DE3336235A1 - Granulatfoermiges immobilisiertes enzym und verfahren zu dessen herstellung - Google Patents
Granulatfoermiges immobilisiertes enzym und verfahren zu dessen herstellungInfo
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Description
Beschreibung
dessen Herstellung
Die Erfindu \q betrifft eine teilchenförmige immobilisierte
Enzymzubereitung, bestehend aus einem Träger auf dessen Oberfläche das Enzym festgehalten wird (gebunden
ist).Unter "Oberfläche des Trägers" ist hier sowohl die äußere Oberfläche als auch bei einem porösen
Träger die innere Oberfläche zu verstehen.
Das Gebiet der immobilisierten Enzyme und Träger zur Immobilisie "ung von Enzymen weitet sich rasch aus.
Üblicherweise besitzt der Träger die Form kleiner
Teilchen möglicherweise abgewogen bzw. mit vorbestimmten
Gewicht, in die das Enzym eingebettet oder auf deren Oberfläche das Enzym gebunden oder fixiert
ist. In der US-PS 4 266 029, US-PS 4 116 771 und DK-PS 133 380 sind Träger beschrieben (auf oder in
denen Enzyme fixiert sind).
Der im Zusa-mmenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
angewandte Träger gehört zu der Gruppe von Trägern,
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auf deren Oberfläche das Enzym fixiert ist im Gegensatz zu der Gruppe von Trägern, bei denen das Enzym in der gesamten
Masse des Trägers verteilt ist.
Ein typischer bekannter Träger, der zu dieser erwähnten Gruppe von Trägern gehört, auf deren Oberfläche das
Enzym fixiert ist, besteht aus teilchenförmiger (granulatfömiger)
Gelatine und ist beschreiben in Derwent 080 C/5 (J 5 4156-892). Teilchen aus reiner Gelatine sind
jedoch nicht hart genug, um bei Festbettverfahren im grossen Maßstab angewandt zu werden, wenn hohe Fließgeschwindigkeiten
erforderlich sind. Auch sind Teilchen von reiner Gelatine verhältnismäßig teuer.
Ein ähnlicher Träger, der auch zu dieser Gruppe gehört und bei dem ein inerter Kern mit Gelatine überzogen ist, kann
nach der US-PS 4 266 029 hergestellt werden. Obwohl dieser Träger gute Fließcharakteristika aufweist, besitzt er
den Nachteil, daß die Form und Größe der Trägerteilchen
nicht so gewählt werden kann, daß sie die beste Wirkung in einer Säule ergeben, sondern durch die spezielle Sandfraktion
oder andere Fraktion eines feinteiligen dichten Materials, das als Rohmaterial angewandt wird, vorgegeben
sind. Darüber hinaus ist dieser Träger, obwohl er leicht im Labormaßstab hergestellt werden kann, schwierig oder
unter Umständen garnicht im industriellen Maßstab herstellbar .
Ein anderer typischer bekannter Träger, der zu dieser Gruppe gehört, ist beschreiben in Advances in Experimental
Medicine and Biology, Bd. 42, S. 191 - 212, Immobilized
Biochemicals and Affinity Chromatography. Dieser Träger besteht aus Glasperlen mit einem Silen-Kupplungsmittel
Diese Perlen besitzen ausgezeichnete Fli^ßeigenschaften
und eine verhältnismäßig hohe Beladbarkeit. Sie sind
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jedoch sehr teuer und wie bei allen anorganischen Trägern
müssen mühsaiue chemische Behandlungen durchgeführt werden, die auch die Anwendung unerwünschter bzw. unangenehm zu
handhabender Substanzen umfassen um die Träger zur Immobilisierung von Enzymen geeignet zu machen.
Es ist daher Aufgabe der Erfindung ein immobilisiertes Enzym sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung zu entwickeln, wobei
das Enzym auf der Oberfläche eines Trägers festgehalten
wird, wodurch der Träger bzw. das auf dem Träger immobilisierte Enzym alle oben erwähnten wünschenswerten Eigenschaften
besitzt, d. h. eine ausreichende Härte, eine leichte Herstellbarkeit im industriellen Maßstab mit Hilfe
einer einfachen chemischen Behandlung und geringe Her— stellungskosten.
Erf indungsgen.äß wurde eine teilchenförmige immobilisierte
Enzymzubereituug sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung entwickelt,
umfassend einen Träger auf dessen Oberfläche die Enzyme festgehalten werden, wobei der Träger gebildet
wird durch Kombination von 2 Phasen, d. h. a) einer kontinuierlichen Phase aus einem wasserlöslichen Bindemittel,
das zumindest teilweise in einem wäßrigen Medium gelöst oder dispergisrt ist und b) einer diskontinuierlichen
Phase aus einer Vielzahl diskreter harter inerter Teilchen, die klt-in genug sind, daß sie bei der Formung des
Trägers nicht stören und durch unlöslich Machen des Bindemittels in dem Medium, in dem das Enzym gegebenenfalls
angewandt wird soweit erforderlich und wobei der Träger mit einem Enzym zusammengebracht wird, das auf der Oberfläche
des Trägers festgehalten wird. Wenn das Medium, in dem das inmobilisierte Enzym letzten Endes angewandt
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X-
werden soll, ein wäßriges Medium ist, ist es erforderlich,
das (ursprünglich) wasserlösliche Bindemittel durch chemische
oder physikalische Behandlung , z. B. durch Vernetzen oder Erhitzen unlöslich zu machen. Wenn das Medium,
in dem das immobilisierte Enzym schließlich angewandt werden soll ein nicht wäßriges Medium ist, kann das (ursprünglich)
wasserlösliche Bindemittel in diesem nicht wäßrigen Medium unlöslich sein und in diesem Falle ist es
nicht erforderlich das Bindemittel unlöslich zu machen.
Aus Gründen der Vollständigkeit wird auf iie Tatsache hingewiesen, daß der Träger andere Bestandteile neben den
oben erwähnten notwendigen Bestandteilen a) und b) enthalten kann, z. B. Füllstoffe und/oder Granulationshilfsmittel.
