下、PPBA−PVC組成物という）
は、各成分が均一に混合された状態で成形可能なもので
あれば特に制限されない。例えば、組成比は、後記する
膨潤状態にある多孔性成形体の成形を容易にするため
に、ポリパラベンズアミド／ポリ塩化ビニルの重量比が
20/80〜80/20、好ましくは30/70〜70/30の範囲となるよ
うに調整することが好ましい。

上記PPBA−PVC組成物よりなる成形体は、酵素の活性
をより高めるために微多孔を有するものが好適である。
かかる微多孔の径は、内部に酵素を保持し得る大きさで
あれば特に制限されないが、一般に酵素の相当径に対し
て30〜100000％、好ましくは50〜10000％となる大きさ
が好適である。尚、酵素の相当径に対して径が小さい微
多孔を有する固定化酵素は、後記する方法により酵素を
固定化した微多孔性成形体を乾燥収縮させて得ることが
できる。

また、成形体の微多孔の容積は、酵素を高濃度で固定
化するために、大きい程好ましいが、一般には単位容積
当りの孔の容積が、80〜99.5容量％、好ましくは95〜99
容量％となるように決定することが好ましい。

また、上記の微多孔性成形体の形状は、得られる固定
化酵素の使用状態に応じて適宜決定される。例えば、膜
状、球状、俵状、板状、棒状、繊維状等が一般的であ
る。

本発明において、上記PPBA−PVC組成物よりなる成形
体に酵素を担持させる手段は特に制限されない。即ち、
PPBA−PVC組成物よりなる成形体は、酵素に対する親和
性が良好であり、該成形体に酵素をそのまま担持させて
も、高い酵素活性を有する長寿命の固定化酵素を得るこ
とができる。しかしながら、更に確実に長寿命を達成す
るために、担持された一部の酵素同志、或いは一部の酵
素とPPBA−PVC組成物よりなる成形体とを、ジアゾ結
合、アミド結合、アゾメチン結合等の化学結合により結
合することが好ましい。また、PPBA−PVC組成物の乾燥
収縮する特性を利用して、酵素を担持させた微多孔性成
形体を乾燥収縮させて、収縮された微多孔により酵素を
担持することも、得られる固定化酵素の寿命を更に伸ば
す上で好ましい態様である。

本発明において使用する酵素は特に限定されず、目的
に応じて公知の酵素が適宜選択される。代表的な酵素と
しては、たとえばグルコースオキシダーゼ、ガラクトー
スオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ウリカ
ーゼ、アルコールオキシダーゼ、リパーセ、乳酸デヒド
ロゲナーゼ、アミノアシラーゼ、ウレアーゼ等が挙げら
れる。

また、成形体中への酵素の保持量は特に制限されるも
のではなく、得られる固定化酵素の使用目的に応じて適
宜決定すればよい。

また、本発明の固定化酵素は、PPBA−PVCよりなる成
形体中に繊維状物を分散させることにより、乾燥による
酵素活性の低下などの性能劣化を防ぐ性能（以下、耐乾
燥性という）を発揮でき好ましい。

上記の繊維状物の大きさは、特に制限されないが、一
般に、直径（Ｄ）が0.01〜500μｍ、好ましくは0.1〜10
0μｍ、長さ（Ｌ）が１〜5000μｍ、好ましくは、５〜1
000μｍで且つL/Dが２〜100000、好ましくは10〜10000
の範囲が特に好適である。また、繊維状物の配合量は、
PPBA−PVC組成物に対して、0.1〜50重量％、好ましくは
５〜25重量％が適当である。更に、繊維状物の材質も、
特に制限されるものではない。代表的なものを例示すれ
ば、ガラス、金属等の無機繊維、セルロース等の植物繊
維、ポリアミド、ポリプロピレン、ポリエチレン等の合
成繊維、絹等のタンパク繊維等の有機繊維などが挙げら
れる。これらの材質のうち、特にガラスが好適である。

本発明の固定化酵素の製造方法は特に制限されるもの
ではないが、例えば、膨潤状態にある、ポリパラベンズ
アミドおよびポリ塩化ビニルの組成物よりなる成形体に
酵素を担持させた後、該成形体を乾燥する方法が好適で
ある。

