JPS5985291A - 固定化酵素製剤の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、表面に酵素が結合している担体から成る粒状
固定化酵素製剤の製造方法に関する。ここで、担体の表
面とは、多孔性担体の場合には外表面及び内表面を意味
する。

固定化酵素及び酵素固定用担体に関する分野は急速に進
歩している。通常、担体は、多分重みを伺けられた小さ
い粒子の形を有し、この粒子の中に酵素が埋め込まれて
いるか、又はその表面に酵素が結合又は固定されている
。米国特許第４２６６０２９号及び同第４１１６７７１
号明細書及びデンマーク特許第１３３３８０号明細書を
参照すると、これらには公知の担体（その上又は中に酵
素が固定される）が３例しか記載されていない。

本発明方法に関連して利用される担体は、表面上に酵素
が結合される担体の範噴に属し、酵素が担体の全容量に
渡って分布する担体の箱鳴とは区別される。

この範噴の担体に属する、表面に酵素が結合される典型
的な公知担体は粒状ゼラチンから成り、ダーウェント０
８０６１　Ｃ１５（Ｊ　５４１５６−８９２）に記載さ
れている。しかしながら、純ゼラチンの粒子は、極めて
高い流速が要求される大規模固定床操作に使用するのに
充分には幌くない。また、純ゼラチンの粒子は比較的高
価である。

この箱鳴にも属し、不活性コアがゼラチンで被覆されて
いる同様な相体は、米国特許第４２６６０２９号明細書
により製造することができる。この担体は良好な流動特
性を有するが、担体粒子の形及び寸法を塔における最良
の性能を得る基準により選択スることができず、特定の
砂フラクション又は原料として使用する粒状緻密物質の
他のフラクションで決するという欠点がある。更に、こ
の担体を実験室規模で製造することは容易であるが、こ
の担体を工業的規模で製造すること（は困難であるか、
又は恐らく不可能である。

この箱鳴に属する公知担体の別の代表的なものは、アト
パンシス・イン・イクスペリメンタル・メディシン・ア
ンド・バイオロジイ（Ａｄｖａｎｃｅｓｉｎ　Ｅｘｐｅ
ｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ　）、４２、＄１９１〜２１２頁、インモービ
ライズド・バイオケミカルス・アンド・アフィニヴーイ
・クロマトグラフ４　（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｂｉ
ｏｃｈｅｍｉｃａｌｓａｎｄ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｃｈ
ｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　）記載でれている。この担
体はシランカップリング剤を含むガラスピーズから成る
。これらのビーズは優れた流動特性及び比較的高い負荷
能を有する。しかし、これらは極めて高価であｐｌすべ
ての無機担体と同様に酵素を固定化するのに適当にする
ために、不所望な物質の使用を含めて、煩雑な化学処理
を行わねばならない。

従って、本発明の目的は、表面に酵素を結合しており、
前記のすべての好ましい性質、即ち、充分な硬度、工業
的規模で簡単な化学的処理での生産性及び低い生産価額
を示す担体を含む固定化酵素の製造方法を提供すること
にある。

本発明により、２相、即ち、ａ）水性媒体に少なくとも
一部溶解又は分散場れた水溶性結合剤の連続相及びｂ）
担体の成形を妨害しない程度に充分小さい粒径を有する
多数のばらばらの硬質不活性粒子の不連続相を配合し、
結合剤を必要に応じて、酵素が最終的に利用される媒体
に小心性にすることによって担体を形成し、担体を４１
１体表面に結合する酵素と接触させることにより、酵素
を表面に　□結合した担体を含む粒状固定化酵素製剤を
製造する方法が判明した。固定化酵素が究極的に使用さ
れる媒体が水性媒体である場合には、（元は）水溶性の
結合剤を化学的又は物理的処理、例えば架橋又は加熱に
よって不溶化することが必要であろう。固定化酵素が究
極的に使用される媒体が非水性媒体である場合には、（
元は）水溶性の結合剤はこの非水性媒体に不溶性であっ
てよく、この場合には、結合剤を不溶化する必要はない
。完全のため、担体が前記の必須成分ａ）及びｂ）の他
に他の成分、例えば充填剤及び／又は造粒助剤を含んで
いてよいことに注意すべきである。

意外にも、本発明方法は前記の発明の目的を満足するこ
とが判った。更に、不ｌ占性粒子の割合が担体の１量に
対して約９８重鰯−％までと極めて高くても、担体はそ
の優れた物理的一体性を保持することが意外にも判明し
７た。このことは、不活性粒子の割合が高い程（前記の
上限まで）、担体が硬くなり、コストが安くなるので、
極めて重要である。