Überraschenderweise hat es sich gezeigt, daß durch das
erfindungsgemäße Verfahren die oben angegebene Aufgabe gelöst werden kann. Es hat sich auch überraschenderweise
gezeigt, daß der Träger seinen ausgezeichneten physikalisehen Zusammenhalt beibehält selbst bei hohen Anteilen
inerter Teilchen bis zu 98 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Trägers. Das ist sehr w.rchtig, da der
Träger um so härter und die Kosten um so niedriger werden, je höher der Anteil an inerten Teilchen 'bis zu der oben
angegebenen Grenze) ist.
Wenn das immobilisierte Enzym eine Lipasc ist und die Lipase angewandt werden soll, um Lipide :.n einer Petroletherlösung
umzuestern, können Albumin, Casein, Sojaprotein, Hydroxyethylcellulose, Agar, Alginate, Polyvinylalkohole,
Stärke, Methylcellulose oder Carboxymethylcellulose als Bindemittel angewandt werden, da diese Materialien
in Petrolether unlöslich sind. In diesem Falle ist nur eine lose Haftung zwischen dem Träger und*dem Enzym erforderlich.
Wenn andererseits das Enzym rit dem der Trä-
ger angewandt wird,Amyloglukosidase ist und die Amyloglukosidase
angewandt werden soll(um Dextrine in wäßriger
Lösung zu spa..'ten, ist es notwendig, das (ursprünglich) wasserlösliche Bindemittel unlöslich zu machen. Üblicherweise
wird die Amyloglukosidase durch Vernetzung bzw. Verknüpfung -mit Glutaraldehyd auf der Oberfläche des
Trägers festgehalten oder fixiert.
Selbstverständlich ist nicht zwangsläufig jede beliebige
-\ 0 Kombination irgendeines Enzyms und irgendeiner der beiden Trägerphasen
a) And b) wirksam. Der Fachmann weiß, daß einige Enzyme mit bestimmten Kationen nicht verträglich
sind, die in geringen Mengen von der Phase b) abgegeben werden können.und wenn das immobilisierte Enzym zur Ver-]5
wendung in der Nahrungsmittelindustrie vorgesehen ist, können einige der Komponenten für die Phase a)
wenicer günstig sein, da schädliche Bestandteile
in den Auslauf aus dem Enzymreaktor gelangen können.
In der DK-Anmeldung 1592/78 (Standard Brands , entsprechend
US-PS 4 110 164 bzw. BE-PS 865 900) ist immobilisierte
Glukoseisomerase beschrieben, die durch Ionenaustausch an einem Träger festgehalten wird, bestehend aus
faseriger ionenaustauschender Cellulose, die eingebaut 5 ist in ein hydrophobes Polymer und gegebenenfalls ein
Verdichtungsmittel wie pulverförmige Metalloxide enthält.
Der Träjer wird hergestellt durch Schmelzen des
hydrophoben Polymers und Vermischen der Cellulose und des Verdichtungsmittel mit dem geschmolzenen Polymer.
Dieses Verfanren besitzt jedoch verschiedene Nachteile. In erster Linie ist der Preis derartiger hydrophober
Polymeren verhältnismäßig hoch und zweitens ist es wesentlich einfacher mit wäßrigen Lösungen oder Suspensio-
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nen von Bindemitteln gemäß der Erfindung zu arbeiten als mit hydrophoben Polymeren. Auch ist das in der DK-Anmeldung
1592/78 beschriebene Verfahren streug begrenzt auf
Enzymen, die auf Ionenaustauscherharzen immobilisiert sind, d. h. mit einer monomolekularen Enzymschicht, während
das erfindungsgemäße Verfahren geeignet ist für alle Anbindungs- bzw. Fixierungsverfahren von Enzymen auf Trägemund
sowohl für monomolekulare Enzymschichten als auch für multimolekulare Enzymschichten. So ist es z. B. im
0 Falle von Glukoseisomerase aufgrund der freien Wahl der
Schichtdicke des Enzyms erfindungsgemäß uöglich sehr hohe
Werte für die spezifische Aktivität zu erhalten, während der Maximalwert für die spezifische Aktivität der immobilisierten
Glukoseisomerase nach der DK-Anmeldung 1592/78 verhältnismäßig niedrig ist und eindeutig zu niedrig für
industrielle Anwendungen.
Bei einer bevorzugten erfindungsgemäßen Arbeitsweise besteht
das Zusammenbringen der beiden Phasen in einem Vermischen der· kontinuierlichen Phase und cer diskontinuierlichen
Phase woraufhin das Gemisch anschließend zu einem teilchenförmigen vorzugsweise kugelförmigen Träger geformt
wird. Auf diese Weise werden billige und leicht zugängliche Trägerteilchen erhalten.
Bekannte Verfahren zur Herstellung von Gelatinekugeln oder abgerundeten Gelatineteilchen sind verhältnismäßig
kostspielig und mühsam. Es wird auf die DK-PS 133 380 verweisen, in der beschrieben wird, daß derartige GeIatineteilchen
hergestellt werden durch Zusatz einer wäßrigen Lösung von Gelatine (und Enzym) i.u n-Butanol und
Abtrennung der entstandenen tropfenartigen Teilchen. Erfindungsgemäß
hat es sich jedoch gezeigt daß Kugeln oder runde Teilchen aus einem Gemisch aus einem Binde-
3r-· mittel und einem inerten Material auf wesentlich billigere
Weise hergestellt werden können, z. B. mit Hilfe
eines Marumerizer (s. ζ. B. US-PS 3 277 520) oder mit
Hilfe einer speziellen Granuliervorrichtung (s. z. B. US-PS 4 106 991). Darüber hinaus verleiht der Einschluß
einer Mehrzahl von kleinen harten Teilchen den Trägerteilchen eine hohe Härte, was ihre Fließeigenschaften
wesentlich verbessert und sie für Arbeiten in Säulen im großen Maßstao mit sehr hohen Fließgeschwindigkeiten geeignet
macht.
■\ Q Bei einer bevorzugten erfindungsgemäßen Arbeitsweise besteht
die Formgebung in einer Behandlung zur Erzeugung kugelförmiger Teilchen, die in einem Marumerizer entsprechend
US-PS 3 277 520 durchgeführt wird. Auf diese Weise können Kugeln, die geeignet sind zum Arbeiten in
Säulen und die ausgezeichnete physikalische Eigenschaften besitzen, hergestellt werden.
