JPS6321475B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は固定化された微生物菌体もしくは酵素
の製造法に関し、その目的とするところは、微生
物汚染並びに酵素活性低下の著しく少ない、しか
も機械的ゲル強度の強い球状ゲルの固定化された
微生物菌体もしくは酵素を簡易な操作で、効率良
く得る方法を提供することにある。 従来、微生物菌体もしくは酵素含有ゲルの包括
固定化担体としては、有機物質では一般にアルギ
ン酸塩、カラギーナン、ゼラチン、寒天等の天然
高分子物質、ポリウレタン等の光硬化性樹脂等が
用いられているが、これらの担体を用いた場合、
ゲル骨格が有機物質であるため、細菌に汚され易
いことの他、ゲルの機械的強度が弱く、変形膨潤
し易い等の欠点がある。 そして固定化担体として、無機物質、特にシリ
カゲルを用いる方法としては、次のような方法が
知られている。例えば英国特許第1267685号の方
法は、ケイ酸ナトリウム水溶液に塩酸を加えPH
1.6のシリカゾルを調製し、これを透析により食
塩等の塩を除去して安定なシリカゾルを得、該ゾ
ルのPHを５〜８程度に調整後、これに微生物菌体
もしくは酵素を加えてゲル化させるものであり、
又特開昭52−120190号及び特開昭54−49392号の
方法においては、コロイド状シリカ（シリカゾ
ル）に酵素を吸着させた後、塩を加えてゲル化さ
せ、ついで凍結、解凍操作を経て無定形の破砕状
の固定化ゲルを得ている。 しかしながら、これらの方法は、ベースとなる
シリカゾルの調製に時間がかかること、包括固定
化（ゲル化）操作が複雑であること、さらにこれ
らをバイオリアクターとして用いる場合、無定形
のシリカゲルであるため、これらを基質反応容器
に充填するには該容器に適した形状のゲルに調製
しなければ充分な充填効果が得られない等の欠点
がある。 一方、ゲル成形を考慮した方法として、特開昭
55−127990号の方法があるが、これは、ケイ酸ナ
トリウムと微生物菌体もしくは酵素の混合水溶液
をトルエン、シクロヘキサン等の疎水性有機液体
に懸濁させ、その状態で酸と接触することにより
ゲル化させて、微生物菌体もしくは酵素を包括固
定化した球状シリカヒドロゲルを得る方法であ
る。 しかしながら、この方法に用いるトルエン、シ
クロヘキサン等の疎水性有機液体（懸濁剤）は、
微生物菌体もしくは酵素の活性を低下させ、又こ
のような懸濁剤をシリカヒドロゲルから分離除去
する操作も著しく繁雑であることの他、得られる
球状シリカゲルの細孔構造が不均一であるため、
ゲルの機械的強度も弱い等の欠点がある。 又特開昭55−131393号の方法は、コロイド状シ
リカ懸濁液、多孔性充填剤及び微生物菌体の混合
物を押出し成型機で成形するものであるが、この
方法においては、工程が複雑であることの他、処
理時間も長くなり、又得られるゲルの機械的強度
も弱い等の欠点がある。 そこで、本発明者等は、このような従来技術の
欠点を解消すべく鋭意検討した結果、微生物菌体
もしくは酵素含有シリカゾルを気相中に放出する
ことにより瞬時にゲル化させれば、包括固定化及
びゲル成形を同時、かつ効率的に行なうことが出
来ること、更に得られる球状ゲルも微生物汚染及
び酵素の活性低下が著しく少なく、機械的ゲル強
度の強いものであること等を知り、本発明を完成
した。 即ち、本発明は、微生物菌体、酵素、酵素をタ
ンニンもしくは多官能性架橋試薬で不溶化したも
の、又は酵素を不溶化担体に吸着したものを水、
緩衝液もしくは親水性有機溶媒に懸濁したもの
を、ケイ酸アルカリ水溶液と酸溶液とを混合して
得られるシリカゾルに加え混合して該混合シリカ
ゾル中のSiO₂濃度を70〜210ｇ／、PHを３〜10
とし、ついでこれを可及的速やかに気相中に放出
しきわめて短時間にゲル化させて球状のシリカゲ
