JPH0320234B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は固定化された微生物菌体もしくは酵素
の製法に関し、その目的とするところは酵素活性
の低下が著しく少なく、しかも機械的ゲル強度の
強い固定化された微生物菌体もしくは酵素を簡易
な操作で効率良く得る方法を提供することにあ
る。 従来、微生物菌体もしくは酵素をカラギーナ
ン、寒天もしくはゼラチンで包括固定化する方法
は、比較的温和な条件でゲル化するため、固定化
に際し酵素活性の低下が起り難く、又食品衛生上
も安全な方法として近年食品、医薬工業への応用
が試みられている。 しかしながら、上記したカラギーナン、寒天も
しくはゼラチンで包括したゲルは、ポリアクリル
アミド、ポリメタアクリレート等の高分子化合物
を用いた包括ゲルに比してゲルの機械的強度が弱
く、変形しやすい等の欠点があるため、発酵法等
で一般的に使用されている充填層型リアクターに
用いるのは困難であり、たとえ該ゲルを充填した
としても充填効率が劣る等の欠点がある。 また、微生物菌体もしくは酵素含有ゲルの固定
化担体として、無機物質、特にシリカゲルを用い
る方法としては、次のような方法が知られてい
る。例えば英国特許第1267685号の方法は、ケイ
酸ナトリウム水溶液に塩酸を加えPH1.6のシリカ
ゾルを調製し、これを透析により食塩等の塩を除
去して安定なシリカゾルを得、該ゾルのPHを５〜
８程度に調整後、これに微生物菌体もしくは酵素
を加えてゲル化させるものであり、又特開昭52−
120190号及び特開昭54−49392号の方法において
は、コロイド状シリカに酵素を吸着させた後、塩
を加えてゲル化させ、ついで凍結、解凍操作を経
て無定形の破砕状の固定化ゲルを得ている。 しかしながら、これらの方法は、ベースとなる
シリカゾルの調製に時間がかかること、包括固定
化（ゲル化）操作が複雑であること、さらにこれ
をバイオリアクターに用いる場合、無定形のシリ
カゲルであるため、これらを反応容器に充填する
には該容器に適した形状のゲルに調製しなければ
充分な充填効果が得られない等の欠点がある。 そこで本発明者等は、このような従来技術の欠
点を解消すべく鋭意検討した結果、微生物菌体、
酵素等を固定化させる際、ゲル基材としてカラギ
ーナン、寒天もしくはゼラチンにシリカゾルを加
えたゲル基材を用いれば、これを冷却したゲル化
剤と接触させるか、又は冷却油と接触させたのち
固液分離して得られる半固形状のゲルをゲル化剤
に添加することにより速やかにゲル化し得るこ
と、更に得られる微生物菌体もしくは酵素含有ゲ
ルは機械的ゲル強度が著しく強く、しかもカラギ
ーナン、寒天もしくはゼラチンゲルとシリカゲル
の２種のゲル構造を持つため著しく変形し難しく
なること、更には酵素活性低下の著しく少ないも
のであること等を知り、これら知見に基いて本発
明を完成した。 即ち、本発明は、微生物菌体、酵素、酵素をタ
ンニンもしくは多官能性架橋試薬で不溶化したも
の、又は酵素を不溶化担体に吸着したものを、そ
のまま、或はこれらを水、緩衝液もしくは親水性
有機溶媒に懸濁したものを、水、緩衝液もしくは
親水性有機溶媒にゲル基剤としてカラギーナン、
寒天もしくはゼラチンを加熱溶解した液、および
ゲル基材としてシリカゾルを加熱溶解した液に、
ゲル基材が固化せず、かつ微生物菌体もしくは酵
素が死滅もしくは失活しない温度で混合し、つい
でこれを冷却したゲル化剤と接触させるか、又は
冷却油と接触させたのち固液分離して得られる半
固形状のゲルをゲル化剤に添加することを特徴と
する固定化された微生物菌体もしくは酵素の製造
方法である。 以下、本発明について詳述する。 先ず、本発明に用いられる微生物菌体として