Bei einer weiteren bevorzugten Arbeitsweise nach der Erfindung wird die Kugelform erhalten mit Hilfe einer Granuliervorrichtung
wie in der US-PS 4 106 991 beschrieben. Auf diese Weise können sehr billige Kügelchen mit ausgezeichneten
physikalischen Eigenschaften hergestellt werden.
Es ist ebenfalls erfinäingsgemäß bevorzugt, ein gelierbares
Mittel zu der kontinuierlichen Phase zuzusetzen vor, während oder nach dem Vermischen mit der diskontinuierlichen
Phase, woraufhin die so erhaltene Masse in ein Geliermedium
extrudiert oder getropft wird, wobei ein Vernetzungsmittel während irgendeiner Stufe zugesetzt werden kann.
Hierdurch köi nen Teilchen mit sehr gleichmäßiger Form erhalten werien.
Das gelierbare Mittel ist-vorzugsweise Gelatine, Alginat,
Carrageen oder Chitosan. Hierdurch können sehr gleichmäßige Teilchen mit ausgezeichneter Kohäsion erhalten
werden.
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Das Geliermedium ist vorzugsweise eine Lösung enthaltend Ca ,Ba , K , Polyphosphat oder Ferncyanid oder kaltes
Wasser oder ein kalter Luftstrom. Hierdurch werden ebenfalls Teilchen mit einer sehr gleichmäßigen Form und
ausgezeichneten Kohäsion erhalten.
Bei einer weiteren bevorzugten Arbeitsweise nach der Erfindung ist die kontinuierliche Phase ein wasserlösliches
Protein insbesondere Gelatine, Sojaprotein, Casein,
IQ Albumin, Zein, Gluten oder ein Proteinhydrolysat oder
ein Polysaccharid insbesondere Agar, Alginat oder ein anderer Gummi, Mehl, Stärke oder Chitosan oder ein synthetisches
Material, Carboxymethylcellulose, Methylcellulose, Ethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Hydroxypropylcellulose,
Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon oder Natriumsilicat. Die kontinuierliche Phase kann irgendein
Gemisch von geeigneten Bindemitteln z. B. irgendein Gemisch der oben angegebenen Materialen sein. Mit diesen
Bindemitteln ist es möglich, einen Träger mit ausgezeichneten physikalischen Eigenschaften zu erhalten selbst
bei einem sehr niedrigen Anteil in Bezi hung auf die diskontinuierliche
Phase.
Die diskontinuierliche Phase ist vorzugsweise Diatomeenerde, zerstoßener Sand, Ziegelstaub, Ton, Nylonpulver,
unlösliche Metalloxide oder unlösliche Metallsalze, gemahlene Kieselsäure, Aerosil, gemahlene Tonerde, Korund,
gemahlenes Glas, gemahlener Flint, gemahlener Quarz, gemahlener Granit, Aluminiumphosphat, Kaolin, Bentonit,
Perlit, Zeolite, Calciumsilicat, Filterhilfe mit Mikrozellen, zerstoßenes Magnesiumsilicat, Talkum, Asbest,
abgeriebene Hornblende, Titandioxid, Zinnoxid, Polierpulver, gemahlenes Zirkoniumsilicat, Ruß, Aktivkohle,
Knochenmehl, Flugasche oder Metallpulver. Die diskontioc
nuierliche Phase kann irgendein Gemisch der diskreten bzw. feinteiligen harten inerten Teilchen sein, z. B.
irgendein Gemisch der oben angegebenen Materialien. Diese Materialien sind billig und führen zu einem Träger mit
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- st -
guten mechanischen Eigenschaften.
Die Menge der diskontinuierlichen Phase liegt vorzugsweise zwischen etwa 10 und etwa 98 Gew.-% bezogen auf
das Gesamtgewicht des Trägers.vorzugsweise zwischen 50
und 9 5 Gew.-% bezogen auf das Gesamtgewicht des Trägers. Auf diese Weise kann eine günstige Kombination von niedrigen
Kosten and ausgezeichneten physikalischen Eigenschaften des Trägers erreicht werden.
Die lineare Größe eines einzelnen inerten Teilchens in
der diskontinuierlichen Phase.berechnet als Durchmesser
einer Kugel mi1-, dem gleichen Volumen als einzelnes inertes
Teilchen beträgt weniger als 1/5 des Durchmessers des T5 Trägerteilchens vorzugsweise weniger als 1/20 des Durchmessers
des Trägerteilchens. Mit inerten Teilchen dieser Größe kann die Formung ohne Schwierigkeiten durchgeführt
werden.
Die kontinuierliche Phase wird vorzugsweise durch Vernetzen
mit Hilfe eines geeigneten Vernetzungsmittels/ vorzugsweise Glutaraldehyd unlöslich gemacht. Auf diese
Weise wird der mechanische Zusammenhalt der Trägerteilchen noch weicer verbessert.
Vorzugsweise ist gemäß der Erfindung die Form der Trägerteilchen sphärisch oder rund und der mittlere Durchmesser
der Trägerteilchen liegt zwischen 0,1 und 5 vorzugsweise zwischen 0,2 und 2 mm insbesondere zwischen 0,2
und 1 mm. Hierdurch wird ein Träger mit einem guten Kompromiß zwischen den Fließeigenschaften und dem Oberflächenbereich
erhalten.
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- us -
Es ist besonders günstig, den Träger mit einer Lösung des Enzyms und mit einem Vernetzungsmittel zu behandeln.
Hierdurch wird eine ausgezeichnete Haftung zwischen dem Träger und dem Enzym erreicht und damit ein immobilisiertes
Enzym mit einer außerordentlich guten physikalischen Stabilität.
Es ist bevorzugt den Träger als fluidisierte Masse in einen Turm einzubringen und die Lösung des löslichen Enzyms
in den Turm einzusprühen, woraufhin die so entstandene Masse aus dem Turm entfernt und mit dem Vernetzungsmittel
behandelt wird. Das immobilisierte Enzym kann so erfindungsgemäß mit einem sehr hohen Gehalt an Enzym auf
dem Träger hergestellt werden.
