JPH02257882A - 固定化酵素及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規な固定化酵素及びその製造方法に関する
。詳しくは、高い酵素活性を有すると共に長寿命を達成
し得る固定化酵素及びその製造方法に関する。

〔従来の技術〕

酵素の固定化は、酵素を利用した反応により得られる反
応生成物からの酵素の分離を容易とし、酵素の反復利用
を行う上で酵素反応の工業的実施に欠くことのできない
技術である。従来、酵素の固定化方法は大きく分けて架
橋法、包括法、担体結合法など、いくつか知られている
。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、高い酵素活性を有し、かつ長寿命の固定
化酵素を得ることのできる工業的な方法は見いだされて
いない。これは、長期間にわたり失活することなく確実
に酵素を固定化し得ることと、高い酵素活性を発揮する
ことは一般に相反する特性とされており、両者を両立さ
せることは困難であるということによるものである。即
ち、−般に酵素を担体結合法等で強固に固定した場合に
は寿命が長くなる反面、酵素固定量が限られる上に活性
低下を伴う場合が多く、全体の酵素活性は低くなる傾向
がある。逆に包括法等のように比較的弱く固定すると高
い酵素活性が得られるものの、固定が弱いため寿命は短
くなる場合が多い。

本発明者らは、上記した従来の酵素の固定化方法の欠点
を解決すべく研究を重ねた結果、膨潤状態にある、ポリ
パラベンズアミドおよびポリ塩化ビニルの組成物よりな
る成形体に酵素を担持させることにより、高活性かつ長
寿命の固定化酵素が得られることを見い出し、本発明を
完成するに至った。

〔課題を解決するための手段〕

即ち、本発明は、膨潤状態にある、ポリパラベンズアミ
ドおよびポリ塩化ビニルの組成物よりなる成形体に酵素
を担持してなる固定化酵素の製造方法である。

本発明において、ポリパラベンズアミドは、式で表され
る反復単位を有する重合体及び上記反復単位を７０モル
％以上含有し、共重合体を３０モル％以下の割合で含有
するポリアミド共重合体が好適に使用される。かかる共
重合単位としては例えば、式 以外の二価の有機基を示し、Ｑ及びＱ′は水素、脂肪族
炭化水素残基又は芳香族炭化水素残基を示し、Ｒ及びＲ
′は二価の有機基を表し、Ｙ及びＹ′はる共重合単位が
好適である。これらの共重合体は例えば特公昭４５−３
６８５２号等により公知であり、本発明においては、こ
れら公知の共重合体が特に制限なく使用し得る。

また、本発明において、ポリ塩化ビニルは、特に制限さ
れるものではなく、塩化ビニル単独重合体および塩化ビ
ニルと共重合しうるエチレン性不飽和単量体を３０モル
％以下の割合で含有する共重合体およびその厚導体が特
に限定されず使用される。上記の塩化ビニルと共重合し
うるエチレン性不飽和単量体も特に限定されるものでは
ないが、代表的なものを例示すれば、エチレン、プロピ
レン等のオレフィン化合物；酢酸ビニル、プロピオン酸
等のビニルエステル類；アクリル酸、メタクリル酸、ア
クリル酸メチル、メタクリル酸メチル、アクリル酸ブチ
ル、アクリル酸アミド、メタクリル酸アミド等の不飽和
モノカルボン酸、そのアルキルエステル類及びそのアミ
ド類；アクリロニトリル等の不飽和ニトリル類；マレイ
ン酸、フマール酸等の不飽和ジカルボン酸及びそのアル
キルエステル類；ビニルメチルエーテル、ビニルエチル
エーテル等のビニルアルキルエーテル類；及ヒその無水
物；等が好適に使用される。

本発明において、ポリパラベンズアミドおよびポリ塩化
ビニルの組成物（以下、Ｐ　ＰＰＢＡ−ＰＶＣ組成物と
いう）は、各成分が均一に混合された状態で成形可能な
ものであれば特に制限されない。例えば、組成比は、後
記する膨潤状態にある多孔性成形体の・成形を容易にす
るために、ポリパラベンズアミド／ポリ塩化ビニルの重
量比が２０／８０〜８０／２０、好ましくは３０／７０
〜７０ン３０の範囲となるように調整することが好まし
い。

