JPH04503372A - 高濃度のアミン基を有する多孔質基体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 高濃度のアミン基を有する多孔質基体 関連出願へのクロスレファランス これは１９８９年１月３１日出願に係る同時係属出願Ｎｏ、　０７／３０４、７ ３７の一部継続出願である。

本発明の技術分野 本発明は高濃度のアミン基を有する多孔質基体およびかかる基体を、核酸、タン パク質、バクテリアおよびウィルスを電気泳動ゲルまたは培養媒質から基体に移 動させそして固定するのに用いることに関する。

本発明の背景 物質をゲルまたは培養媒質から固定膜に移すために多くの材料および方法が開発 されている。

Ｂ、Ｍ、　５ｏｕｔｈｅｒｎ　（Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、 　Ｖｏｌ、　９８．　ｐ。

５０３、１９７５）は核酸を電気泳動ゲルから吸着性媒質に移す方法を開示して いる。この５ｏｕｔｈｅｒｎ法では、ゲルと数層のペーパータオルとの間に膜が 置かれる。緩衝溶液が毛細管作用によってゲルおよび膜を経てペーパータオルに 強制移動する際に核酸検体は膜内に押しやられ該膜上に沈着する。これはプロッ ティングによる移動と称される。

Ｂｉｔｔｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、（＾ｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｔ、　Ｖｏｌ、１０ ２．　ｐ、４５９゜１９８０）は電位を用いて核酸検体を膜内に移動させる同様 の方法を開示した。これは電気泳動移動またはエレクトロプロッティングと称さ れる。

吸着性微孔質膜もバクテリアおよびウィルスの増殖媒質からの移動に用いられて いる。

ニトロセルロース、ニトロベンジルオキシメチルセルロース、アミノベンジルオ キシメチルセルロース、アミノフェニル−チオエーテルセルロース、ジエチルア ミノエチルセルロース、およびポリビニリデンフルオライドを含むいくつかの材 料が移動膜として有効に用いられている。しかしながら、それらセルロース系材 料は脆く、また移動過程で、あるいは引き続いての分析手順に伴う操作の際に破 れてしまうことが多い。

米国特許第４．４５５．３７０号は、微孔質吸着性ナイロンフィルムの移動フィ ルムとしての使用を広く開示している。

アンモニアの存在下にポリオレフィンをプラズマ−エツチングする方法は、もち ろん当該技術分野において知られている。

米国特許第４．３４０．４７９号に開示されているスキンレス（５ｋｉｎｌｅｓ ｓ）親水性アルコール不溶性ポリアミド膜の調製方法は、アルコール不溶性ポリ アミド樹脂のポリアミド樹脂溶媒中の溶液を調製し、該ポリアミド樹脂溶液に該 ポリアミド樹脂の非溶媒を調節しながら添加することにより溶液の核発生を誘導 して視認し得るポリアミド樹脂粒子の沈殿を得、それによってキャスティング（ ｃａｓｔｉｎｇ）溶液を形成し、そのキャスティング溶液を基体上に展延して該 基体上にフィルムを形成し、そのキャスティング溶液フィルムを前記ポリアミド 樹脂の非溶媒と接触させかつ該非溶媒で希釈し、それによって膜を形成し、該層 を洗浄して溶媒を除去しそして生成膜を乾燥することより成る。この文献は原料 ポリマーは広く様々なグレードのものが利用可能であるものの（それらは分子量 およびその他の特性に関し多少の変動がある）、親水性膜の形成はこれらの特性 ではなくてポリマーの化学組成の関数であることを教示している。

米国特許第３．８７６、７３８号はフィルム形成性ポリマーのある溶媒系中の溶 液を該ポリマーの非溶媒系より成るクエンチ洛中にキャスティングまたは押し出 すことによる微孔質フィルムの製法を開示している。使用されるポリマーは好ま しくはナイロンポリマーである。様々な分子量グレードのナイロンの使用から生 じ得る長所については全（論じられていない。

本発明の概要 本発明は従来技術による膜に伴う問題を解消するものである。本発明は物質組成 、すなわち、所望により不活性支持体により支持された、高い表面濃度のアミン 基を有するポリアミド基体に関する。