上記した方法において、膨潤状態にあるPPBA−PVC組
成物よりなる成形体の製造方法として、代表的な方法を
例示すれば、例えば特公昭62−55534号公報に記載の方
法が挙げられる。即ち、PPBA−PVC組成物を含む溶液を
膜状等の所望の形状に成形した後、該溶媒を貧溶媒で置
換する方法が好適である。

一般に、貧溶媒を包含するPPBA−PVC組成物の成形体
は、一旦これを乾燥すると収縮する。かかる収縮は、水
等の溶媒に接触しても膨潤することのない非可逆的な収
縮である。本明細書において、膨潤状態にあるPPBA−PV
C組成物よりなる成形体とは、上記収縮する前の状態に
ある該成形体を意味する。

前記のPPBA−PVC組成物を含む溶液を調製するための
溶媒としては、ポリパラベンズアミドおよびポリ塩化ビ
ニルを共に溶解し得る共通溶媒、或いは、ポリパラベン
ズアミドとポリ塩化ビニルの各々に対して溶解性を示す
選択的溶媒が使用し得る。即ち、PPBA−PVC組成物を含
む溶液を調製する方法において、用いる溶媒は、必ずし
も共通溶媒を用いることが必要ではなく、それぞれにつ
いて選択的溶媒を用いることが可能である。後者の場
合、夫々のポリマーの溶液を調製した後、両者を混合す
る方法により上記溶液を容易に得ることが可能である。

上記の溶媒として好適なものを例示すれば、ポリパラ
ベンズアミドには塩化リチウムまたは塩化カルシウムの
ごとき無機塩を0.5〜10重量％溶解せしめた有機性溶
媒、例えばN,N−ジメチルアセトアミド、N,N−ジエチル
アセトアミド、N,N−ジメチルプロピオンアミド、N,N−
ジメチルイソブチルアミド、N,N−ジメチルメトキシア
セトアミド、Ｎ−メチルピロリドン−２、Ｎ−エチルピ
ロリドン−２、N,N,N′,N′−テトラメチル尿素、ヘキ
サメチルホスホルアミド等が、またポリ塩化ビニルの溶
剤としては、例えばテトラヒドロフラン、1,2−ジクロ
ルエタン、シクロペンタノン、シクロヘキサン、ジクロ
ルベンゼン、ニトロベンゼン、二硫化炭素、N,N−ジメ
チルホルムアミド、N,N−ジメチルアセトアミド、N,N−
ジエチルアセトアミド、N,N−ジメチルプロピオンアミ
ド、N,N−ジメチルイソブチルアミド、N,N−ジメチルメ
トキシアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン−２、Ｎ−
エチルピロリドン−２等が挙げられる。尚、共通溶媒
は、上記各溶媒のうち共通の溶媒を適宜選択して使用す
ればよい。

また、前記した溶液の調整に際し、PPBA−PVC組成物
の濃度は、成形が容易な程度の粘度を有する範囲であれ
ば特に制限されない。一般に、該組成物の濃度は、得ら
れる成形体の微多孔の孔径を酵素を内部に保持し得る孔
径の範囲に調整するため0.5〜10重量％、好ましくは、
１〜３重量％の範囲より選択することが好ましい。

一般に、PPBA−PVC組成物を含む溶液は、高い粘度を
示す（以下、本明細書において、該溶液を「高粘度溶
液」ともいう）ため、公知の方法により、所望の形状に
容易に成形することができる。例えば、膜状物を得る場
合は、ガラス板等の平板上に高粘度溶液を流延する方法
が一般に採用される。

所望の形状に成形された高粘度溶液の溶媒をPPBA−PV
C組成物の貧溶媒で置換することにより、膨潤状態にあ
る微多孔性の成形体が得られる。上記溶媒の置換は、貧
溶媒中に高粘度溶液を浸漬する方法が一般的である。ま
た、貧溶媒は、固定する酵素が失活しないものであり、
かつ該ポリパラベンズアミドおよびポリ塩化ビニルの溶
媒とならないものであれば、公知のものが特に限定され
ず用いられる。一般には水が好んで用いられが、上記条
件を満たす範囲で水に可溶な有機溶媒、例えば、メタノ
ール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、ジメチ
ルスルホキシド、N,N−ジメチルホルムアミド、N,N−ジ
メチルアセトアミド等が水と混合された状態で好適に使
用される。