は、細菌、酵母、黴、放線菌等、如何なる種別の
菌体でも良い。又酵素も如何なる種別のものでも
良く、例えばアルコール脱水素酵素、グルコース
オキシダーゼ、乳酸脱水素酵素等の酸化還元酵
素、Ｄ−グルタミルトランスフエラーゼ、グルタ
ミントランスアミネース、ヘキソキナーゼ等の転
移酵素、ロイシンアミノペプチダーゼ、カルボキ
シペプチダーゼ、ペニシリナーゼ等の加水分解酵
素、フマラーゼ、アスパルターゼ、β−チロシナ
ーゼ等のリアーゼ酵素、グルコースイソメラー
ゼ、マンノースイソメラーゼ等の異性化酵素、グ
ルタチオンシンセターゼ、NADシンセターゼ等
のリガーゼ酵素等が代表例として挙げられる。 上記した酵素は、タンニンもしくは多官能性架
橋試薬で不溶化させるか、又は該酵素を不溶化担
体に吸着させて用いてもよい。 先ず、タンニンで不溶化させる場合は、酵素量
に対し１〜10倍量（Ｗ／Ｗ）のタンニンを含有す
る溶液を加え、PH８以下、好ましくはPH３〜７で
撹拌しつつ反応させ、得られた酵素沈澱物より例
えば遠心分離、過等の通常の分離手段を用いて
不溶化酵素を得る。 なお上記タンニンとしては、タンニン酸の他、
ピロガロールタンニン例えば没食子タンニン又は
五倍子タンニン、カテコールタンニン例えば茶、
カカオ等から得られるタンニン質分（カテコール
重合体）等が用いられる。これらのタンニンはタ
ンニン作用を有する限り精製されていないもので
も良く、例えば市販の柿渋タンニン等も用いられ
る。これらは単独でも２種以上のタンニン混合物
としても用いることが出来る。 又、多官能性架橋剤で不溶化させる場合は、前
記酵素を１〜20％（Ｗ／Ｖ）の多官能性架橋剤を
含有する液に加え、５〜40℃で10分〜16時間反応
させ、得られた酵素沈澱物より例えば遠心分離、
過等の通常の分離手段を用いて不溶化酵素を得
る。 なお、多官能性架橋剤としては、ポリアルデヒ
ド類、イソシアネート類等が適しており、例えば
ジアルデヒドデンプングリオキザール、マロンア
ルデヒド、コハク酸アルデヒド、グルタルアルデ
ヒド、ピメリジアルデヒド、ヘキサメチレンイソ
シアネート、ｐ−トルイレンジイソシアネート等
が挙げられ、特にグルタルアルデヒドが望まし
い。 そして、酵素を不溶化担体に吸着させる手段と
しては、通常の吸着剤、例えば活性炭、シリカゲ
ル、酸性白土、多孔質ガラス等又DEAE−セフア
デツクス、CM−セフアデツクス、DEAE−セル
ロース、CM−セルロース、アンバーライトIR−
45、ダウエツクス−50等のイオン交換体等の不溶
化担体をカラムに詰めて前記酵素を通液するか、
又は該不溶化担体を酵素と混合、撹拌して吸着さ
せた後、これを必要により例えば遠心分離、過
等の分離手段により不溶化担体に吸着した酵素を
得る。なおその後、必要により、該酵素を吸着し
た不溶化担体に前記多官能性架橋剤を加えて反応
させてもよい。 上記した微生物菌体、酵素、酵素をタンニンも
しくは多官能性架橋試薬で不溶化したもの、又は
酵素を不溶化担体に吸着したものは、そのまま、
或はこれらを水、緩衝液もしくは親水性有機溶媒
に懸濁して使用する。 これに用いる緩衝液としては、例えば酢酸緩衝
液、マツキルヴエイン緩衝液、リン酸緩衝液、ト
リス緩衝液、ベロナール緩衝液等が挙げられ、又
親水性有機溶媒としては、メチルアルコール、エ
チルアルコール、プロピルアルコール、アセトン
等が挙げられ、これらの有機溶媒は通常は10〜20
％（Ｗ／Ｖ）程度で用いられる。 次に上記した微生物菌体、酵素、酵素をタンニ
ンもしくは多官能性架橋試薬で不溶化したもの、
又は酵素を不溶化担体に吸着したものを、そのま
ま、或はこれらを水、または緩衝液、もしくは親
水性有機溶媒に懸濁したものを、水、または緩衝
液、もしくは親水性有機溶媒にゲル基材としてカ