本発明は又、下記の成分を含む、固定床又は流動床連続
酵素反応に適合する固定化酵素粒子を提供する： ａ）酵素反応媒体に不溶性の連続相親水性結合剤物質、
及び ｂ）酵素反応媒体に不溶性の不連続相粒状不活性充填剤
物質、及び Ｃ）前記粒子の赤面で結合剤物質に固定された酵素。

更に本発明は下記の成分を含む、水性媒体に使用するた
め適合した固定化酵素粒子を提供する：ａ）親水性結合
剤物質の連続相及び粒状不活性充填剤物質の不連続相（
前記結合剤及び充填剤は水に不溶性である）、及び ｂ）前記粒子の赤面で結合剤物質に架橋結合された酵素
。

この固定化粒子は、グルタルアルデヒドとの反応によっ
て水に不溶性にされた蛋白質結合剤及びグルタルアルデ
ヒドとの反応により結合剤物質に架橋結合された酵素を
含む。また、 該固定化粒子は更にゼラチン結合剤及び珪藻土及びセル
ロース繊維充填剤物質、及び酵素としてグルコースイソ
メラーゼヲ含ム。

固定化酵素がＩＪ　／４’−ゼであり、石油エーテル溶
液中で脂質をエステル交換するためリノ！−ゼを使用す
る場合には、アルブミン、カゼイン、大豆蛋白、ヒドロ
キリ′エチルセルロース、寒天、アルギン酸塩、ポリビ
ニルアルコール、澱粉、メチルセルロース又はカル？キ
シメチルセルロースヲ結合剤として使用することができ
る。それというのは、これらの物質は石油エーテルに不
溶性であるからである。この場合には、担体と酵素との
間に緩い結合しか必要でない。他方、担体を使用する酵
素がアミログルコシダーゼであり、アミログルコシダー
ゼを水溶液中でデキス）　ＩＪンを分解するため使用す
る場合には、（元は）水溶性の結合剤を不溶化する必要
がある。通常、アミログルコシダーゼをグルタルアルデ
ヒドで架橋することによって担体の表面に結合又は固定
する。

任意の酵素及び２つの担体相ａ）及びｂ）の任意のもの
のどの組み合わせも有効であるわけではないことを理解
すべきである。この分野の幽業者は、若干の酵素がｂ）
相から少量で放出される陽イオンを計容せず、また、固
定化酵素が食品工業に使用される場合には、相ａ）の成
分のあるものは、酵素反応器からの流出液中に有害成分
を漏出するため、あまり望ましくないことを認識してい
る。

疎水性ポリマー中に配合された繊維状イオン交換性セル
ロースから成り、場合により粉砕金属酸化物のような強
化剤を含む担体にイオン交換によって結合爆れた固定化
グルコースイソメラーゼは米国特許第４１１０１６４号
又はベルギー特許第８６５９００号明細書に対応するデ
ンマーク特許出願第１５９２／７８号明細書（５ｔａｎ
ｄａｒｄＢｒａｎｄｓ　）に記載されている。この担体
は、疎水性ポリマーを融解し、融解したポリマー中にセ
ルロース及び強化剤を混合することによって製造される
。しかし、この方法は多数の欠点を伴う。第一に、この
ような疎水性ポリマーの価格はむしろ筒く、第二に、融
解した疎水性ポリマーを用いるよシ本発明による結合剤
の水溶液又は水性懸濁液を用いて操作する方がはるかに
容易である。また、デンマーク特許出願第１５９２／７
８号明細書に記載されている方法はイオン交換樹脂上に
固定される酵素、即ち酵素の単分子層に厳密に限定され
るが、本発明は担体に酵素を結合するすべての方法及び
酵素の単分子層並びに酵素の多分子層に適合する。従っ
て、グルコースイソメラーゼの場合に、例えは酵素の層
厚を自由に選択できるため、本発明によシ極めて高いｔ
Ｆ！ｉ異活性全活性ことができるが、デンマーク特許出
願第１５９２７７８号明細書に記載されている固定化グ
ルコースイソメラーゼの最高特異活性は比較的低く、」
工業的に適用するには明らかに低すぎる。

本発明の好ましい方法では、２相の配合は連続相及び不
連続相の混合であり、その後、混合物を粒状、好ましい
球形の担体に成形する。これによ９安価な担体粒子を容
易に得ることができる。