前記した方法において、膨潤状態の成形体の孔に酵素
を保持する方法は特に制限されないが、一般に該成形体
を作成した後に酵素を導入する方法と作成と同時に酵素
を導入する方法とに大別することが出来る。該膨潤状態
の成形体を作成した後に酵素を導入する方法を例示すれ
ば、酵素を含む溶液と、該膨潤状態にある成形体中の溶
媒と置換する方法、該膨潤状態の成形体と固体酵素を接
触せしめる方法などが挙げられる。また、膜の作成と同
時に酵素を導入する方法を例示すれば、膨潤状態の成形
体を製造する過程で予め酵素を導入する方法が挙げられ
る。例えば、高粘度溶液を成形後、該溶液中の溶媒を置
換する貧溶媒として酵素を含有する液を使用することに
より、成形体の形成と同時に酵素を担持させる方法が挙
げられる。

以上の方法により、酵素を担持させた膨潤状態にある
成形体を乾燥することにより、該成形体は収縮し、これ
により収縮した微多孔中に酵素が担持された固定化酵素
が得られる。

上記の成形体の乾燥方法は、特に限定されないが、例
えば、風乾法、加熱乾燥法、減圧乾燥法、凍結乾燥法な
どが一般に使用される。上記方法のうち、加熱乾燥法な
どのように加熱を伴なう乾燥法において、加熱温度は酵
素を阻害しない温度を選択することが望ましい。

上記した方法において、PPBA−PVC組成物よりなる成
形体に酵素を、より確実に担持させる方法として、該酵
素を化学結合により固定化する方法が推奨される。かか
る方法としては、PPBA−PVC組成物のポリ塩化ビニルと
してアミノ基を有するポリ塩化ビニルを含むものを使用
し、該アミノ基と酵素とを、少なくとも２個のアルデヒ
ド基を有する有機化合物と反応させる方法が最も好まし
い。

上記のアミノ基を有するポリ塩化ビニルは、公知のも
のが特に制限なく使用される。例えば、アミノ基をポリ
塩化ビニルの骨格に直接結合したもの（以下、アミノ化
ポリ塩化ビニルという）、アミノ基をメチレン基を介し
てポリ塩化ビニルの骨格に結合したもの（以下、アミノ
メチル化ポリ塩化ビニルという）等が挙げられる。上記
アミノ基の割合は、ポリ塩化ビニル中に１〜30モル％、
好ましくは２〜20モル％の範囲が好適である。また、ア
ミノ基を有するポリ塩化ビニルはPPBA−PVC組成物中の
ポリ塩化ビニルの１〜100重量％、好ましくは２〜50重
量％となる割合で使用することが好ましい。

また、前記した少なくとも２個のアルデヒド基を有す
る有機化合物も、公知のものが特に制限なく使用され
る。例えば、グルタルアルデヒド、フタルジアルデヒド
等が挙げられる。

更に、少なくとも２個のアルデヒド基を有する有機化
合物と酵素及びアミノ基との反応の条件は特に限定され
ず、公知の条件が制限なく採用される。一般には、水、
エタノールおよびその混合溶媒等の溶媒中で各々を接触
させればよい。

また、かかる反応は、前記した製法におけるいずれの
時期に行ってもよい。例えば、アミノ基を有するPPBA−
PVC組成物よりなる成形体に少なくとも２個のアルデヒ
ド基を有する有機化合物を反応させ、次いで該成形体に
酵素を担持させる方法、アミノ基を有するPPBA−PVC組
成物よりなる成形体に酵素を担持させた後、（ａ）少なくとも２個のアルデヒド基を有する有機化
合物を反応させ、次いで該成形体を乾燥するか、又は（ｂ）該成形体を乾燥させ、次いで少なくとも２個の
アルデヒド基を有する有機化合物を反応させる方法等が好適である。