Besonders günstig ist es, wenn der Träger als fluidisierte Masse in einen Turm eingebracht und ein Gemisch
aus der Lösung des löslichen Enzyms und des Vernetzungsmittel in den Turm eingesprüht wird, woraufhin die so"
gebildete Masse aus dem Turm entfernt wird. Hierdurch kann das immobilisierte Enzym mit einem sehr hohen Enzymgehalt
auf dem Träger erhalten werden.
im Zusammenhang mit den in den beiden vorhergehenden Absätzen angegebenen bevorzugten Arbeitsweisen ist zu berücksichtigen,
daß der Träger das Vernetzungsmittel, Enzym und weitere Zusätze,soweit vorhanden in beliebiger
Reihenfolge zusammengebracht werden können. Derartige weitere Zusätze können z. B. Granulierhilfen (wie Cellulosefasern
oder feinstteilige harte und inerte Teilchen) lösliche Substanzen, die als die Porösität erhöhende
Mittel vorgesehen sind (z. B. NaCl); oder andere
Proteine sein.
/n
«36235
Das Enzym ist erfindungsgemäß vorzugsweise Glukoseisomerase
insbesondere solche von Bacillus coagulans. Es hat sich gezeigt, daß bei der so durchgeführten Immobilisierung
von Glukoseisomerase die Aktivität ausgezeichnet zurückgewonnen werden kann und die anderen Eigenschaften
bei kontinuierlichen Arbeiten in einer Säule hervorragend sind.
Die erfindungsgemäße immobilisierte Enzymzubereitung kann
ο als Schicht in eine Säule eingebracht werden und anschließend
kann eine Lösung eines Substrats für das Enzym durch diese Schicht mit einer Geschwindigkeit hindurch
geleitet werden, die es erlaubt, daß zumindest ein Teil des Substrats durch das Enzym umgewandelt wird.
Die Erfindung vird durch die folgenden Beispiele näher
erläutert. Dabei ist in einigen Beispielen nur die Herstellung des Trägers beschrieben. Diese Beispiele sind
so zu verstehen, daß der Träger anschließend mit der gleichen Enzymlösung wie bei Beispiel 12 angegeben, behandelt
und aufgearbeitet wird, wodurch ein immobilisiertes Enzym erhalten wird.
Im folgenden wird auf verschiedene Veröffentlichungen 5 von Novo verwiesen. Kopien aller dieser Veröffentlichungen
können von Novo Industri A/S, Novo Alle, 2880 Bagsvaerd, Dänemark erhalten werden.
In einigen Beispielen ist ein Wert für den Druckabfall (physikalische Festigkeit) während des Arbeitens in der
Säule angegeben. Dieser Wert wurde bestimmt gemäß AF 166/2.einer Beschreibung eines Novo-Laborverfahrens.
Einige theoretische Überlegungen bezüglich d^ser Bestimmung
des Druckabfrlls sind beschrieben in Starch/Stärke 31
35' (1979) Nr.1, S. 13-16.Zum Vergleich mit bekannten Handels-
/12
produkten ist zu erwähnen, daß die besten Werte für den Druckabfall für die immobilisierten Glukoseisomerasezubereitungen
Sweetzyme etwa 9,8.1 mbar (1Og/cm2 ) beträgt.
Aus den Beispielen geht hervor, daß der Druckabfall für die erfindungsgemäßen immobilisierten Fnzymzubereitungen
so gering sein kann wie 1,96 mbar (2g/cm2)und daß alle
Werte wesentlich niedriger liegen als V,81mbar (10 g/cm2)
woraus der technische Fortschritt für das erfindungsgemäße Produkt bzw. Verfahren deutlich hervorgeht.
10g Gelatine Bloom 260 wurden in 60 ml H„O dispergiert,
dann wurden 33 g 6 %iges (Gew./Vol.) Nrtriumalginat zugegeben, das Gemisch auf 600C erhitzt, um die Gelatine
zu lösen und dann 10 g Diatomeenerde (ilyflo Celite) zugesetzt,
das ganze Gemisch 10 min bei 55°C gerührt und durch eine vibrierende Spritze gepumptt um sehr feine
Tröpfchen zu erzeugen, die in eine 2 %jge (Gew./Vol.)
CaCl- · 2H„O Lösung, die auf 5°C gehalten wurde( tropfen
konnten. Die so erhaltenen kugelartigen Teilchen wurden einige Minuten in der CaCl „ Lösung gerührt iann aus der Lösung
erntfernt, mit entionisiertem Wasser gewaschen und 2 Tage bei Raumtemperatur getrocknet. Die Teilchen wurden
dann 1 h in 20 ml 1 %iger (Gew./Vol.) Glutaraldehydlösung
bei pH 8,5 leicht gerührt;daraus encfernt, in entionisiertem
Wasser gewaschen und erneut getrocknet. Auf diese Weise wurden kugelf örmije außerordentlich harte zusammenhaltende
Teilchen mit einem Durchmesser von etwa 2 mm die ausgezeichnete Fließeigenschaften besaßen erhalten. Der Druck-
· abfall betrug 1,96 mbar (2 g/cm2). Die Teilchen konnten
mit Citrat oder Phosphat behandelt werden, um Ca und das Alginat zu entfernen, wenn dies erwünscht war ohne
irgendeine nachteilige Wirkung auf die Teilchen.
/13
Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde wiederholt
mit der ..usnahme, daß die Hälfte der Gelatine, d.h.
5 g und die doppelte Menge Diatomeenerde, d.h. 20 g verwendet wurden vnd die Teilchen vor der Behandlung mit
Glutaraldehya nicht getrocknet wurden. Auf diese Weise wurden im wesentlichen identische Teilchen erhalten mit
einer etwas geringeren Härte aber noch nahezu den gleichen ausgezeichneten Fließeigenschaften. Der Druckabfall
TO betrug 2,94 mbar (3 g/cm2).
Das in Beispie] 2 beschriebene Verfahren wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß Gelatine Bloom 200 verwendet wur-T5
de und deren Menge auf 4 g verringert wurde. Die-Konzentration an Glutaraldehyd wurde ebenfalls verringert und
zwar auf 0,2 % (Gew./Vol·.). Es wurden Teilchen mit im wesentlichen
identischen Eigenschaften (wie in Beispiel 2) erhalten."