ルとすることを特徴とする固定化された微生物菌
体もしくは酵素の製造法である。 以下、本発明について詳述する。 先ず、本発明に用いられる微生物菌体として
は、細菌、酵母、黴、放線菌等、如何なる種別の
菌体でも良い。又酵素も如何なる種別のものでも
良く、例えばアルコール脱水素酵素、グルコース
オキシダーゼ、乳酸脱水素酵素等の酸化還元酵
素、Ｄ−グルタミルトランスフエラーゼ、グルタ
ミントランスアミネース、ヘキソキナーゼ等の転
移酵素、ロイシンアミノペプチダーゼ、カルボキ
シペプチダーゼ、ペニシリナーゼ等の加水分解酵
素、フマラーゼ、アスパルターゼ、β−チロシナ
ーゼ等のリアーゼ酵素、グルコースイソメラー
ゼ、マンノースイソメラーゼ等の異性化酵素、グ
ルタチオンシンターゼ、NADシンターゼ等のリ
ガーゼ酵素等が代表例として挙げられる。 上記した酵素は、タンニンもしくは多官能性架
橋試薬で不溶化させるか、又は該酵素を不溶化担
体に吸着させて用いてもよい。 先ず、タンニンで不溶化させる場合は、酵素量
に対し１〜10倍量（Ｗ／Ｗ）のタンニンを含有す
る溶液を加え、PH８以下、好ましはPH３〜７で撹
拌しつつ反応させ、得られた酵素沈澱物より例え
ば遠心分離、過等の通常の分離手段を用いて不
溶化酵素を得る。 なお上記タンニンとしては、タンニン酸の他、
ピロガロールタンニン例えば没食子タンニン又は
五倍子タンニン、カテコールタンニン例えば茶、
カカオ等から得られるタンニン質分（カテコール
重合体）等が用いられる。これらのタンニンはタ
ンニン作用を有する限り精製されていないもので
も良く、例えば市販の柿渋タンニン等も用いられ
る。これらは単独でも２種以上のタンニン混合物
としても用いることが出来る。 又、多官能性架橋剤で不溶化させる場合は、前
記酵素を１〜20％（Ｗ／Ｖ）の多官能性架橋剤を
含有する液に加え、５〜40℃で10分〜16時間反応
させ、得られた酵素沈澱物より例えば遠心分離、
過後の通常の分離手段を用いて不溶化酵素を得
る。 なお、多官能性架橋剤としては、ポリアルデヒ
ド類、イソシアネート類等が適しており、例えば
ジアルデヒドデンプングリオキザール、マロンア
ルデヒド、コハク酸アルデヒド、グルタルアルデ
ヒド、ピメリジアルデヒド、ヘキサメチレンイソ
シアネート、ｐ−トルイレンジイソシアネート等
が挙げられ、特にグルタルアルデヒドが望まし
い。 そして、酵素を不溶化担体に吸着させる手段と
しては、通常の吸着剤、例えば活性炭、シリカゲ
ル、酸性白土、多孔質ガラス等、又DEAE−セフ
アデツクス、CM−セフアデツクス、DEAE−セ
ルロース、CM−セルロース、アンバーライトIR
−45、ダウエツクス−50等のイオン交換体等の不
溶化担体をカラムに詰めて前記酵素を通液する
か、又は該不溶化担体を酵素と混合、撹拌して吸
着させた後、これを必要により例えば遠心分離、
過等の分離手段により不溶化担体に吸着した酵
素を得る。なおその後、必要により、該酵素を吸
着した不溶化担体に前記多官能性架橋剤を加えて
反応させてもよい。 上記した微生物菌体、酵素、酵素をタンニンも
しくは多官能性架橋試薬で不溶化したもの、又は
酵素を不溶化担体に吸着したものは、水、緩衝液
もしくは親水性有機溶媒に懸濁して使用する。 これに用いる緩衝液としては、例えば酢酸緩衝
液、マツキルヴエイン緩衝液、リン酸緩衝液、ト
リス緩衝液、ベロナール緩衝液等が挙げられ、又
親水性有機溶媒としては、メチルアルコール、エ
チルアルコール、プロピルアルコール、アセトン
等が挙げられ、これらの有機溶媒は通常は10〜20
％（Ｗ／Ｖ）程度で用いられる。 一方、ケイ酸アルカリ水溶液と酸溶液とを混合
してシリカゾルを調製する。 このケイ酸アルカリ水溶液としては、ケイ酸ナ
トリウム、ケイ酸カルウム、ケイ酸リチウム等の
ケイ酸アルカリ金属塩あるいはケイ酸アンモニウ
ム等の水溶液が挙げられ、又酸溶液としては硫