ラギーナン、寒天、もしくはゼラチンを約70℃以
上で加熱溶解した液または該液を適当に冷却した
液、およびゲル基材としてシリカゾルを35〜55℃
程度で加温溶解した液に、35〜55℃程度のゲル基
材が固化せず、かつ微生物菌体もしくは酵素が死
滅もしくは失活しない温度で混合してPH３〜10、
好ましくはPH６〜８のゲル基材混合液を得る。 なお、上記の緩衝液としては、例えば酢酸緩衝
液、マツキルヴエイン緩衝液、リン酸緩衝液、ト
リス緩衝液、ベロナール緩衝液等が挙げられ、又
親水性有機溶媒としては、メチルアルコール、エ
チルアルコール、プロピルアルコール、アセトン
等が挙げられ、これらの有機溶媒は通常10〜20％
（Ｗ／Ｖ）程度で用いられる。 この際、上記の混合液中のカラギーナン及び寒
天の最終含有量は、0.5〜3.0％（Ｗ／Ｖ）程度
で、又ゼラチンは８〜20％（Ｗ／Ｖ）程度であ
り、一方シリカゾルの最終含有量（SiO₂濃度）
は0.5〜35％（Ｗ／Ｖ）程度とするのが望ましい。 なお、ゲル基材として用いられるシリカゾルと
しては、ケイ酸アルカリ水溶液に鉱酸を加え、つ
いで脱塩、PH調整したもの、あるいはケイ酸アル
カリ水溶液をイオン交換樹脂に通過させ、ついで
脱塩したもの等が挙げられ、例えばスノーテツク
ス−20、スノーテツクス−30、スノーテツクス−
40（何れも日産化学株式会社製）等が好適な例と
して挙げられる。 次に上記した混合液を、10℃程度以下に冷却し
たゲル化剤と接触させるか、又は該混合液を冷却
油と接触させたのちふるい等による過もしくは
デカンテーシヨン等で固液分離して得られる半固
形状のゲルをゲル化剤に加えることにより、固定
化された微生物菌体もしくは酵素を得る。 上記した接触手段としては、通常注射器、多孔
板等を用いて滴下するか、もしくは押出すか、又
は噴霧器、好ましくは加圧噴霧器を用いて噴霧、
接触させるのが望ましい。 ゲル化剤としては、例えば塩化カルシウム、塩
化アルミニウム、酢酸カルシウム、酢酸ナトリウ
ム、硫酸アルミニウム、塩化カリウム、塩化アン
モニウム等が用いられ、これらは通常１〜20％
（Ｗ／Ｖ）程度の濃度の溶液として用いられる。 又、冷却油としては、例えばオリーブ油、コー
ン油、パーム油、マツコー鯨頭油、魚油等の動植
物油、スピンドル油、タービン油等の鉱物油、シ
リコーン油、ボイル油、スタンド油等の合成油、
リノール酸、リノレイン酸、オレイン酸等の不飽
和脂肪酸等が用いられ、これらを10℃以下に冷却
した油が用いられる。 なお、上記ゲル基剤としてカラギーナンを用い
る場合、冷却したゲル化剤と接触させてゲル化す
るのが望ましく、又寒天もしくはゼラチンをゲル
基材として用いる場合、冷却油と接触させたのち
固液分離して得られる半固形状のゲルをゲル化剤
に添加することによりゲル化させるのが望まし
い。 又、上記ゲル化手段として、冷却したゲル化剤
と噴霧接触させる手段を採用すれば、ゲルの平均
粒子径が最大限800〜900ミクロン以下のものを得
ることが出来、このような微粒子とすることによ
り基質との反応効率を著しく高め得る利点があ
る。 本発明により得られる固定化された微生物菌体
もしくは酵素は機械的ゲル強度が著しく強く、し
かも交叉した２種のゲル構造を持つため、著しく
変形し難く、更には酵素活性の低下の著しく少な
いものであるので本発明方法は産業上極めて有意
義である。 以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。 実施例 １ グルコース２％（Ｗ／Ｖ）、ペプトン１％
（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス１％（Ｗ／Ｖ）を含む栄養