上記ＰＰＢＡ　−ＰＶＣ組成物よりなる成形体は、酵素
の活性をより高めるために微多孔を有するものが好適で
ある。かかる微多孔の径は、内部に酵素を保持し得る大
きさであれば特に制限されないが、一般に酵素の相当径
に対して３０〜１０００００％、好ましくは５０〜１０
０００％となる大きさが好適である。尚、酵素の相当径
に対して径が小さい微多孔を有する固定化酵素は、後記
する方法により酵素を固定化した微多孔性成形体を乾燥
収縮させて得ることができる。

また、成形体の微多孔の容積は、酵素を高濃度で固定化
するために、大きい程好ましいが、−１Ｇには単位容積
当りの孔の容積が、８０〜９９．５容量％、好ましくは
９５〜９９容量％となるように決定することが好ましい
。

また、上記の微多孔性成形体の形状は、得られる固定化
酵素の使用状態に応じて適宜決定される。

例えば、膜状、球状、膜状、板状、棒状、繊維状等が一
般的である。

本発明において、上記ＰＰＢＡ　−ＰＶＣ組成物よりな
る成形体に酵素を担持させる手段は特に制限されない。

即ち、ＰＰＢＡ　−ＰＶＣ組成物よりなる成形体は、酵
素に対する親和性が良好であり、該成形体に酵素をその
まま担持させても、高い酵素活性を有する長寿命の固定
化酵素を得ることができる。しかしながら、更に確実に
長寿命を達成するために、担持された一部の酵素同志、
或いは一部の酵素とＰＰＢＡ　−ＰＶＣ組成物よりなる
成形体とを、ジアゾ結合、アミド結合、アゾメチン結合
等の化学結合により結合することが好ましい。また、Ｐ
ＰＢＡ　−ＰＶＣ組成物の乾燥収縮する特性を利用して
、酵素を担持させた微多孔性成形体を乾燥収縮させて、
収縮された微多孔により酵素を担持することも、得られ
る固定化酵素の寿命を更に伸ばす上で好ましい態様であ
る。

本発明において使用する酵素は特に限定されず、目的に
応じて公知の酵素が適宜選択される。代表的な酵素とし
ては、たとえばグルコースオキシダーゼ、ガラクトース
オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ウリカー
ゼ、アルコールオキシダーゼ、リパーゼ、乳酸デヒドロ
ゲナーゼ、アミノアシラーゼ、ウレアーゼ等が挙げられ
る。

また、成形体中への酵素の保持量は特に制限されるもの
ではなく、得られる固定化酵素の使用目的に応じて適宜
決定すればよい。

また、本発明の固定化酵素は、ＰＰＢＡ　−ＰＶＣより
なる成形体中に繊維状物を分散させることにより、乾燥
による酵素活性の低下などの性能劣化を防ぐ性能（以下
、耐乾燥性という）を発揮でき好ましい。

上記の繊維状物の大きさは、特に制限されないが、一般
に、直径（Ｄ）が０．０１〜５００μｍ。

好ましくは０．１〜１１００ｕ、長さ（Ｌ）が１〜５０
００μｍ、好ましくは、５〜１０００μｍで且つＬ／Ｄ
が２〜１０００００、好ましくは１０〜１００００の範
囲が特に好適である。また、繊維状物の配合量は、ＰＰ
ＢＡ　−ＰＶＣ組成物に対して、０、１〜５０重量％、
好ましくは５〜２５重量％が適当である。更に、繊維状
物の材質も、特に制限されるものではない。代表的なも
のを例示すれば、ガラス、金属等の無機繊維、セルロー
ス等の植物繊維、ポリアミド、ポリプロピレン、ポリエ
チレン等の合成繊維、絹等のタンパク繊維等の有機繊維
などが挙げられる。これらの材質のうち、特にガラスが
好適である。

本発明の固定化酵素の製造方法は特に制限されるもので
はないが、例えば、膨潤状態にある、ポリパラベンズア
ミドおよびポリ塩化ビニルの組成物よりなる成形体に酵
素を担持させた後、該成形体を乾燥する方法が好適であ
る。

上記した方法において、膨潤状態にあるＰＰＢＡ　−ｐ
ｖｃ組成物よりなる成形体の製造方法として、代表的な
方法を例示すれば、例えば特公昭６２−５５５３４号公
報に記載の方法が挙げられる。即ち、ＰＰＢＡ　−ＰＶ
Ｃ組成物を含む溶液を膜状等の所望の形状に成形した後
、該溶媒を貧溶媒で置換する方法が好適である。