さらに本発明は、核酸、タンパク質、バクテリアまたはウィルスなどの物質を好 ましくはゲルまたは培養物から多孔質基体に移す為の改良された方法に関し、そ してその改良点は前記物質を高濃度のアミン基を有するポリアミド基体と接触さ せることより成る。

さらに本発明は核酸またはタンパク質を電気泳動ゲルから高濃度のアミン末端を 有するポリアミド基体にプロッティングまたはエレクトロブロッティングにより 移すことに関する。さらに本発明は核酸、タンパク質、バクテリアまたはウィル スを培養媒質（含プラーク）から、該媒質中の被移動物質を高い表面濃度のアミ ン基を有するポリアミド基体と接触させることにより移すことに開本発明は高い 表面濃度のアミン基を有する多孔質基体に関する。

核酸またはその他の生物学的物質を結合するにはポリアミド基体が高い表面濃度 のアミン基を有していることが重要である。好ましくは、アミン基の濃度は少く とも約６０当量／１０’ｇとすべきである。好ましくは、基体の表面積は、窒素 吸着により測定した場合に少くとも約１ｍ！／ｇとすべきである。

適切なアミン基は−ＮＲＲ’　（式中、ＲおよびＲ′は独立的にＨ，ｃ＋−＋。

の分枝状、非分枝状または環状アルキル、Ｃ６アリールまたはＣＶ−＋Ｚアラル キルであり、また該アルキル、アリールまたはアラルキル基は生物学的検体の多 孔質基体への結合を妨げることのないヘテロ原子置換分例えばハロゲンまたはエ ーテル酸素などを含んでいてもよい）として特徴付けられる。

基体の孔径はバクテリア濾過等級として表わす。例えハシュートモナス・ディミ ヌタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｉｍｉｎｕｔａ）という生物を定量的に除去 する能力は０．２μノ（クチリア等級フィルターを規定するものとして受け入れ られ、またセラチア・アルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｅｎｓ） とＬｌつ生物を定量的に除去する能力は０．４５μバクテリア等級フィルターを 規定するものとして受け入れられる。約０．２μ〜０．８μの範囲のバクテリア 濾過等級を有する材料が好ましいが、それよりも大きいまたは小さい等級の材料 を用いることができる。約ＩＫＢより小さいＤＮＡ分子の移動、およびＲＮＡに 対しては、０．２μ等級材料が好ましい。

約ＩＫＢよりも大きいＤＮＡ分子の移動には０．４５〜０．８μ材料が好ましい 。これに対し、タンパク質分子、バクテリアまたはウィルスの移動および保持に おいては孔径はさほど重要であるようには思われない。

本発明のポリアミド基体は均質材料であってよく、例えば高濃度のアミン基を含 むポリマーまたはポリマー混合物から従来より知られた方法により製造されたポ リマーのフィルムまたは膜であってよい。

好ましい基体は低分子量ポリアミド（高アミン基濃度用）と高分子量ポリアミド （強度用）のブレンドである。

極めて好ましくは、そのブレンドは約１〜９０重量％の低分子量ポリアミドと約 １０〜９９重量％の高分子量ポリアミドより成る。低分子量材料の率がそれより 高くなると得られるブレンドは脆くなる。低分子量ポリアミド中のアミン濃度は 、高い表面濃度のアミン基を基体に付与するために〉７０アミン当量／１０＠ｇ （すなわち１０・９のポリアミドあたり７０モルのアミン基）とすべきであるが 、ポリマーブレンドの高アミン濃度部分の非水溶性を維持するために＜　１．５ ００アミン当量／　１０　”　ｑとすべきである。高分子量ポリアミド中のアミ ン濃度は＜８０アミン当量／１０＠ｗである。高い表面濃度のアミン基を有する 基体を得たいという願望と基体の構造的完全さを維持するのに十分な量の高分子 量材料を取り込む必要性との間の妥協が必要となることは当業者の理解するとこ ろであろう。従って、高アミン当量、低分子量ポリアミドを大量に用いることに よって適切な基体を製造することは可能でないかもしれない。有益なりＮＡ吸着 には最終的な膜が少くとも６０アミン当量／１０’９（ポリマー）を有している ことを見出した。