In diesem Beispiel wurde eine Pilotanlage angewandt. So wurden 0,7 kg Cellulosefasern Typ Arbocel BC 200, 2,8 kg
Diatomeenerde {Clarcel Celite) und 4 kg einer 2 0 %igen (Gew./Gew.) Gelatine Bloom 200 Lösung jeweils von 600C
in einem Mischer mit geringen Scherkräften vom Typ Lödige FM 130 D vermascht und die so erhaltene dicke Masse durch
einen Extruder mit einem 1,5 mm Gitter extrudiert und dann in einem Marumerizer,wie in der US-PS 3 277 520 beschrieben.zu
Kugeln geformt. Der Extruder war das Doppelschneckenmodell EXDC-100 und die Vorrichtung zur Herstelung
der Kugeln Q-400. Die so erhaltenen Teilchen wurden in einem Wirbelbett -Turm (Glatt Typ WSG 15) getrocknet
/14
-X-
und gesiebt und die Fraktion mit einer Teilchengröße von 1,2 bis 2,0 mm gesammelt und der Rest wieder zurückgeführt.
Eine Probe von 10g wurde dann 3 h bei Raumtemperatur
mit 100 ml 1 %iger (Gew./Vol.) Glutaraldehydlösung
die auf pH 7,0 eingestellt war, behandelt aus der Lösung entfernt und gründlich mit entionisiertem Wasser
gewaschen. Die so erhaltenen Teilchen waren selbst ohne Trocknen außerordentlich hart und fest zusammenhaltend
und besaßen ausgezeichnete Fließeigenschaften. Der Druckabfall betrug 1,96 mbar (2 g/cm2). Nach diesem Beispiel
machte die diskontinuierliche Phase 65 Gew.-I der Teilchen
aus.
In diesem Beispiel wurde der gleiche Marumerizer angewandt
wie in Beispiel 4 mit der Ausnahme, daß kein Exx truder angewandt wurde. Außerdem wurde der Anteil an diskontinuierlicher
Phase auf 94 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Trägers erhöht. So wurden 1,5 kg teilchenförmiger
Skamol-Ton mit einer Teilchengröße von 0,7 bis 1,0 mm in die Vorrichtung zur Herstellung der Kugeln
eingebracht und 0,4 kg Diatomeenerde (Hyflo Celite) und
1,15 kg einer 10 %igen (Gew./Gew.) Gelatine Bloom 80 Lösung
bei 600C abwechselnd zugegeben un" die Bildung von
Klumpen zu vermeiden. Die so erhaltenen Teilchen wurden wie in Beispiel 4 behandelt, wobei man .iarte Teilchen
mit sehr guten Fließeigenschaften· erhielt. Der Druckabfall
betrug 4,9 mbar (5 g/cm2).
In diesem Beispiel wurde ein Granulator vom Pflugschar Typ (Gegenstrom-Tellermischer) Lödige FM 50, der mit
einem Messer, das mit hoher Geschwindigkeit lief, versehen war, wie in der US-PS 4 106 99" beschrieben be-
/15
ZO
schickt mit 5,0 kg Diatomeenerde (Clarcel Celite) und 5,95 kg einer 16 %igen (Gew./Gew.) Gelatine Lösung Bloom
200 wurden in den Granulator gesprüht. Die Behandlungsdauer, die Rotationsgeschwindigkeit des Mischers und des
Messer warde so gewählt, daß eine Teilchengröße von 0,7 bis 1,5 mm entstand. Diese Teilchen wurden wie in
Beispiel 4 behandelt, wobei Trägerteilchen mit im wesentlichen den gleichen Eigenschaften wie in Beispiel 4
erhalten wurden. Der Druckabfall betrug 3,92 mbar (4g/cm2)
1 kg Cellulosefasern, 4 kg Diatomeenerde (Clarcel Celite)
und 10 kg zurückgeführtes Material, das entsprechend
diesem Beispiel entstanden war, wurden mit 10,5 kg einer
■) 5 10 %igen (Gew./Gew.) Gelatine Bloom 2 00 Lösung in einem Pflugschar
Lödige-M: scher Typ FM 130 D besprüht, wobei runde
Teilchen unterschiedlicher Größe gebildet wurden. Während aller oben beschriebenen Verfahrensstufen wurden die Bestandteile
und die Vorrichtungen auf 55°C gehalten. Die runden Teilchen wurden in einem Wirbelbett-Turm getrocknet
und gesieot und die Fraktion von 0,5 bis 0,7 mm Teilchengröße die 32 % ausmachte wurde gesammelt. Der Rest
der gröbere Teilchen enthielt, die vermählen wurden und feinere die direkt verwendet wurden, wurde zurückgeführt
wie zu Beginn dieses Beispiels beschrieben.
Der gleiche Mischer wie in Beispiel 4, d. h. ein Lödige FM 130-Mischer wurde beschickt mit 3 kg Cellulosefasern,
10,5 kg Diatomeenerde (Clarcel Celite) und 1,5 g Albumin von Raumtemperatur und mit 15,2 kg Wasser besprüht. Die
Behandlungszeit und die Rotationsgeschwindigkeiten des
Mischers und des Messers wurden so gewählt, daß Teil-
JH
cheri der bevorzugten Größe gebildet wurden. Die Teilchen
wurden in einem Wirbelbett getrocknet und eine Siebanalyse der getrockneten Teilchen zeigte die folgende Teilchengrößeverteilung
>1000 μΐη 19,7 %
>1000 μΐη 19,7 %
> 850 μτη 3 5,6 %
> 707 μΐη 58,8 %
> 600 μπι 78,2 %
> 500 μπι 92,1 % <
420 μπι 1,1%
Das Verfahren des Beispiels 8 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß 1,5 kg isoelektrisch lösliches Sojaproteinhydrolysat
anstelle des Albumins verwendet wurde und daß die Menge an Wasser 14,8 kg betrug. Die Siebanalyse
der getrockneten Teilchen zeigte die folgende Teilchengrößeverteilung
> 1000 μΐη 24,2 % > 850 μΐη 43,2 %
> 707 μπι 66,1 %
> 600 μΐη 84,4 %
> 500 μπι 95,2 % < 420 μια 1,0 %
Der gleiche Mischer wie in Beispiel 6, d. h. ein Lödige FM 50-Mischer wurde beschickt mit 11,3 kg Al-O., und 3,0 kg
Cellulosefasern und 650 g Gelatine Bloom 200 in 4,55 kg Wasser wurden eingesprüht. Die Temperatur wurde auf 55°C
gehalten. Die durch Rotation des Mischers und des Messers entstandenen Teilchen wurden in einem Wirbelbett
getrocknet. Die Siebanalyse zeigte die folgende Toilchengrößevertei1ung
/17
O O
VL
ν -
> 1000 μΐϋ 8,5 %
> 8 5 0 μπι 1 6 , 1 %
> 707 μπι 31 ,2 %
> 600 μπι 46,2 % > 500 μπι 65,3 %
<420μΐη15,6%
Beispiel 11
In den Lödige FM 130 D-Mischer wurden 2,1 kg Cellulosefasern,
8,4 kg Diatomeenerde (Clarcel Celite) und 4,5 kg Natriumchlorid gegeben und das Gemisch mit 10,0 kg
10 %iger (Gew./Gew.) Gelatine Bloom 80 Lösung-besprüht.