一般に、貧溶媒を包含するＰＰＢＡ−ｐｖｃ組成物の成
形体は、−旦これを乾燥すると収縮する。かかる収縮は
、水等の溶媒に接触しても膨潤することのない非可逆的
な収縮である。本明細書において、膨潤状態にあるＰＰ
ＢＡ　−ＰＶＣ組成物よりなる成形体とは、上記収縮す
る前の状態にある該成形体を意味する。

前記のＰＰＢＡ　−ＰＶＣ組成物を含む溶液を調製する
ための溶媒としては、ポリパラベンズアミドおよびポリ
塩化ビニルを共に溶解し得る共通溶媒、或いは、ポリバ
ラベンズとポリ塩化ビニルの各々に対して溶解性を示す
選択的溶媒が使用し得る。即ち、ＰＰＢＡ　−ＰＶＣ組
成物を含む溶液を調製する方法において、用いる溶媒は
、必ずしも共通溶媒を用いることが必要ではなく、それ
ぞれについて選択的溶媒を用いることが可能である。後
者の場合、夫々のポリマーの溶液を調製した後、両者を
混合する方法により上記溶液を容易に得ることが可能で
ある。

上記の溶媒として好適なものを例示すれば、ポリパラベ
ンズアミドには塩化リチウムまたは塩化カルシウムのご
とき無機塩を０．５〜１０重量％溶解せしめた有機性溶
媒、例えばＮ、Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ、Ｎ−ジ
エチルアセトアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルプロピオンアミ
ド、Ｎ、Ｎ−ジメチルイソブチルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメ
チルメトキシアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン−２
、Ｎ−エチルピロリドン−２、Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テ
トラメチル尿素、ヘキサメチルホスホルアミド等が、ま
たポリ塩化ビニルの溶剤としては、例えばテトラヒドロ
フラン、１．２−ジクロルエタン、シクロペンタノン、
シクロヘキサン、ジクロルベンゼン、ニトロベンゼン、
二ｉｆｆ化炭Ｉ　Ｎ。

Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアセトア
ミド、Ｎ、Ｎ−ジエチルアセトアミド、Ｎ。

Ｎ−ジメチルプロピオンアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルイソ
ブチルアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルメトキシアセトアミド
、Ｎ−メチルピロリドン−２、Ｎ−エチルピロリドン−
２等が挙げられる。尚、共通溶媒は、上記各溶媒のうち
共通の溶媒を適宜選択して使用すればよい。

また、前記した溶液の調整に際し、ＰＰＢＡ　−ＰνＣ
組成物の濃度は、成形が容易な程度の粘度を有する範囲
であれば特に制限されない。一般に、該組成物の濃度は
、得られる成形体の微多孔の孔径を酵素を内部に保持し
得る孔径の範囲に調整するため０．５〜１０重量％、好
ましくは、１〜３重景％の範囲より選択することが好ま
しい。

一般に、ＰＰＢＡ−ｐｖｃ組成物を含む溶液は、高い粘
度を示す（以下、本明細書において、該溶液を「高粘度
溶液」ともいう）ため、公知の方法により、所望の形状
に容易に成形することができる。

例えば、膜状物を得る場合は、ガラス板等の平板上に高
粘度溶液を流延する方法が一般に採用される。

所望の形状に成形された高粘度溶液の溶媒をＰＰＢＡ　
−ＰＶＣ組成物の貧溶媒で置換することにより、膨潤状
態にある微多孔性の成形体が得られる。上記溶媒の置換
は、貧溶媒中に高粘度溶液を浸漬する方法が一般的であ
る。また、貧溶媒は、固定する酵素が失活しないもので
あり、かつ該ポリパラベンズアミドおよびポリ塩化ビニ
ルの溶媒とならないものであれば、公知のものが特に限
定されず用いられる。一般には水が好んで用いられが、
上記条件を満たす範囲で水に可溶な有機溶媒、例えば、
メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、
ジメチルスルホキシド、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド
、Ｎ、Ｎ−ジメチルアセトアミド等が水と混合された状
態で好適に使用される。