以上の製造方法において、得られる固定化酵素に繊維
状物を分散させる場合は、PPBA−PVC組成物よりなる高
粘度溶液、あるいはポリパラベンズアミド及び／又はポ
リ塩化ビニルの溶液中に繊維状物を添加混合する方法が
一般に採用される。

本発明の固定化酵素の保存方法は、特に制限されない
が、好適な方法を例示すれば、酵素を阻害しない緩衝
液、例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸
緩衝液等を用いて固定化酵素を湿潤状態に保つか、相対
湿度90％以上の条件に保つ方法が挙げられる。

〔効果〕

本発明の固定化酵素は、高い酵素活性に併せて、長寿
命を有するものである。従って、これを膜状としてセン
サーの電極用隔膜として使用した場合、長期間安定して
高い特性を発揮することができる。

特に、内部に繊維状物を分散した固定化酵素は、優れ
た耐乾燥性を有するため、使用において一時的な乾燥を
伴なう場合においてもその性能の低下を防ぐことが可能
である。

また、膨潤状態にあるPPBA−PVC組成物よりなる成形
体に酵素を保持せしめた後、これを乾燥することを特徴
とする本発明の固定化酵素の製造方法は、乾燥によって
PPBA−PVC組成物よりなる成形体の不可逆的な収縮を行
わせ、酵素を物理的に固定化するものであり、かかる特
性を利用することにより、担体である成形体と酵素との
化学的結合手段、例えば、ジアゾ結合、アミド結合、ア
ゾメチン結合等を利用することなく強固に酵素の固定化
を達成することができ、反覆使用による酵素の脱離が極
めて少ない長寿命の固定化酵素を得ることができる。ま
た、酵素の固定化に化学結合を利用する場合でも、かか
る結合を最少限に抑えることができるため、得られる固
定化酵素は、固定化された酵素量に見合う高い酵素活性
を発揮することが可能である。

更に、上記した方法は、膨潤状態にある、PPBA−PVC
組成物よりなる成形体を前記した高粘度溶液を平面上に
流延する方法で形成せしめることにより、従来では、そ
の製造が困難であった数ミクロンから数十ミクロンとい
う極めて薄い固定化酵素膜を得ることができ、かかる固
定化酵素は、酵素センサーに用いる電極用の膜として有
用である。

〔実施例〕

以下、本発明を更に具体的に説明するため実施例を示
すが、本発明は、これらの実施例に限定されるものでは
ない。

実施例１ポリパラベンズアミドを３重量％の塩化リチウムを含
むN,N−ジメチルアセトアミドに２重量％溶解し、ポリ
塩化ビニル（重合度1000）をN,N−ジメチルアセトアミ
ドに２重量％溶解し、これらの溶液を1:1の重量比で混
合した。この溶液をガラス板上に300μｍの厚さに流延
した後に、ガラス板ごと水の中に浸漬し膨潤状態の膜を
得た。該膜を30分後に水中より取り出し、ただちに100m
g/dlのグルコースオキシダーゼ（シグマ製）溶液（0.1M
リン酸緩衝液pH6.8）に30分間接触させた。膜を室温で2
4時間風乾した後に、リン酸緩衝液（0.1M、pH6.8）で繰
り返し洗浄し、厚さ15μｍの膜を得た。

得られた固定化酵素を1cm²切り取り、リン酸緩衝液
（0.1M、pH6.8）8mlを充たした密閉容器中37℃にてグル
コース液（1000mg/dl）を100μ注入し、グルコースの
酸化反応に伴う溶液の酸素濃度変化を溶存酸素計（電気
化学計器社、DOL−10型）にて記録した結果、0.40mg/
/mmの反応初速度を得た。

また、得られた固定化酵素膜を上記の溶存酸素計の先
端部に密着固定したところ、０−100mg/dlの範囲でグル
コース濃度の定量が可能であった。さらに、１ヶ月連続
して2mg/dlのグルコースを繰り返して測定したところ、
出力変化は５％以下であった。

実施例２実施例１の方法において、表１に示すように、溶媒、
濃度、混合比を変えた以外は同様にして膨潤状態の膜を
形成させ、以下、実施例１と同じくグルコースオキシダ
ーゼを固定した。結果を表１に併せて示した。