他の低分子量、アミン末端ポリマーとコンパチブルな高分子量ポリマーとのブレ ンドも高い表面濃度のアミン基を有する多孔質基体を与えるはずである。

さらに、高表面濃度のアミン基は不活性支持体を高濃度のアミンを含むポリマー またはポリマー混合物で被覆または含浸することにより達成することもできる。

適切な不活性支持体にはセルロース、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリエステ ルおよびファイバーグラスなどが含まれるがそれらに限定されるものではない。

核酸およびその他の生物学的物質を移動する上での本基体の有効度は米国特許第 ４．４５５．３７０号に開示された手順により試験できるところ、該手順を引用 により本明細書の一部として含める。

本発明による組成物の調製にあたっては、蟻酸キャスティング溶液１箇！あたり ０．０７４菖ｌのマテリアルを用いるのが好ましい。マテリアルは必要でないか もしれないが、それをキャスティング溶液に添加するとポリマーを沈殿に致らし める。メタノールはクエンチ浴中１＝１のメタノール：水溶液として用いるのが 好ましい。いずれの非溶媒または非溶媒混合物も微孔質構造を与える。ガラスは 好ましいキャスティング基体であるがキャスティングドープを展延できかつ膜の 剥離が容易ないずれの不活性滑面を用いてもよい。組成物は好ましくは周囲温度 で調製される。

膜の調製 高アミン６６ナイロン膜は米国特許第３．８７６、７３８号に開示された方法に よっては製造不可能 従来技術による方法によってポリマー１０６ｇあたり８０当量のアミンを有する ６６ナイロン検体を得た。このナイロン検体１６ｇを周囲温度で５３ｍ１の９６ ％蟻酸および９．　Ｑｍｌのメタノールに溶解した。この溶液をガラス上に１０ ミル厚フイルムとしてキャスティングし次いで１０分間１０００ｍ＋／の１＝３ または３：１　メタノール：水中でクエンチした。

そのフィルムをガラス支持体に載せたまま浴から取り出し空気乾燥した。そのフ ィルムは乾燥状態でもあるいは水で再度源した後でも弱過ぎて単一片として除去 することはできなかった。

ガラスプレートに、キャスティング前にＴｅｆｌｏｎ＠　ＤｒｙＬｕｂｒｉｃａ ｎｔを噴霧した。最終フィルムはもはやガラスに付着せず、乾燥すると縮んでひ び割れし使用に耐えない断片となった。

明らかに、高濃度のアミン末端を有するナイロン検体は分子量が小さすぎて十分 な強度をもった多孔質基体を与えることはできない。

実施例１ 低末端のプレーン（ｐｌａｉｎ）膜による低吸着１０・９のポリマーあたり２０ 当量のアミンおよび４４当量のカルボキシルを有する６６ナイロン検体（Ｚｙｔ ｅｌ”４２）を得た。このナイロン検体７２ｇを１９０■ｌの蟻酸に溶解した。

次に１４翼！のメチルアルコールを添加し、そしてその溶液を再び撹拌して（ｔ ｕｍｂｌｅｄ）均質化した。この溶液をガラス上に１０ミル厚でキャスティング し、３０秒後に１０００肩ｌの１＝１　メタノール：水に投じ、３分後に取り出 して液を切り、空気乾燥し、水で湿っている間にガラスから剥がしそして再び乾 燥した。（濃度計を用いて放射性プローブの吸着を定量する）ＤＮＡ吸着実験に おいて、この膜は平均１８９４崩壊／分（ＤＰＩ）を示した。複製膜は２４アミ ン／１０’ｇ（ポリマー）と分析された。

実施例２ Ｒｅｅｍａｙ”上の低末端膜による低吸着１０６ｇのポリマーあたり２０当量の アミンおよび４４当量のカルボキシルを有する６６ナイロン検体（Ｚｙｔｅｌ” ４２）を得た。７２ｇのこのナイロン検体を１９０ｍＪの蟻酸を溶解した。