前記した方法において、膨潤状態の成形体の孔に酵素を
保持する方法は特に制限されないが、−般に該成形体を
作成した後に酵素を導入する方法と作成と同時に酵素を
導入する方法とに大別することが出来る。該膨潤状態の
成形体を作成した後に酵素を導入する方法を例示すれば
、酵素を含む溶液と、該膨潤状態にある成形体中の溶媒
と置換する方法、該膨潤状態の成形体と固体酵素を接触
せしめる方法などが挙げられる。また、膜の作成と同時
に酵素を導入する方法を例示すれば、膨潤状態の成形体
を製造する過程で予め酵素を導入する方法が挙げられる
。例えば、高粘度溶液を成形後、該溶液中の溶媒を置換
する貧溶媒として酵素を含有する液を使用することによ
り、成形体の形成と同時に酵素を担持させる方法が挙げ
られる。

以上の方法により、酵素を担持させた膨潤状態にある成
形体を乾燥することにより、該成形体は収縮し、これに
より収縮した微多孔中に酵素が担持された固定化酵素が
得られる。

上記の成形体の乾燥方法は、特に制限されないが、例え
ば、風乾法、加熱乾燥法、減圧乾燥法、凍結乾燥法など
が一般に使用される。上記方法のうち、加熱乾燥法など
のように加熱を伴なう乾燥法において、加熱温度は酵素
を阻害しない温度を選択することが望ましい。

上記した方法において、ＰＰＢＡ−ＰｖＣ組成物よりな
る成形体に酵素を、より確実に担持させる方法として、
該酵素を化学結合により固定化する方法が推奨される。

かかる方法としては、ＰＰＢＡ−ＰＶＣ組成物のポリ塩
化ビニルとしてアミノ基を有するポリ塩化ビニルを含む
ものを使用し、該アミノ基と酵素とを、少なくとも２個
のアルデヒド基を有する有機化合物と反応させる方法が
最も好ましい。

上記のアミノ基を有するポリ塩化ビニルは、公知のもの
が特に制限なく使用される。例えば、アミノ基をポリ塩
化ビニルの骨格に直接結合したもの（以下、アミノ化ポ
リ塩化ビニルという）、アミノ基をメチレン基を介して
ポリ塩化ビニルの骨格に結合したもの（以下、アミノメ
チル化ポリ塩化ビニルとうい）等が挙げられる。上記ア
ミノ基の割合は、ポリ塩化ビニル中に１〜３０モル％、
好ましくは２〜２０モル％の範囲が好適である。

また、アミノ基を有するポリ塩化ビニルはＰＰＢＡ　−
ｐｖｃ組成物中のポリ塩化ビニルの１〜１００重量％、
好ましくは２〜５０重量％となる割合で使用することが
好ましい。

また、前記した少なくとも２個のアルデヒド基を有する
有機化合物も、公知のものが特に制限なく使用される。

例えば、グルタルアルデヒド、フタルジアルデヒド等が
挙げられる。

更に、少なくとも２個のアルデヒド基を有する有機化合
物と酵素及びアミノ基との反応の条件は特に限定されず
、公知の条件が制限なく採用される。一般には、水、エ
タノールおよびその混合溶媒等の溶媒中で各々を接触さ
せればよい。

また、かかる反応は、前記した製法におけるいずれの時
期に行ってもよい。例えば、アミノ基を有するＰＰＢＡ
　−ＰＶＣ組成物よりなる成形体に少なくとも２個のア
ルデヒド基を有する有機化合物を反応させ、次いで該成
形体に酵素を担持させる方法、アミノ基を有するＰＰＢ
Ａ−ｐｖｃ組成物よりなる成形体に酵素を担持させた後
、 （ａ）　　少なくとも２個のアルデヒド基を有する有機
化合物を反応させ、次いで該成形体を乾燥するか、又は （ｂ）　　該成形体を乾燥させ、次いで少なくとも２個
のアルデヒド基を有する有機化合物を反応させる 方法等が好適である。

以上の製造方法において、得られる固定化酵素に繊維状
物を分散させる場合は、ＰＰＢＡ−ｐｖｃ組成物よりな
る高粘度溶液、あるいはポリパラベンズアミド及び／又
はポリ塩化ビニルの溶液中に繊維状物を添加混合する方
法が一般に採用される。

本発明の固定化酵素の保存方法は、特に制限されないが
、好適な方法を例示すれば、酵素を阻害しない緩衝液、
例えば、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝
液等を用いて固定化酵素を湿潤状態に保つか、相対湿度
９０％以上の条件に保つ方法が挙げられる。