Die Temperatur betrug 550C. Die entstandenen Teilchen
wurden getrocknet. Die Siebanalyse zeigte die folgende Teilchengrößeverteilung:
> 1000 μη 14,2 %
> 850 p'n 23,7 %
> 707 μΐη 40,1 %
> 600 μια 59,1 I
y 500 μπι 79,1 %
< 420 μπ\ 5,8 %
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer immobilisierten Enzymzubereitung nach der Erfindung.
So wurden 4,5 kg Trägerteilchen(die wie in Beispiel
1 hergestellt worden, mit Glutaraldehyd behandelt, gewaschen und getrocknet waren in einer Wirbelbettvorrichtung
im Pilotmaßstab (Glatt Typ WSG 15) flu- ■ idisiert und ?,3 kg einer 19 %igen (Gew./Gew.) Lösung
von teilweise gereinigter Glukoseisomerase von Bacillus coagulans NRRL 5650 (Aktivität 3240 Einheiten/g Fest-
/18
JO
stoffe / wobei die Aktivitätseinheit definiert ist in
NOVO analyseforskrift AF 189/1) wurden bei 50 bis 55°C
auf die Teilchen gesprüht und die Teilchen konnten trocknen. Das so erhaltene Produkt enthielt 28 Gew.-% teilweise
gereinigte Glukoseisomerase mit einer 85 %igen Aktivitätsausbeute. . 20 g dieser Teilchen wurden dann in 500 ml
einer Lösung enthaltend 0,06 m NaH9PO4 . 2H-0, 1,4 m
Na2SO4 und 0,1 % (Gew./Vol.) Glutaraldehyd die mit 1 η
NaOH auf pH 7,0 eingestellt worden war behandelt. Nach lh bei Raumtemperatur wurden die Teilchen entfernt und
gründlich mit 0,06 m Natriumphosphat-Lösung pH 7,0 gewaschen
und dann zusätzlich mit entionisiertem Wasser und ein Teil von ihnen konnte trocknen. Sowohl die nassen als
auch die trockenen Teilchen zeigten die gleichen ausgezeichneten Fließeigenschaften wie der :rsprüngliche Träger
und.es konnte kein Verlust von Enzymaktivität beobachtet werden. Bei den nassen Teilchen betrug die Rück-'
gewinnung der Enzymaktivität jedoch 7 0 % während sie bei den trockenen Teilchen nur 48 % betrug.
20 g getrocknete Trägerteilchen .die wie in Beispiel 4
hergestellt worden waren wurden in ein :m Labtyp Wirbelbett
fluidisiert. 45,8 g einer 11,0 %igen (Gew./Gew.) homogenisierten Zellaufschlämmung (fermentiert bzw. gezüchtet
wie in Beispiell der DK-Anmeldung 5190/79 angegeben und die Aufschlämmung hergestellt wie in Beispiel
4 der DK-Anmeldung beschrieben) enthaltend 80,1 ε /g
thermophile Lactase von Bacillus sp. NRRL B-Il 229 wurden
bei 30 bis 400C auf die Trägerteilchen gesprüht und die
überzogenen Teilchen konnten trocknen. Die Einheit der Lactaseaktivität ist definiert als die Menge Lactase,
die 1 μΐηοΐ Lactose/min unter den folgenden Reaktionsbedingungen spaltet: Substratkonzentration ~- 10 % Lactose,
/19
ZH
Temperatur = 6OCC, pH =6,5 und Reaktionszeit = 30 min.
Die Ausbeute an Enzymaktivität betrug 79,8 %. 10 g überzogene
Kügelc'ien wurden dann in 250 ml einer Lösung von 0,06 m Na2HPO4, 1,4 m Na3SO4 und 0,1 % (Gew./Vol.)
Glutaraldehyd bei pH 7,5 behandelt. Nach 1 h bei Raumtemperatur
wurden die Teilchen entfernt und gründlich mit 0,0 6 m K-HPO. bei pH 7,5 gewaschen. Die Ausbeute ■>
an Enzymaktivxtät in dieser Vernetzungsstufe betrug 17,2 %. .---'"
24 g trockene Trägerteilchen die entsprechend Beispiel 4 hergestellt worden waren, wurden nut 20,2 g einer Lösung
von 3 9,6 % (Gew./Gew.) teilweise gereinigter Amylo-
T 5 glukosidase von A.niger getränkt,die erhalten worden war durch
Ultrafiltration des Handelsproduktes AMG 200 L (beschrieben in NOVO-Schrift AMG, B 020 g - GB 2500 Juli
1982).um niedermolekulare Bestandteile zu entfernen bis
zu einem Fests-offgehalt von 39,6 % (Gew./Gew.),(Aktivitat
2610 IAG/g, wobei die Aktivitätseinheit definiert
ist in NOVO Analyseforskrift AF 159/2). Dann wurde 1 h
Vakuum angelegt. Das so erhaltene Produkt enthielt
25 Gew.-% Enzym-Trockensubstanz mit einer Ausbeute an Enzymaktivität von 77,9 %.
20 g Teilchen mit 71,8 % Trockensubstanz wurden dann
in 1600 ml einc-.r Lösung aus 1 % (Gew./Vol.) NaH3PO4,
20 % (Gew./Vol.) Na3SO4 und 0,2 % Glutaraldehyd bei
pH 4,5 behandelt. Nach 1 h wurden die Teilchen abfiltriert
und mit 1 %iger NaH3PO4 Lösung bei pH 4,5 gewaschen.