酸、塩酸、硝酸等の無機酸、酢酸等の有機酸溶液
が用いられる。 次に、ケイ酸アルカリ水溶液と酸溶液とを混合
して得たシリカゾルに、上記した微生物菌体、酵
素、酵素をタンニンもしくは多官能性架橋試薬で
不溶化したもの、又は酵素を不溶化担体に吸着し
たものを水、緩衝液もしくは親水性有機溶媒に懸
濁したものを加え、可及的速やかに微生物菌体も
しくは酵素を該混合シリカゾル中で均一となるよ
うに混合して該混合シリカゾル中のSiO₂濃度を
70〜210ｇ／、好ましくは130〜180ｇ／、か
つPHを３〜10、好ましくは６〜８とする。 なお、上記混合シリカゾルを調製する際、コロ
イド状シリカ、アルミナシリカゾル及びアルミナ
ゾルより撰ばれた少なくとも１種のゾルを、上記
混合シリカゾルに添加すれば、シリカゲル構造を
補強させる意味で有利となる。 又、上記の如く混合シリカゾル中のSiO₂濃度
を70〜210ｇ／、PH３〜10とすることは、混合
シリカゾルをきわめて短時間でゲル化させ、かつ
微生物菌体もしくは酵素含有シリカゲルの機械的
強度を増大させる上で、極めて重要である。 ついで、上記の如くして得た混合シリカゾル
を、放出口より可及的速やかに気相中に放出し、
きわめて短時間、通常は５秒以内、好ましくは２
秒以内にゲル化させることにより、球状の固定化
された微生物菌体もしくは酵素含有シリカゲルを
得る。 ここに用いられる気相媒体としては、通常は空
気であるが、所望によつては窒素ガスのような不
活性ガスを用いてもよい。 そして、上記気相中におけるゲル化はきわめて
短時間で完了するため、微生物、特に雑菌等に汚
染される可能性が少なく、しかも目的とする微生
物菌体もしくは酵素の活性低下を実質的に防止す
ることが出来る。 なお、上記ゲル化操作により得られるゲルの形
状が球形であるため、ゲルの機械的強度が高ま
り、該ゲルを基質接触塔に充填して基質と反応さ
せた場合、ゲル間相互の空隙率をほぼ一定に保持
することが出来、これにより基質反応効率の低下
を実質的に防止し得る等の利点がある。 又、本発明により得られる球状の固定化された
微生物菌体もしくは酵素含有ゲルの粒径は、気相
中へ放出させるための放出ノズルの口径等を調節
することにより、50μ〜10mm程度の粒径のものが
得られるが、特に平均粒子径が500μ程度以下の
細粒のゲルとすれば、基質との反応効率を著しく
高めることが出来、有利となる。 なお、上記した固定化された微生物菌体もしく
は酵素を得るのに用いられる装置としては、本発
明の目的が達成されるものであれば、如何なる形
状、構造のものでもよいが、例えば容器の上部に
ケイ酸アルカリ水溶液及び酸溶液の導入口を有
し、該容器の下部に微生物菌体もしくは酵素の導
入口を備え、かつ該容器内に混合翼を設け、又該
容器底部より微生物菌体もしくは酵素含有シリカ
ゾルを気相中へ放出するための放出ノズルを具備
した容器が、本発明を効率的に実施する上で望ま
しい。 以上の如く、本発明によれば、微生物菌体もし
くは酵素含有シリカゾルの包括固定化及びゲル成
形をきわめて短時間に、同時かつ効率的に行なう
ことが出来、得られるゲルは微生物汚染並びに酵
素活性の低下が著しく少なく、しかも機械的ゲル
強度の著しく強いものである。 以下、実施例により本発明をさらに具体的に説
明する。 実施例 １ ケイ酸ナトリウム水溶液（SiO₂／NaO₃のモル
比：３、４、SiO₂含有濃度：18％・Ｗ／Ｖ）及
び4N−硫酸水溶液を、定量用ポンプを用いて撹
拌翼並びに放出口を有する容器内に別個の導入口
より夫々圧送し、更に該容器内の別の導入口より
サツカロミセス・セレビシエIFO0224を培養、集
菌、0.05Mリン酸緩衝液（PH6.0）に懸濁させた
液（酵母生菌体数：1.0×10¹⁰／ml）を一定の割
合で加えて混合し（容器内混合シリカゾル中の
SiO₂濃度：130ｇ／、PH：7.5）、該容器底部の