次いで１４ｔＪのメチルアルコールを添加し、そしてその溶液を撹拌して均質化 した。この溶液をガラスプレートに装着したＲｅｅｍａｙ”シート上に１０ｍ１ Ｊ厚にキャスティングし、３０秒後に１０００■ｌの１：１　メタノール：水に 投じ、３分後に取り出し液を切り、空気乾燥し、水で湿っている間にガラスから 剥がし、そして再び乾燥した。ＤＮＡ吸着実験において、この膜は平均２５４７ 崩壊／分（ＤＰＭ）を示した。

実施例３ 中度末端のブレーン膜による中等度吸着１０６ｇのポリマーあたり２０当量のア ミンおよび４４当量のカルボキシルを有する６６ナイロン検体（Ｚｙｔｅｌ”４ ２）を得た。アジピン酸をオリゴマーまでではあるがヘキサメチレンジアミンと 重合させて１０’ｇのポリマーあたり〈１０当量のカルボキシルおよび１１７０ 当量のアミンを有する低分子量ナイロンを得た。６５９の高分子量ナイロン、７ ｇのオリゴマーそしてその後に１４ｍ＋７のメチルアルコールを１９０ｍ１の蟻 酸に溶解することによりキャスティング溶液を調製した。この溶液をガラス上に １ｈｉｌ厚にキャスティングし、３０秒後に１０１００Ｏの１＝１　メタノール ：水に投じ、３分後に取り出し液を切り、空気乾燥し、水で湿っている間にガラ スから剥がしそして再び乾燥した。ＤＮＡ吸着実験においてこの膜は平均３０１ ５崩壊／分（ＤＰＭ）を示した。

複製膜は９０アミン／１０’９（ポリマー）と分析された。

実施例４ Ｒｅｅｍａｙ”上の中度末端膜による中等度吸着１０６ｇのポリマーあたり２０ 当量のアミンおよび４４当量のカルボキシルを有する６６ナイロン検体（Ｚｙｔ ｅｌ”４２）を得た。アジピン酸をオリゴマーまでではあるがヘキサメチレンジ アミンと重合させて１０６ｇのポリマーあたり〈１０当量のカルボキシルおよび １１７０当量のアミンを有する低分子量ナイロンを得た。６５９の高分子量ナイ ロン、７ｇのオリゴマー、およびその後に１４■ｌのメチルアルコールを１９０ ｍ／の蟻酸に溶解することによりキャスティング溶液を調製した。この溶液をガ ラス上に広げたＲｅｅｓａｙ”シート上に１０ｅｉ／厚にキャスティングし、３ ０秒後に１０１００Ｏの１＝１　メタノール：水に投じ、３分間後に取り出して 液を切り、空気乾燥し、水で湿っている間にガラスから剥がしそして再び乾燥し た。ＤＮＡ吸着実験においてこの膜は平均３５２０崩壊／分（ＤＰＭ）を示した 。

実施例５ 高末端のブレーン膜による高度吸着 １０６ｇのポリマーあたり２０当量のアミンおよび４４当量のカルボキシル／１ ０６ｇを有する６６ナイロン検体（Ｚｙｔｅｌ”４２）を得た。アジピン酸をオ リゴマーまでではあるがへキサメチレンジアミンと重合させて、１０’９のポリ マーあたり〈１０当量のカルボキシルおよび１１７０当量のアミンを有する低分 子量ナイロンを得た。５８ｇの高分子量ナイロン、１４ｇのオリゴマー、そして その後で１４冨ｌのメチルアルコールを１９０ｍＪの蟻酸に溶解することにより キャスティング溶液を調製した。この溶液をガラス上に１０１１１ｉｌ厚にキャ スティングし、３０秒後に１０００諺Ａ’の１：１　メタノール：水に投じ、３ 分間後に取り出して液を切り、空気乾燥し、水で湿っている間にガラスから剥が しそして再び乾燥した。ＤＮＡ吸着実験においてこの膜は平均３５４８崩壊／分 （ＤＰｌｌ）を示した。複製膜は１８０末端／１０’ｖ（ポリマー）と分析され た。