実施例３実施例１の方法において、表２に示すように、酵素の
種類、濃度を変えた以外は同様にして固定化酵素膜を得
た。結果を表２に併せて示した。

比較例１ポリ塩化ビニル（重合度1000）のみをN,N−ジメチル
アセトアミドに10重量％の濃度となるように溶解し、こ
の溶液をガラス板上に流延した以外は、実施例１と同様
の方法で固定化酵素膜を得、この膜を用いてグルコース
電極を調製し、グルコースを繰り返し測定したところ、
50回測定後において出力が50％低下した。

比較例２ポリパラベンズアミドのみを３重量％の塩化リチウム
を含むN,N−ジメチルアセトアミドに10重量％の濃度と
なるように溶解し、この溶液をガラス板上に流延した以
外は、実施例１と同様の方法でグルコースオキシダーゼ
固定化酵素膜を得た。該固定化酵素膜を用いて実施例１
と同様にして、酵素消費速度を測定したところ0.004mg/
/minの反応初速度しか得られなかった。

比較例３ 10cm²のコラーゲンフィルム（Centre Techiquedu Cui
r社製、厚さ0.1mm）を0.2M塩化水素を含むメタノール中
で１週間処理し、水で洗浄後、１％ヒドラジン溶液で10
時間反応させた後、さらに０℃で５分間、0.5M亜硝酸ナ
トリウムと0.3M塩酸の混合液で処理した。次いで、該フ
ィルムを水で洗浄後、pH7.0のリン酸緩衝液のグルコー
スオキシダーゼ（シグマ社）10000mg/dl溶液を２時間反
応させ、アミド結合により、グルコースオキシダーゼを
固定した。

実施例１に示した方法で酸素濃度変化を測定したとこ
ろ、0.1mg//minの反応初速度を得た。

実施例４ポリパラベンズアミドを３重量％でN,N−ジメチルア
セトアミド（３重量％の塩化リチウムを含む）に溶解
し、ポリ塩化ビニル（重合度1000）を３重量％でN,N−
ジメチルアセトアミドに溶解し、これらの溶液を1:1の
重量比で混合した。この溶液をガラス板上に300μｍの
厚さに流延した後に、ガラス板ごと水の中に浸漬し膨潤
状態の膜を得た。該膜を30分後に水中より取り出し、リ
ン酸緩衝液（0.1M、pH6.8）で洗浄後、100mg/dlのグル
コースオキシダーゼ（シグマ製）溶液（0.1Mリン酸緩衝
液pH6.8）に30分間接触させた。リン酸緩衝液（0.1M、p
H6.8）で繰り返し洗浄し、厚さ70μｍの膜を得た。

得られた固定化酵素膜を1cm²切取り、リン酸緩衝液
（0.1M、pH6.8）8mlを充した密閉容器中37度にてグルコ
ース液（1000mg/dl）を100μ注入し、グルコースの酸
化反応を溶存酸素計（電気化学計器社、DOL−10型）に
て記録した結果、0.40mg//minの反応初速度を得た。

また、得られた固定化酵素膜を上記の溶存酸素計の先
端部に密着固定したところ、０−100mg/dlの範囲でグル
コース濃度の定量が可能であった。さらに、１ヶ月連続
して2mg/dlのグルコースを繰り返して測定したところ、
出力変化は１ヶ月後に−10％であった。

実施例５ポリパラベンズアミドを２重量％でN,N−ジメチルア
セトアミド（３重量％の塩化リチウムを含む）に溶解
し、アミノ化ポリ塩化ビニル（アミノ基含量10モル％）
及びポリ塩化ビニル（重合度1000）をそれぞれ0.5重量
％、1.5重量％でN,N−ジメチルアセトアミドに溶解し、
これらの溶液を1:1の重量比で混合した。この溶液をガ
ラス板上に300μｍの厚さに流延した後に、ガラス板ご
と水の中に浸漬し膨潤状態の膜を得た。該膜を30分後に
水中より取り出し、25％グルタルアルデヒド水溶液をほ
う酸緩衝液（0.05M、pH8.5）で２倍に希釈した溶液中に
氷冷下で20分浸漬した。