〔効　果〕

本発明の固定化酵素は、高い酵素活性に併せて、長寿命
を有するものである。従って、これを膜状としてセンサ
ーの電極用隔膜として使用した場合、長期間安定して高
い特性を発揮することができる。

特に、内部に繊維状物を分散した固定化酵素は、優れた
耐乾燥性を有するため、使用において一時的な乾燥を伴
なう場合においてもその性能の低下を防ぐことが可能で
ある。

また、膨潤状態にあるＰＰＢＡ　−ＰＶＣ組成物よりな
る成形体に酵素を保持せしめた後、これを乾燥すること
を特徴とする本発明の固定化酵素の製造方法は、乾燥に
よってＰＰＢＡ　−ＰＶＣ組成物よりなる成形体の不可
逆的な収縮を行わせ、酵素を物理的に固定化するもので
あり、かかる特性を利用することにより、担体である成
形体と酵素との化学的結合手段、例えば、ジアゾ結合、
アミド結合、アゾメチン結合等を利用することなく強固
に酵素の固定化を達成することができ、反覆使用による
酵素の脱離が極めて少ない長寿命の固定化酵素を得るこ
とができる。また、酵素の固定化に化学結合を利用する
場合でも、かかる結合を最少限に抑えることができるた
め、得られる固定化酵素は、固定化された酵素量に見合
う高い酵素活性を発揮することが可能である。

更に、上記した方法は、膨潤状態にある、ＰＰＢＡ−ｐ
ｖｃｍ成物よりなる成形体を前記した高粘度溶液を平面
上に流延する方法で形成せしめることにより、従来では
、その製造が困難であった数ミクロンから数十ミクロン
という極めて薄い固定化酵素膜を得ることができ、かか
る固定化酵素は、酵素センサーに用いる電極用の膜とし
て有用である。

〔実施例〕

以下、本発明を更に具体的に説明するため実施例を示す
が、本発明は、これらの実施例に限定されるものではな
い。

実施例　ｌ ポリパラベンズアミドを３重量％の塩化リチウムを含む
Ｎ、Ｎ−ジメチルアセトアミドに２重量％溶解し、ポリ
塩化ビニル（重合度１０００）をＮ、Ｎ−ジメチルアセ
トアミドに２重量％溶解し、これらの溶液を１：１の重
量比で混合した。この溶液をガラス板上に３００μｍの
厚さに流延した後に、ガラス板ごと水の中に浸漬し膨潤
状態の膜を得た。護膜を３０分後に水中より取り出し、
ただちに１００■／ｄｌのグルコースオキシダーゼ（シ
グマ製）溶液（０，１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６，８）に３
０分間接触させた。膜を室温で２４時間風乾した後に、
リン酸緩衝液（０，１Ｍ、　ｐＨ６，８）で繰り返し洗
浄し、厚さ１５μｍの膜を得た。

得られた固定化酵素を１ｄ切り取り、リン酸緩衝液（０
，１Ｍ、　ｐＨ６、８）　８　ｍｌを充たした密閉容器
中３７℃にてグルコース液（１０００ｍｇ／ｄｌ）を１
ＯＯＩＩＩ！注入し、グルコースの酸化反応に伴う溶液
の酸素濃度変化を溶存酸素計（電気化学計器社、ＤＯＬ
−１０型）にて記録した結果、０．４０ｔｒｙ／１／ａ
ｍの反応初速度を得た。

また、得られた固定化酵素膜を上記の溶存酸素計の先端
部に密着固定したところ、０−１００■／ｄ１の範囲で
グルコース濃度の定量が可能であった。さらに、１ケ月
連続して２■／ｄ１のグルコースを繰り返して測定した
ところ、出力変化は５％以下であった。

実施例　２ 実施例１の方法において、表１に示すように、溶媒、濃
度、混合比を変えた以外は同様にして膨潤状態の膜を形
成させ、以下、実施例１と同じくグルコースオキシダー
ゼを固定した。結果を表１に併せて示した。