実施例６ Ｒｅｅ−８ｙ上の高末端膜による高度吸着１０＠９のポリマーあたり２０当量の アミンおよび４４当量のカルボキシルを有する６６ナイロン検体（Ｚｙｔｅｌ” ４２）を得た。アジピン酸をオリゴマーまでではあるがヘキサメチレンジアミン と重合させて１０６ｇのポリマーあたり＜１０当量のカルボキシルおよび１１７ ０当量のアミンを有する低分子量ナイロンを得た。５８ｇの高分子量ナイロン、 １４ｇのオリゴマー、そしてその後で１４ｍＡ’のメチルアルコールを１９（１ ＋７の蟻酸に溶解することによりキャスティング溶液を調製した。この溶液をガ ラス上に広げたＲｅｅ■ａ　ｙ　Ｔ　Ｍシートに１０■ｉｌ厚にキャスティング し、３０秒後に１０１００Ｏ！のｌ：ｌ　メタノール：水に投じ、３分間後に取 り出して液を切り、空気乾燥し、水で湿っている間にガラスから剥がしそして再 び乾燥した。ＤＮＡ吸着実験においてこの膜は平均５１２９崩壊／分（ＤＰＩ） を示した。

国際調査報告 一一＾−−−″＠ＰＣＴ／ＵＳ　９０７００１＋３６国際調査報告 ＵＳ　９０００１３３６ Ｓ＾　３５１０２

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．高濃度のアミン基を有するポリアミド基体より成る組成物。
2. ２．ポリアミド基体が不活性支持体上に支持される請求項１記載の組成物。
3. ３．アミン基濃度がポリマー１０６ｇあたり少くとも約６０当量である請求項１ 記載の組成物。
4. ４．基体表面積が窒素吸着により測定した場合に少くとも約１ｍ２／ｇである請 求項１記載の組成物。
5. ５．アミン基が−ＮＲＲ′（式中、ＲおよびＲ′は独立的にＨ、Ｃ１−１０の分 枝状、非分枝状または環状アルキル、Ｃ６アリールまたはＣ７−１２アラルキル であり、また該アルキル、アリールまたはアラルキル基は生物学的検体のポリア ミド基体への結合を妨げることのないヘテロ原子置換分を含んでいてもよい）と して特徴付けられる請求項１記載の組成物。
6. ６．低分子量ポリアミドと高分子量ポリアミドのブレンドであるポリアミド基体 より成る組成物。
7. ７．ブレンドが約１〜約９０重量％の低分子量ポリアミドと約１０〜約９９重量 ％の高分子量ポリアミドとより成る請求項６記載の組成物。
8. ８．低分子量ポリアミド中のアミン濃度がポリマー１０６ｇあたり７０〜１５０ ０当量であり、そして高分子量ポリアミド中のアミン濃度がポリマー１０６ｇあ たり８０当量を超えない請求項６記載の組成物。
9. ９．基体が不活性支持体上に支持されている請求項６記載の組成物。
10. １０．アミン基濃度がポリマー１０６ｇあたり少くとも約６０当量である請求項 ６記載の組成物。
11. １１．基体表面積が窒素吸着により測定した場合に少くとも約１ｍ２／ｇである 請求項６記載の組成物。
12. １２．アミン基が−ＮＲＲ′（式中、ＲおよびＲ′は独立的にＨ、Ｃ１−１０の 分枝状、非分枝状または環状アルキル、Ｃ６アリールまたはＣ７−１２アラルキ ルであり、また該アルキル、アリールまたはアラルキル基は生物学的検体のポリ アミド基体への結合を妨げることのないヘテロ原子置換分を含んでいてもよい） として特徴付けられる請求項６記載の組成物。
13. １３．核酸、タンパク質、バクテリアまたはウイルスより選択された材料を請求 項１記載のポリアミド基体と接触させることより成る該材料を電気泳動ゲルまた は培養媒質から移動させる方法。
14. １４．核酸、タンパク質、バクテリアまたはウイルスより選択された材料を請求 項２記載のポリアミド基体と接触させることより成る該材料を電気泳動ゲルまた は培養媒質から移動させる方法。
15. １５．ＤＮＡ含有材料を請求項６記載のポリアミド基体と接触させることより成 るＤＮＡの吸着方法。