Die Ausbeute an Enzymaktivität bei dieser Vernetzungsstufe betrug 55,1 %.
/20
ZS
ao -
Beispiel 1 5
40 g Trägerteilchen, die wie in Beispiel 4 angegeben hergestellt worden waren und einen Feststoffgehalt von
98,8 % besaßen und 24 g eines im Vakuum behandelten teilweise gereinigten Konzentrats von Glukoseisomerase
von Bacillus coagulans (NRRL 5650) de: ι 5 % Glukose und
8 % Natriumsulfat zugesetzt worden waren.(Feststoffgehalt 41,8 %) wurden vermischt und die Flüssigkeit konnte
die Luft aus den Poren der Teilchen durch Vakuumbehandlung verdrängen. Das Gewicht nach dem Mischen betrug
63,22 g und der Feststoffgehalt 79,2 %.
18g Anteile dieses Mittels (ungefähr 14 g Feststoffe)
wurden 1 h bei Raumtemperatur mit 375 ml einer Lösung. enthaltend in allen Fällen 22 % Natriumsulfat, 5 % Glukose
und 1 % Natriumphosphat eingestellt auf pH 7,5,und
zusätzlich entweder 0,1 oder 0,2 oder 0,3 % Glutaraldehyd
behandelt.
Nach dieser Behandlung wurden die Mittel 5 mal mit etwa 150 ml 1 %iger Natriumphosphatlösung pH 7,5,gewaschen.
Die Enzymaktivität wurde bestimmt nach AF 189/1 nach
Abziehen der Flüssigkeit von den Teilchen. Auch der Feststoffgehalt wurde nach dem Abziehen der Flüssigkeit
von den Teilchen bestimmt.
/21
Fest- E/g E/g Ausbau- Ausstoffe feucht trok- te (%) beute (%) ken immob.
Enzymkonzentrat | GA*) It 11 11 Il |
41 ,8 | 1 | 415 | 3385 | - | - | |
5 | Enzymkonzentrat + Träger |
79,2 | 463 | 585 | 86 | — | ||
immobilisiert mit C,1 % " 0,2% C, 3 % |
32,5 38,9 |
158 141 117 |
486 362 333 |
72 53 49 . |
83 62 57 |
|||
. ■
Anteile entsprechend 5 g Trockensubstanz wurden auf den Druckabfall untersucht.
GIutaraldenydkcη-
zentration bei 25 h 50 h Immob ilisation
0,1 % 3 5
0,2%- 1 3
0,3 % 2 3
In den gleichen Mischer wie in Beispiel 4, d. h. einen Lödige FM 130 D-Mischer wurden 3 kg Cellulosefasern und
13,5 kg Diatomeenerde (Clarcel Celite) gegeben und 15 kg
10 %iges (Gew./Vol.) Polyethylenimin (PEI 15 T Taihei
Sangyo Kaisha Ltd.) bei Raumtemperatur aufgesprüht. Anschließend wurden 3 kg Wasser und schließlich 2 kg
50 %ige (Gew./Vol.) Glutaraldehydlosung aufgesprüht. Die
Behandlungszeit und Drehgeschwindigkeiten des Mischers und des Messers wurden so gewählt, daß Teilchen der bevorzugten
Größe gebildet wurden. Die Teilchen wurden in einem Wirbelbett getrocknet.
*)Glutaraldehyd
/22
- 2ί -
Beispiel 17
In den gleichen Mischer wie in Beispiel 4, d. h. einen Lödige FM 130 D-Mischer wurden 3 kg Cellulosefasern
und 12,0 kg Aktivkohle (Pecactif FGV von Peca
S.A., Levallois, Cedex, Frankreich) gegeben und 20,0 kg 10 %ige (Gew./Gew.) Gelatinelösung Bloom 200 und schließlich
4,5 kg Wasser aufgesprüht. Die Benandlungszeit und Rotationsgeschwindigkeiten des Mischers und des Messers
wurden so gewählt, daß Teilchen der bevorzugten Größe gebildet wurden. Die Teilchen wurden ir einem Wirbelbett
getrocknet.
Die Anwendbarkeit eines immobilisierten Enzymproduktes nach der Erfindung geht aus dem folgenden Anwendungsbeispiel
hervor. Ein immobilisiertes Glukoseisomeraseprodukt wurde allgemein wie in Beispeil 12 angegeben
hergestellt. Das Produkt enthielt 32,6 Gew.-% teilweise gereinigte Glukoseisomerase und die Vernetzung wurde
wie in Beispiel 12 durchgeführt.
Nach dem Waschen mit 1 %iger (Gew./Vol.) Natriumphosphatlösung
(pH 7,0) wurden 27,6 g feuchte Teilchen_ entsprechend 10g Feststoffen in eine Säule mit Wassermantel
mit einem Durchmesser von 1,5 cm gegeben. Die Säule wurde
auf 65°C gehalten und ein 45 %iger (Gew./Gew.) Glukosesirup pH 7,8 (eingestellt mit Na„CO,) vurde kontinuierlich
durch das Enzymbett mit einer Geschwindigkeit hindurchgeleitet, die eine 4 0 bis 42 %ige Umwandlung
von Glukose in Fruktose erlaubte. Die Anfangsaktivität
betrug 538 IGIC/g Feststoffe (die Aktivität wurde berechnet
entsprechend NOVO Analyseforskrift AF 147/6)
und die Halbwertzeit der Aktivität betrug 450 h. Der pH-Wert der austretenden Flüssigkeit betrug 7,4 bis
7,5.
/23
Zum Vergleich ist zu erwähnen, daß die verbreitet angewandte
hande]sübliche immobilisierte Glukoseisomerase Sweetzyme eine Aktivität von 225 bis 300 IGIC/g und
eine ähnliche .lalbwertzeit der Aktivität besitzt und um
mit Sweetzyme einen pH-Wert der austretenden Flüssigkeit von 7,4 bis 7,5 unter den oben angegebenen Bedingungen,
d. h. bei 65°C und einem 45 %igen (Gew./Gew.) Glukosesirup zu erreichen ist ein pH-Wert der eingespeisten
Lösung von 8,2 erforderlich.