実施例　３ 実施例１の方法において、表２に示すように、酵素の種
類、濃度を変えた以外は同様にして固定化酵素膜を得た
。結果を表２に併せて示した。

比較例　１ ポリ塩化ビニル（重合度１０００）のみをＮ。

Ｎ−ジメチルアセトアミドに１０重量％の濃度となるよ
うに溶解し、この溶液をガラス板上に流延した以外は、
実施例１と同様の方法で固定化酵素膜を得、この膜を用
いてグルコース電極を調製し、グルコースを繰り返し測
定したところ、５０回測定後において出力が５０％低下
した。

比較例　２ ポリパラベンズアミドのみを３重量％の塩化リチウムを
含むＮ、Ｎ−ジメチルアセトアミドに１０重量％の濃度
となるように溶解し、この溶液をガラス板上に流延した
以外は、実施例１と同様の方法でグルコースオキシダー
ゼ固定化酵素膜を得た。

該固定化酵素膜を用いて実施例１と同様にして、酸素消
費速度を測定したところ０．００４■／Ｉ！／ｍｉｎの
反応期速度しか得られなかった。

比較例　３ １０ｄのコラーゲンフィルム（Ｃｅｎｔｒｅ　Ｔｅｃｈ
ｉｑｕｅｄｕ　Ｃｕｌｒ社製、厚さ０．１ｍｍ）を０．
２Ｍ塩化水素を含むメタノール中で１週間処理し、水で
洗浄後、１％ヒドラジン溶液で１０時間反応させた後、
さらに０℃で５分間、０．５Ｍ亜硝酸ナトリウムと０．
３Ｍ塩酸の混合液で処理した。次いで、該フィルムを水
で洗浄後、ｐＨ７，０のリン酸緩衝液のグルコースオキ
シダーゼ（シグマ社）１００００■／ａ溶液を２時間反
応させ、アミド結合により、グルコースオキシダーゼを
固定した。

実施例１に示した方法で酸素濃度変化を測定したところ
、０．１■／６／ｍｉｎの反応期速度を得た。

実施例４ ポリパラベンズアミドを３重量％でＮ、Ｎ−ジメチルア
セトアミド（３重量％の塩化リチウムを含む）に溶解し
、ポリ塩化ビニル（重合度１０００）を３重量％でＮ、
Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶解し、これらの溶液を１
：１の重量比で混合した。

この溶液をガラス板上に３００μｍの厚さに流延した後
に、ガラス板ごと水の中に浸漬し膨潤状態の膜を得た。

護膜を３０分後に水中より取り出し、リン酸緩衝液（０
，１Ｍ、　ｐＨ６゜８）で洗浄後、１００■／ｄ１のグ
ルコースオキシダーゼ（シグマ製）溶液（０，１Ｍリン
酸緩衝液ｐＨ６，８）に３０分間接触させた。リン酸緩
衝液（０，１Ｍ、ｐＨ６，８）で繰り返し洗浄し、厚さ
７０μｍの膜を得た。

得られた固定化酵素膜をＩＣＩＩ＋切取り、リン酸緩衝
液（０，１Ｍ、　ｐＨ６，８）　８ｍｌを充した密閉容
器中３７度にてグルコース液（１０００ｒｒｇ／ｄ１）
を１００μ！注入し、グルコースの酸化反応を溶存酸素
計（電気化学計器社、ＤＯＬ−１０型）にて記録した結
果、０．４０ｍｇ／β／ｎ＋ｉｎの反応期速度を得た。

また、得られた固定化酵素膜を上記の溶存酸素計の先端
部に密着固定したところ、０−１００■／ｄ１の範囲で
グルコース濃度の定量が可能であった。さらに、１ケ月
連続して２■／ｄｌのグルコースを繰り返して測定した
ところ、出力変化は１ケ月後に一１０％であった。

実施例５ ポリパラベンズアミドを２重量％でＮ、Ｎ−ジメチルア
セトアミド（３重量％の塩化リチウムを含む）に溶解し
、アミノ化ポリ塩化ビニル（アミノ基含量１０モル％）
及びポリ塩化ビニル（重合度１０００）をそれぞれ０．
５重量％、１．５重量％でＮ、Ｎ−ジメチルアセトアミ
ドに溶解し、これらの溶液を１：１の重量比で混合した
。この溶液をガラス板上に３００μｍの厚さに流延した
後に、ガラス板ごと水の中に浸漬し膨潤状態の膜を得た
。