該膜の一部を水洗乾燥の後、赤外分光光度計にてアル
デヒド基由来の1708cm^-1の生成を観察することによりグ
ルタルアルデヒドの反応を確認した。

リン酸緩衝液（0.1M、pH6.8）で洗浄後、100mg/dlの
グルコースオキシダーゼ（シグマ製）溶液（0.1Mリン酸
緩衝液pH6.8）に30分間接触させた。膜を室温で24時間
風乾した後に、リン酸緩衝液（0.1M、pH6.8）で繰り返
し洗浄し、厚さ30μｍの膜を得た。

得られた固定化酵素膜を1cm²切取り、リン酸緩衝液
（0.1M、pH6.8）8mlを充した密閉容器中37度にてグルコ
ース液（1000mg/dl）を100μ注入し、グルコースの酸
化反応を溶存酸素計（電気化学計器社、DOL−10型）に
て記録した結果、0.30mg/minの反応初速度を得た。

また、得られた固定化酵素膜を上記の溶存酸素計の先
端部に密着固定したところ、０−100mg/dlの範囲でグル
コース濃度の定量が可能であった。さらに、３ヶ月連続
して2mg/dlのグルコースを繰り返して測定したところ、
出力変化は１ヶ月後に−２％、３ヶ月後に−３％以下で
あった。

実施例６ポリパラベンズアミドは３重量％とし、さらに実施例
５の方法において、表３に示すように、アミノ基を有す
るポリ塩化ビニル及びポリ塩化ビニル、酵素の種類、を
変えた以外は同様にして、固定化酵素膜を得た。

結果を表３に併せて示した。

実施例７実施例５の方法において、25％グルタルアルデヒド水
溶液のかわりに、10％のテレフタルアルデヒドのエタノ
ール溶液を用いて、それ以外は同様にして厚さ40μｍの
固定化酵素膜を得た。

実施例５と同じ方法で0.20mg//minの酸素消費速度
を得た。また、実施例５と同じくグルコースを繰り返し
て測定し、１ヶ月後に−３％の出力変化であった。

実施例８ポリパラベンズアミドを２重量％でN,N−ジメチルア
セトアミド（３重量％の塩化リチウムを含む）に溶解し
た。アミノ化ポリ塩化ビニル（アミノ基含量10モル％）
（重合度1000）及びポリ塩化ビニルを表４に示す割合で
N,N−ジメチルアセトアミドに溶解し、さらに0.4重量％
の表−４に示す繊維状物を加えてよく混合した。これら
２つの液を1:1の重量比で混合した。この液をガラス板
上に300μｍの厚さに流延した後に、ガラス板ごと水の
中に浸漬し膨潤状態の膜を得た。該膜を30分後に水中よ
り取り出し、100mg/dlのグルコースオキシダーゼ（シグ
マ製）溶液（0.1Mリン酸緩衝液pH6.8）に30分間接触さ
せた。膜を室温で24時間風乾した後に、リン酸緩衝液
（0.1M、pH6.8）で繰り返し洗浄した。

得られた固定化酵素膜を1cm²切取り、リン酸緩衝液
（0.1M、pH6.8）8mlを充した密閉容器中37度にてグルコ
ース液（1000mg/dl）を100μ注入し、グルコースの酸
化反応を溶存酸素計（電気化学計器社、DOL−10型）に
て記録し反応初速度を測定した。