Claims (17)
- Patentanspruch 21 . j Granulatförmiges iimiobilisiertes Enzym, das geeignet ist zur kontinuierlichen Durchführung von enzymatisehen
Reaktionen im Festbett oder Fließ- bzw. Wirbelbett,
umfassenda) eine kontinuierliche Phase aus einem nydrophilen
Bindemittel undb) eine diskontinuierliche Phase aus einem feinteiligen inerten Füllstoff, wobei das Bindemittel und der Füllstoff in dem Reaktionsmedium der enzymatischen
Reaktion unlöslich sind undc) ein an dem Bindemittel auf der Oberfläche des Granulats immobilisiertes Enzym. - 2. Enzymgranulat nach Anspruch 1, daduret g e k e η η zeichnet, daß das Bindemittel ein Protein ist, das durch Umsetzung mit Glutaraldehyd unlöslich gemacht worden ist und bei dem das Enzym durch Reaktion mit dem Glutaraldehyd an das Bindemittel gebunden ist.0
- 3. Enzymgranulat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch g e kennzeichnet , daß die kontinuierliche Phase ein Protein,insbesondere Gelatine, Sojaprotein, Casein, Albumin, Zein, Gluten oder ein Proteinhydrolysat oder/2«36235ein Polysaccharid insbesondere Agar, Alginat oder ein anderer Gummi, Mehl, Stärke oder Chitosan oder ein synthetisches Material wie Carboxymethyl-cellulose, Methylcellulo-se, Ethylcellulose, Hydroxyethyl-cellulose, Hydroxypropyl-cellulose, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon oder Natriumsilicat ist.
- 4. Enzymgranulat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß die diskontinuierliche Phase Diatomeenerde, zermahlener Sand, Ziegelstaub, Ton, ein Nylonpulver, ein unlösliches Metalloxid oder Metallsalz, gemahlene Kieselsäure, Aerosil, gemahlene Tonerde, Korund, gemahlenes Glas, gemahlener Flint, gemahlenes Quarz, gemahlener Granit, Aluminiumphosphat, Kaolin, Bentonit, Perlit, Zeolit, Calciumsilicat, mikrozelluläre Filterhilfe, zerstoßenes Magnesiumsilicat, Talkum, Asbest, abgeriebene Hornbl-ende, Titandioxid, Zinkoxid, Polierpulver, gemahlenes Zirkoniumsilica'L, Ruß, Aktivkohle, Knochenmehl, Flugasche oder Metallstaub ist.
- 5. Enzymgrjnuüat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß die Menge der diskontinuierlichen Phase zwischen etwa 10 und etwa 98 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht des Trägers, vorzugsweise 50 b\s 95 Gew.-I beträgt.
- 6. Enzymgranulat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet , daß die Teilchengröße e^nes einzelnen inerten Teilchens in der diskontinuierlichen Phase,berechnet als Durchmesser einer Kugel ir.it dem gleichen Volumen, weniger als 1/5 des Durchmessers der Trägerteilchen(vorzugsweise weniger als 1/20 d~.s Durchmessers der Trägerteilchen beträgt./3
- 7. Enzymgranulat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , da3 die Form der Trägerteilchen kugelförmig oder abgerundet ist und der mittlere Durchmesser 0,1 bis 5 mm, vorzugsweise 0,2 bis 2 mm insbesondere 0,2 bis 1 mm beträgt.
- 8. Enzymgranulat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet , daß das Enzym eine Glukoseisomerase, vorzugsweise eine solche von Bacillus coagulans ist.
- 9. Verfahren zur Herstellung eines Enzymgranulats nach einem der Ansprüche 1 bis 8,dadurch g e k e η η ζ ei c h η ο t,daß man einen Träger herstellt,indem man a) eine kontinuierliche Phase aus einem wasserlöslichen Bindemittel, daszumindest teilweise in dem wäßrigen Medium gelöst oder dispergiert ist zusammenbringt mit b) einer diskontinuierlichen Phase aus einer Vielzahl einzelner harter inerter Teilchen,deren Größe klein genug ist, daß sie bei der Formung des Trägers nicht stört und soweit erforderlich, das Bindemittel in dem Medium, in dem das Enzym angewandt werden soll unlöslich macht und den Träger mit einem Enzym zusammenbringt, das auf der Oberfläche des Trägers festgehalten wird.
- 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , daß man die Komponenter a) und b) miteinander vermischt und das Gemisch anschließend zu dem teilchenförmigen Träger vorzugsweise z\ Kügelchen _ formt.
- 11 . Verfahren nach einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet , daß man zu der kontinuierlichen Phase vor, während oder nach dem Vermischen mit der/4diskontinuierlichen Phase.ein gelbildendes Mittel zusetzt und anschließend die so erhaltene Masse in ein Geliermedium extrudiert oder eintropft und gegebenenfalls in einer beliebigen Stufe ein Vernetzungsmittel zusetzt.
- 12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das gelbildende Mittel Gelatine, ein Alginat, Carragen oder Chitosan ist.
- 13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das gelbildende Mittel eine Lösung ist, enthaltend Ca , Ba , K , Polyphosphat oder Ferricyanid, oder kaltes Wasser oder ein Strom kalterLuft.
- 14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet ,daß die kontinuierliche Phase in dem für die Enzymreaktion angewandten Mittel 0 unlöslich gemacht wird mit Hilfe eines geeigneten Vernetzungsmittels vorzugsweise Glutaraldehyd.
- 15. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gel ennzeichnet, daß der Träger mit einer Lösung des Enzyms und mit einem Vernetzungsmittel behandelt wird.
- 16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger als Wirbelbett in einen Turm eingebracht wird und die Lösung des löslichen Enzyms in den Turm eingesprüht wird und die so entstandene Masse aus dem Turm ausgetragen und mit dem Vernetzungsmittel behandelt wird./5
- 17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet , daß der Träger als fluidisierte Masse in den Turm eingebracht und ein Gemisch einer Lösung des löslichen Enzyms nit dem Vernetzungsmittel in den Turm eingesprüht und die so entstandene Masse aus dem Turm ausgetragen wird.
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