放出口（ノズル口径：２mm）より該混合シリカゾ
ルを連続的に空気中へ放出し（ゲル化時間：1.5
秒）、酢酸緩衝液（PH5.5）含有受皿で酵母菌体含
有シリカヒドロゲルを捕集した。 得られた固定化酵母菌体は、球状で平均粒子径
２〜３mmのもの（乾量基準の含水率：520％）で
あつた。 次にこの固定化酵母菌体のエタノール生産性を
次のようにして測定した。 上記固定化酵母菌体65ｇを30℃に保温したジヤ
ケツト付カラム（内径：３cm、高さ：15cm）に充
填し、該カラムにグルコース８％（Ｗ／Ｖ）、硫
安0.2％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス0.1％（Ｗ／Ｖ）
を含む液体培地（PH3.3）を上昇法（SV＝0.2）で
22日間通過させつつエタノール発酵を行なつた。
その結果を第１表に示す。

【表】 第１表より、実施例１で得た固定化酵母菌体の
エタノール発酵能は、長期間の保持にも係らず著
しく優れたものであることが認められた。 実施例 ２ ケイ酸ナトリウム水溶液（SiO₂／Na₂Oのモル
比：3.4、SiO₂含有濃度：25％・Ｗ／Ｖ）及び8N
−硫酸水溶液を、定量用ポンプを用いて撹拌翼並
びに放出口を有する容器内に別個の導入口より
夫々圧送し、更に該容器内の別の導入口よりウレ
アーゼ（タイプ９、シグマ社製）の１％・Ｗ／Ｖ
水溶液を一定の割合で加えて混合（容器内混合シ
リカゾル中のSiO₂濃度：209ｇ／、PH：5.5）、
該容器底部の放出口（ノズル口径：２mm）より該
混合シリカゾルを連続的に空気中へ放出し（ゲル
化時間：1.0秒）、固定化ウレアーゼ含有シリカヒ
ドロゲルを捕集した。 得られた固定化ウレアーゼは、球状で平均粒子
径５〜６mmのもの（乾量基準の含水率：400％）
であつた。 実施例 ３ ケイ酸ナトリウム水溶液（SiO₂／Na₂Oのモル
比：3.4、SiO₂含有濃度：18％・Ｗ／Ｖ）及び4N
−塩酸溶液を、定量用ポンプを用いて撹拌翼並び
に放出口を有する容器内に別個の導入口より夫々
圧送した。 一方、タンニン酸〔和光純薬(株)製〕200ｇを200
mlの0.05Mトリス緩衝液（PH7.0）に溶解したも
のと、アスペルギルス・オリゼーFERM Ｐ−
1149の皺培養物より硫安分画したDEAE−セルロ
ースを用いて精製したロイシン・アミノペプチダ
ーゼ標品20ｇを2000mlの0.05Mトリス緩衝液（PH
7.0）に溶解したものとを混合し、これより遠心
分離して得た不溶化酵素に、0.05Mトリス緩衝液
（PH7.0）100mlを加え、不溶化酵素液を調製した。 次に上記容器内の別の導入口より、この不溶化
酵素液を一定の割合で加えて混合し（容器内混合
シリカゾル中のSiO₂濃度：130ｇ／、PH：7.5）、
該容器底部の放出口（ノズル径：２mm）より該混
合シリカゾルを連続的に空気中へ放出し（ゲル化
時間：1.8秒）、トリス緩衝液（PH7.0）含有受皿
でロイシン・アミノペプチダーゼ含有シリカヒド
ロゲルを捕集した。 得られた固定化ロイシン・アミノペプチダーゼ
は、球状で平均粒子径１〜２mmのもの（乾量基準
の含水率：530％）であつた。 なお、上記操作より得られた固定化ゲル１個
（約0.2ｇ／個）当りのロイシン・アミノペプチダ
ーゼ活性は、ロイシン−ｐ−ニトロアニリドを基
質として中台の方法〔中台忠信、日本醤油研究所
報告３、99（1974年）〕で測定した結果、12000単
位であつた。 実施例 ４ ケイ酸ナトリウム水溶液（SiO₂／Na₂Oのモル
比：3.4、SiO₂含有濃度：18％・Ｗ／Ｖ）及び4N
−硫酸水溶液を、定量用ポンプを用いて撹拌翼並
びに放出口を有する容器内に別個の導入口より
夫々圧送し、更に該容器内の別の導入口よりペデ
イオコツカス・ハロフイラスFERM Ｐ−6420を
培養、集菌し、コロイド状シリカゾル（SiO₂濃