再び膜を五酸化リンで24時間乾燥し、上記と同じ方法
で反応初速度を測定した。

結果を表４に示した。

実施例９ポリパラベンズアミドを２重量％でN,N−ジメチルア
セトアミド（３重量％の塩化リチウムを含む）に溶解
し、アミノ化ポリ塩化ビニル（アミノ基含量10モル％）
及びポリ塩化ビニル（重合度1000）をそれぞれ0.5重量
％、1.5重量％でN,N−ジメチルアセトアミドに溶解し、
これらの溶液を1:1の重量比で混合した。この溶液をガ
ラス板上に300μｍの厚さに流延した後に、ガラス板ご
と水の中に浸漬し膨潤状態の膜を得た。該膜を30分後に
水中より取り出し、水洗の後100mg/dlのグルコースオキ
シダーゼ（シグマ製）溶液（0.1Mリン酸緩衝液pH6.8）
に30分間接触させた。さらに50％グルタルアルデヒド水
溶液をリン酸緩衝液（0.1M、pH6.8）で５倍に希釈した
溶液中に20度で２時間浸漬したリン酸緩衝液（0.1M、pH
6.8）で洗浄後、膜を室温で24時間風乾し、さらにリン
酸緩衝液（0.1M、pH6.8）で繰り返し洗浄し、厚さ40μ
ｍの膜を得た。

得られた固定化酵素膜を1cm²切取り、リン酸緩衝液
（0.1M、pH6.8）8mlを充した密閉容器中37度にてグルコ
ース液（1000mg/dl）を100μ注入し、グルコースの酸
化反応を溶存酸素計（電気化学計器社、DOL−10型）に
て記録した結果、0.25mg//minの反応初速度を得た。

また、得られた固定化酵素膜を上記の溶存酸素計の先
端部に密着固定したところ、０−100mg/dl）の範囲でグ
ルコース濃度の定量が可能であった。さらに、１ヶ月連
続して2mg/dlのグルコースを繰り返して測定したとこ
ろ、出力変化は５％以下であった。

実施例10 ポリパラベンズアミドを２重量％でN,N−ジメチルア
セトアミド（３重量％の塩化リチウムを含む）に溶解
し、アミノ化ポリ塩化ビニル（アミノ基含量10モル％）
及びポリ塩化ビニル（重合度1000）をそれぞれ0.5重量
％、1.5重量％でN,N−ジメチルアセトアミドに溶解し、
これらの溶液を1:1の重量比で混合した。この溶液をガ
ラス板上に300μｍの厚さに流延した後に、ガラス板ご
と水の中に浸漬し膨潤状態の膜を得た。該膜を30分後に
水中より取り出し、水洗の後100mg/dlのグルコースオキ
シダーゼ（シグマ製）溶液（0.1Mリン酸緩衝液pH6.8）
に30分間接触させた。膜を室温で24時間風乾し、さらに
50％グルタルアルデヒド水溶液をリン酸緩衝液（0.1M、
pH6.8）で５倍に希釈した溶液中に20度で２時間浸漬
し、厚さ30μｍの膜を得た。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ポリパラベンズアミドおよびポリ塩化ビニ
ルの組成物よりなる成形体に酵素を担持させた固定化酵
素。
【請求項２】成形体中に繊維状物を分散させた請求項
（１）記載の固定化酵素。
【請求項３】膨潤状態にある、ポリパラベンズアミドお
よびポリ塩化ビニルの組成物よりなる成形体に酵素を担
持させた後、該成形体を乾燥することを特徴とする請求
項（１）記載の固定化酵素の製造方法。
【請求項４】膨潤状態にある、繊維状物を分散させたポ
リパラベンズアミドおよびポリ塩化ビニルの組成物より
なる成形体に酵素を担持させた後、該成形体を乾燥する
ことを特徴とする請求項（２）記載の固定化酵素の製造
方法。
【請求項５】ポリパラベンズアミドおよびアミノ基を有
するポリ塩化ビニルの組成物よりなる成形体に酵素を担
持させた固定化酵素。
【請求項６】成形体中に繊維状物を分散させた請求項
（５）記載の固定化酵素。
【請求項７】請求項（３）記載の方法において、ポリ塩
化ビニルとしてアミノ基を有するポリ塩化ビニルを使用
し、且つ、該アミノ基および酵素と２個以上のアルデヒ
ド基を有する有機化合物とを反応させる工程を含む請求
項（５）記載の固定化酵素の製造方法。
【請求項８】請求項（４）記載の方法において、ポリ塩
化ビニルとしてアミノ基を有するポリ塩化ビニルを使用
し、且つ、該アミノ基および酵素と２個以上のアルデヒ
ド基を有する有機化合物とを反応させる工程を含む請求
項（６）記載の固定化酵素の製造方法。