培地（PH5.0）200mlを１フランスコに入れ、常
法により殺菌した後、該培地にサツカロミセス・
セレビシエーIFO0224を接種し、30℃で48時間培
養して得られた培養液200ml（10⁹／ml）を、45℃
に加温したスノーテツクス−40（日産化学株式会
社製）100ml（PH：7.0）と30％（Ｗ／Ｖ）のゼラ
チン濃度となるようにゼラチンに水を加えたもの
を80℃に加熱溶解し、ついで45℃に冷却したゼラ
チン水溶液100mlに加えて混合し（混合時の温
度：37℃、PH：7.0、SiO₂濃度：18.2％・Ｗ／Ｖ、
ゼラチン濃度：13.6％・Ｗ／Ｖ）、これを注射器
を用いて５℃に冷却したシリコーン油中に滴下し
た後、シリコーン油を８メツシユのふるいで除去
して半固形状のゲルを得、ついでこれを５℃に冷
却した５％（Ｗ／Ｖ）塩化カルシウム溶液中に浸
漬して球状の固定化酵母菌体（実施例１の固定化
酵母菌体）を得た。 対照として、上記酵母培養液20ml（10⁹／ml）
を、15％（Ｗ／Ｖ）のゼラチン濃度となるように
ゼラチンに水を加えたものを80℃に加熱溶解し、
ついで45℃に冷却したゼラチン水溶液200mlに加
えて混合し（PH：7.0、ゼラチン濃度：13.6％・
Ｗ／Ｖ）、これを注射器を用いて５℃に冷却した
シリコーン油中に滴下し、球状の固定化酵母菌体
を得た。 又、アルコール生産性の測定は、上記各固定化
酵母菌体65ｇを30℃に保温したジヤケツト付カラ
ム（内径：３cm、高さ：15cm）に充填し、該カラ
ムにグルコース10％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス0.1％
（Ｗ／Ｖ）、硫安0.2％（Ｗ／Ｖ）を含む液体培地
（PH3.3）を、上昇法（SV＝0.15／Hr）で20日間
通過させつつアルコール発酵を行ない、発酵液の
アルコール濃度を測定することにより行なつた。
その結果を第１表に示す。

【表】 第１表より明らかな如く、実施例１の固定化酵
母菌体のアルコール発酵能は、長期間の保持にも
かかわらず対照に比し著しく優れたものであるこ
とが認められた。 実施例 ２ ウレアーゼ（タイプIX、シグマ社製）を0.05M
燐酸緩衝液に溶解した液10mlを、３％（Ｗ／Ｖ）
の寒天濃度となるように寒天に水を加えたものを
95℃で加熱溶解し、ついで45℃に冷却した寒天水
溶液100mlと40℃に加温したスノーテツクス−30
（日産化学株式会社製）100ml（PH：8.0）とを混
合した液に加えて混合し（PH：7.0、SiO₂濃度：
14.2％・Ｗ／Ｖ、寒天濃度：1.4％・Ｗ／Ｖ）、こ
れをワグナーハンデイーペインターＷ−170（２流
体型、ノズル口径：0.7mm、日本ワグナースプレ
ーテツクス社製）で５℃に冷却したコーン油中に
噴霧圧力120Kg／cm²・Ｇで加圧噴霧した後、コー
ン油を100メツシユのふるいで除去して半固形状
のゲルを得、更に該ゲルを５℃に冷却した５％
（Ｗ／Ｖ）塩化カルシウム溶液中に投入し、固定
化ウレアーゼ（平均粒子径：350ミクロン）を得
た。 実施例 ３ アスペルギルス・オリゼーFERM Ｐ−1149の
〓培養物より硫安分画しDEAE−セルロースを用
いて精製したロイシン・アミノペプチダーゼ標品
10ｇを200mlの0.05Mトリス緩衝液（PH7.0）に溶
解したものを、タンニン酸（和光純薬株式会社
製）20ｇを0.05Mトリス緩衝液（PH7.0）200mlに
溶解したものに混合し、これを常法により遠心分
離して不溶化酵素を得た。この不溶化酵素に、
0.05Mトリス緩衝液（PH7.0）20mlを加えて不溶
化酵素液を調製した。 次に、上記不溶化酵素液を、４％（Ｗ／Ｖ）の
カラギーナン濃度となるようにカツパー・カラギ