護膜を３０分後に水中より取り出し、２５％グルタルア
ルデヒド水溶液をほう酸緩衝液（０，０５Ｍ、ｐＨ８，
５）で２倍に希釈した溶液中に氷冷下で２０分浸漬した
。

護膜の一部を水洗乾燥の後、赤外分光光度計にてアルデ
ヒド基由来の１７０８ｃｍ−’の生成を観察することに
よりグルタルアルデヒドの反応を確認した。

リン酸緩衝液（０，１Ｍ、　ｐＨ６，８）で洗浄後、１
００■／ｄ１のグルコースオキシダーゼ（シグマ製）溶
液（０，１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６，８）ニ３０分間接触
させた。膜を室温で２４時間風乾した後に、リン酸緩衝
液（０，１Ｍ、ｐ）１６．８）で繰り返し洗浄し、厚さ
３０μｍの膜を得た。

得られた固定化酵素膜をｌ　ｃ４切取り、リン酸緩衝液
（０，ＩＭ、ｐ）１６．８）８ｄを充した密閉容器中３
７度にてグルコース液（１０００■／ｄ１）を１００μ
！注入し、グルコースの酸化反応を溶存酸素計（電気化
学計器社、ＤＯＬ−１０型）にて記録した結果、０．３
０■／１／ｍｉｎの反応初速度を得た。

また、得られた固定化酵素膜を上記の溶存酸素計の先端
部に密着固定したところ、０−１００■／ｄ１）の範囲
でグルコース濃度の定量が可能であった。さらに、３ケ
月連続して２■／ｄ１のグルコースを繰り返して測定し
たところ、出力変化は１ヶ月後に一２％、３ケ月後に一
３％以下であった。

実施例６ ポリパラベンズアミドは３重量％とじ、さらに実施例５
の方法において、表３に示すように、アミノ基を有する
ポリ塩化ビニル及びポリ塩化ビニル、酵素の種類、を変
えた以外は同様にして、固定化酵素膜を得た。

結果を表３に併せて示した。

実施例７ 実施例５の方法において、２５％グルタルアルデヒド水
溶液のかわりに、１０％のテレフタルアルデヒドのエタ
ノール溶液を用いて、それ以外は同様にして厚さ４０μ
ｍの固定化酵素膜を得た。

実施例５と同じ方法で０．２０■／β／ｍｉｎの酸素消
費速度を得た。また、実施例５と同じくグルコースを繰
り返して測定し、１ケ月後に一３％の出力変化であった
。

実施例８ ポリパラベンズアミドを２重量％でＮ、Ｎ−ジメチルア
セトアミド（３重量％の塩化リチウムを含む）に溶解し
た。アミノ化ポリ塩化ビニル（アミノ基含量１０モル％
）（重合度１０００）及びポリ塩化ビニルを表４に示す
割合でＮ、Ｎ−ジメチルアセトアミドに溶解し、さらに
０．４重量％の表−４に示す繊維状物を加えてよく混合
した。これら２つの液を１：１の重量比で混合した。こ
の液をガラス板上に３００μｍの厚さに流延した後に、
ガラス板ごと水の中に浸漬し膨潤状態の膜を得た。線膜
を３０分後に水中より取り出し、１００■／ｄ１のグル
コースオキシダーゼ（シグマ類）溶液（０，１Ｍリン酸
緩衝液ｐＨ６，８）に３０分間接触させた。膜を室温で
２４時間風乾した後に、リン酸緩衝液（０，ＩＭ、ｐＨ
６，８）で繰り返し洗浄した。

得られた固定化酵素膜を１−切取り、リン酸緩衝液（０
，１Ｍ、　ｐＨ６，８）　８ｍｌを充した密閉容器中３
７度にてグルコース液（１０００■／ｄｌ）を１００Ａ
ｌｌ注入し、グルコースの酸化反応を溶存酸素計（電気
化学計器社、ＤＯＬ−１０型）にて記録し反応初速度を
測定した。

再び膜を五酸化リンで２４時間乾燥し、上記と同じ方法
で反応初速度を測定した。

結果を表４に示した。

実施例９ ポリパラベンズアミドを２重量％でＮ、Ｎ−ジメチルア
セトアミド（３重量％の塩化リチウムを含む）に溶解し
、アミノ化ポリ塩化ビニル（アミノ基含量１０モル％）
及びポリ塩化ビニル（重合度１０００）をそれぞれ０．
５重量％、１．５重量％でＮ、Ｎ−ジメチルアセトアミ
ドに溶解し、これらの溶液を１：１の重量比で混合した
。この溶液をガラス板上に３００μｍの厚さに流延した
後に、ガラス板ごと水の中に浸漬し膨潤状態の膜を得た
。