度30％水溶液、スノーテツクス30、日産化学株式
会社製）に懸濁させた液（PH：7.0、乳酸菌生菌
体数：50×10¹⁰／ml）を一定の割合で加えて混合
し（容器内混合シリカゾル中のSiO₂濃度：168
ｇ／、PH：7.5）、該容器の底部の放出口（ノズ
ル口径：1.5mm）より該混合シリカゾルを連続的
に空気中へ放出し（ゲル化時間：1.5秒）、0.1M
リン酸緩衝液（PH7.0）含有受皿で乳酸菌菌体含
有シリカヒドロゲルを捕集した。 得られた固定化乳酸菌菌体は、球状で平均粒子
径２〜３mmのもの（乾量基準の含水率：500％）
であつた。 次に、この固定化乳酸菌菌体の乳酸発酵性の測
定を次のようにして行つた。 上記固定化乳酸菌菌体133ｇを30℃に保温した
ジヤケツト付カラム（内径：３cm、高さ：30cm）
に充填し、該カラムに肉エキス１％（Ｗ／Ｖ）、
ポリペプトン１％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス１％
（Ｗ／Ｖ）、グルコース１％（Ｗ／Ｖ）、チオグリ
コレート0.1％（Ｗ／Ｖ）、NaCl15％（Ｗ／Ｖ）
を含む液体培地（PH7.2）を上昇法（SV＝0.1）で
30日間通過させつつ乳酸発酵を行なつた。その結
果を第２表に示す。

【表】 第２表より、実施例４で得た固定化乳酸菌菌体
の乳酸発酵能は長期間の保持にも係らず著しく優
れたものであることが認められた。 実施例 ５ ケイ酸ナトリウム水溶液（SiO₂／Na₂Oモル
比：3.4、SiO₂含有濃度：18％・Ｗ／Ｖ）及び4N
−硫酸水溶液を定量用ポンプを用いて撹拌翼並び
に放出口を有する容器内に別個の導入口より夫々
圧送し、更に該容器内の別の導入口よりサツカロ
ミセス・セレビシエIFO0224を培養、集菌し、酢
酸緩衝液（PH5.5）に懸濁させた液（酵母生菌体
数：1.0×10¹⁰・ml）を一定の割合で加えて混合
し（容器内混合シリカゾル中のSiO₂濃度：130
ｇ／、PH：7.5）、該容器底部の放出口（ノズル
口径：1.5mm）より該混合シリカゾルを連続的に
空気中へ放出し、該飛翔中のシリカゾルに横方向
より圧縮空気を吹き付けて微粒化し（ゲル化時
間：1.5秒）、酢酸緩衝液（PH5.5）含有受皿で酵
母菌体含有シリカヒドロゲルを捕集した。 得られた固定化酵母菌体は、球状で平均粒子径
400ミクロンのもの（乾量基準の含水率：520％）
であつた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 微生物菌体、酵素、酵素をタンニンもしくは
   多官能性架橋試薬で不溶化したもの、又は酵素を
   不溶化担体に吸着したものを水、緩衝液もしくは
   親水性有機溶媒に懸濁したものを、ケイ酸アルカ
   リ水溶液と酸溶液とを混合して得られるシリカゾ
   ルに加え混合して該混合シリカゾル中のSiO₂濃
   度を70〜210ｇ／、PHを３〜10とし、ついでこ
   れを可及的速やかに気相中に放出しきわめて短時
   間にゲル化させて球状のシリカゲルとすることを
   特徴とする固定化された微生物菌体もしくは酵素
   の製造法。 ２ 混合シリカゾルに、コロイド状シリカ、アル
   ミナシリカゾル、及びアルミナゾルより選ばれた
   少なくとも１種のゾルを添加することを特徴とす
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ ゲル化時間が５秒以内である特許請求の範囲
   第１項記載の方法。 ４ 固定化された微生物菌体もしくは酵素のゲル
   平均粒子径が500ミクロン以下である特許請求の
   範囲第１項記載の方法。 ５ 混合シリカゾル中のSiO₂濃度を130〜180
   ｇ／、PHを６〜８に夫々調整することを特徴と
   する特許請求の範囲第１項記載の方法。