ーナンに0.05Mトリス緩衝液（PH：7.0）を加え
たものを90℃で加熱溶解し、ついで45℃に冷却し
たカツパー・カラギーナン水溶液100mlに45℃に
加温したスノーテツクス−20（日産化学株式会社
製）80mlを加え混合した液に、加えて混合し
（PH：7.0、SiO₂濃度：8.0％・Ｗ／Ｖ、カラギー
ナン濃度：2.0％・Ｗ／Ｖ）、これを注射器を用い
て−３℃に冷却した10％（Ｗ／Ｖ）塩化カリウム
水溶液中に滴下し、球状の固定化酵素〔ロイシ
ン・アミノペプチダーゼ活性：23000単位／ゲル
１個（0.8ｇ）〕を得た。 なお、ロイシン・アミノペプチダーゼの酵素活
性の測定は、ロイシン−ｐ−ニトロアニリドを基
質として中台の方法〔中台忠信：日本醤油研究所
報告３、99（1977年）〕で測定した。 実施例 ４ 食塩12％（Ｗ／Ｖ）、グルコース３％（Ｗ／
Ｖ）、肉エキス１％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス１％
（Ｗ／Ｖ）、チオグリコール酸ナトリウム0.1％
（Ｗ／Ｖ）、酢酸0.58％（Ｖ／Ｖ）を含む液体培地
（PH7.2）800mlを１フラスコに入れ、常法によ
り殺菌後、これにペデイオコツカス・ハロフイル
スFERM Ｐ−6420を接種し、30℃で24時間培養
して得られた培養液を常法により遠心分離して該
培養液を20倍に濃縮した。この濃縮液10ml（２×
10¹⁰個／ml）を、２％（Ｗ／Ｖ）の寒天濃度とな
るように寒天に水を加えたものを95℃で加熱溶解
し、ついで45℃に冷却した寒天水溶液100mlと45
℃に加温したスノーテツクス−40（日産化学株式
会社製）50ml（PH：7.0）と混合した液に、加え
て混合し（PH：7.0、SiO₂濃度：12.5％・Ｗ／Ｖ、
寒天濃度：1.25・Ｗ／Ｖ）、これを注射器を用い
て５℃に冷却したリノール酸溶液中に滴下し静置
した後、上澄部のリノール酸を除去して得られた
半固形状のゲルを５℃の0.1M酢酸ナトリウム溶
液（PH：6.0）に浸漬して球状の固定化乳酸菌菌
体を得た。 上記固定化乳酸菌菌体70ｇを、30℃に保温した
ジヤケツト付カラム（内径：３cm、高さ：15cm）
に充填し、該カラムに肉エキス１％（Ｗ／Ｖ）、
ポリペプトン１％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス１％
（Ｗ／Ｖ）、グルコース１％（Ｗ／Ｖ）、チオグリ
コール酸ナトリウム0.1％（Ｗ／Ｖ）、食塩15％
（Ｗ／Ｖ）を含む液体培地（PH：7.2）を上昇法
（SV＝１／Hr）で30日間通過させつつ乳酸発酵
を行なつた。その結果を第２表に示す。

【表】 第２表より明らかな如く、実施例４で得た固定
化乳酸菌の乳酸発酵能は長時間の保持にもかかわ
らず、著しく優れたものであることが認められ
た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 微生物菌体、酵素、酵素をタンニンもしくは
   多官能性架橋試薬で不溶化したもの、又は酵素を
   不溶化担体に吸着したものを、そのまま、或はこ
   れらを水、緩衝液もしくは親水性有機溶媒に懸濁
   したものを、水、緩衝液もしくは親水性有機溶媒
   にゲル基材としてカラギーナン、寒天もしくはゼ
   ラチンを加熱溶解した液、およびゲル基材として
   シリカゾルを加温溶解した液に、ゲル基材が固化
   せず、かつ微生物菌体もしくは酵素が死滅もしく
   は失活しない温度で混合し、ついでこれを冷却し
   たゲル化剤と接触させるか、又は冷却油と接触さ
   せたのち固液分離して得られる半固形状のゲルを
   ゲル化剤に添加することを特徴とする固定化され
   た微生物菌体もしくは酵素の製造方法。