護膜を３０分後に水中より取り出し、水洗の後１００■
／ｄｌのグルコースオキシダーゼ（シグマ製）溶液（０
，１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６，８）に３０分間接触させた
。さらに５０％グルタルアルデヒド水溶液をリン酸緩衝
液（０，１Ｍ、ｐＨ６，８）で５倍に希釈した溶液中に
２０度で２時間浸漬したリン酸緩衝液（０，１Ｍ、　ｐ
Ｈ６，８）で洗浄後、膜を室温で２４時間風乾し、さら
にリン酸緩衝液（’０．１　Ｍ、ｐＨ６，８）で繰り返
し洗浄し、厚さ４０μｍの膜を得た。

得られた固定化酵素膜をｌｃｄ切取り、リン酸緩衝液（
０，１Ｍ、ｐＨ６，８）８ｍＪを充した密閉容器中３７
度にてグルコース液（１０００■／＋１７）を１００Ｉ
ＩＩｔ注入し、グルコースの酸化反応を溶存酸素計（電
気化学計器社、ＤＯＬ−１０型）にて記録した結果、０
．２５ｍｇ／β／ｗｉｎの反応期速度を得た。

また、得られた固定化酵素膜を上記の溶存酸素計の先端
部に密着固定したところ、０−１００■／ｄｌ’）の範
囲でグルコース濃度の定量が可能であった。さらに、１
ケ月連続して２■／ｄ１のグルコースを繰り返して測定
したところ、出力変化は５％以下であった。

実施例１０ ポリパラベンズアミドを２重量％でＮ、Ｎ−’；メチル
アセトアミド（３重量％の塩化リチウムを含む）に溶解
し、アミノ化ポリ塩化ビニル（アミノ基含量１０モル％
）及びポリ塩化ビニル（重合度１０００）をそれぞれ０
．５重量％、１．５重量％でＮ、Ｎ−ジメチルアセトア
ミドに？８解し、これらの溶液を１＝１の重量比で混合
した。この溶液をガラス板上に３００μｍの厚さに流延
した後に、ガラス板ごと水の中に浸漬し膨潤状態の膜を
得た。

護膜を３０分後に水中より取り出し、水洗の後１００■
／ｄ１のグルコースオキシダーゼ（シグマ製）溶液（０
，１Ｍリン酸緩衝液ｐＨ６，８）に３０分間接触させた
。膜を室温で２４時間風乾し、さらに５０％グルタルア
ルデヒド水溶液をリン酸緩衝液（０，１Ｍ、ｐＨ６，８
）で５倍に希釈した溶液中に２０度で２時間浸漬し、厚
さ３０μｍの膜を得た。

得られた固定化酵素膜を１−切取り、リン酸緩衝液（０
，１Ｍ、　ｐＨ６，８）　８−を充した密閉容器中３７
度にてグルコース液（１０００■／ｄ１）を１００／ｊ
ｊ！注入し、グルコースの酸化反応を溶存酸素計（電気
化学計器社、ＤＯＬ−１０型）にて記録した結果、０．
４０■／ｌ／１ａｋｎの反応期速度を得た。

また、得られた固定化酵素膜を上記の溶存酸素計の先端
部に密着固定したところ、０−１００■／ｄ１）の範囲
でグルコース濃度の定量が可能であった。さらに、１ケ
月連続して２■／ｄ１のグルコースを繰り返して測定し
たところ、出力変化は５％以下であった。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ポリパラベンズアミドおよびポリ塩化ビニルの組
   成物よりなる成形体に酵素を担持させた固定化酵素。
2. （２）成形体中に繊維状物を分散させた請求項（１）記
   載の固定化酵素。
3. （３）膨潤状態にある、ポリパラベンズアミドおよぴポ
   リ塩化ビニルの組成物よりなる成形体に酵素を担持させ
   た後、該成形体を乾燥することを特徴とする請求項（１
   ）記載の固定化酵素の製造方法。
4. （４）ポリ塩化ビニルがアミノ基を有し、該アミノ基及
   び酵素と２個以上のアルデヒド基を有する有機化合物と
   を反応させる工程を含む請求項（３）記載の方法。