ゼラチン球又は丸み付けしたゼラチン粒子を製造する従
来方法はむしろ高価であシ、長時間を要する。デンマー
ク特許第１３３３８０号明細省には、このようなゼラチ
ン粒子をゼラチン（及び酵素）の水溶液をｎ−ブタノー
ルに添加し、形成した滴状粒子を分離することによって
製造することが記載されている。しかし、本発明によれ
ば、結合剤及び不活性物質の混合物の球形又は丸い粒子
は、はるかに安い方法で、例えはマルメライザ−（Ｍａ
ｒｕｍｅｒｉｚｅｒ　）　（例えば米国特許第３２７７
５２０号明細１参照）又は特殊な造粒装置（例えば米国
特許第４１０６９９１号明細書参照）を用いて製造しう
ろことが判明した。更に、多数の硬い小粒子を含むため
、担体粒子の硬度は極めて高くなり、従って流動性が著
しく改良され、極めて商い流速での大規模カラム操作に
好適になる。

本発明の好ましい方法においては、成形は米国特許第３
２７７５２０号明細書によるマルメライザーで実施爆れ
る球形化処理である。この方法で、カラム操作に適描で
、物理的性質の優れた球ｆ：製造することができる。

本発明の好ましい方法においては、成形は米国特許第４
１０６９９１号明細１．に記載されている造粒装置で実
施される球形化処理である。この方法で、極めて廉価で
、物理的性質の優れた球を製造することができる。

本発明の好ましい方法においては、不連続相と混合する
前、間又は後に連続相にケ゛ル止剤を添加し、その後、
こうして得た物質を押出成形するか又はグル化媒体中に
滴加し、その際架橋剤をこれらの任意の工程で添加する
ことができる。これにより、極めて規則的形の粒子が得
られる。

本発明の好ましい方法において、ケ゛ル止剤はゼラチン
、アルギン酸塩、カラジーナン又はキトサンである。こ
れにより極めて規則的形及び優れた凝集性を有する粒子
が得られる。

本発明の好ましい方法においては、ケ９ル化媒体はＣａ
＋＋、Ｂ　ａ＋＋、Ｋ＋、ポリホスフェート又はフェリ
シアン化物を含む浴液、又は冷水、又は冷風流である。

これによシ極めて規則的形及び優れた凝集性を有する粒
子が得られる。

本発明の好ましい方法において、連続相は蛋白質、特に
ゼラチン、大豆蛋白質、カゼイン、アルブミン、ゼイン
、グルテン、又は蛋白質加水分解物、又は多糖類、特に
寒天、アルギン酸塩又は他のゴム質、小麦粉、澱粉、又
はキトサン又は合成物質、例えばカルボキシメチルセル
ロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロ
キシエチルセルロース、ヒドロキシゾロぎルセルロース
、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン又は珪
酸ナトリウムである。連続相は本発明に使用しうる結合
剤の混合物、例えば前記物質の混合物であってもよい。

これらの結合剤を用いると、不連続相に対して極めて少
量でも物理的性質の優れた担体を製造することができる
。

本発明の好ましい方法において、不連続相は珪藻土、破
砕砂、れんが屑、粘土、ナイロン、不溶性金属酸化物若
しくは不溶性金属塩の粉末、粉砕シリカ、エーロシカ、
粉砕アルミナ、コランダム、粉砕ガラス、粉砕フリント
、粉砕石英、粉砕みかげ石、燐酸アルミニウム、カオリ
ン、ベントナイト、バーライト、ゼオライト、珪酸カル
シウム、微孔性濾過助剤、破砕珪酸マグネシウム、タル
ク、石綿、研磨角閃石、二酸化チタン、酸化第二錫、磨
き粉、粉砕珪酸ジルコニウム、カーがンブラック、活性
炭、骨粉、フライアッシュ又は金属微粉である。不連続
相は本発明に使用しうる個々の硬い不活性粒子の混合物
、例えば前記物質の混合物であってもよい。これらの物
質は安く、機械的性質の良好な担体を生じる。

本発明の好ましい方法において、不連続相の量は担体の
総重量に対して約１０〜約９８重量％、好ましくは担体
のａ重量に対して５０〜９５ＮＩＩＴチである。この方
法で低コストと優れた物理的性質を好適に合わせ持つ担
体が得られる。

本発明の好ましい方法において、不連続相における単一
の不活性粒子の線寸法は、その単一不活性粒子と同じ体
積を有する球の直径として計算して、担体粒子の直径の
１１５よシ小さく、好ましくは担体粒子の直径の１／２
０より小さい。このような寸法の不活性粒子を用いて、
成形を困難な〈実施することができる。

本発明の好ましい方法では、連続相を適当な架４１１Ｌ
　好ｆしくはグルタルアルデヒドことによって不溶化す
る。この方法で、相体粒子の機械的団結性が更に改良さ
れる。

本発明の好ましい方法において、担体の形は球形又は丸
く、担体の平均ｉ旦径が０．１〜５ｍｍｓ好ましくは０
．　２　〜２　ｒａｎ，更に好ｉｔ，’＜は０．　２　
〜］．　ｗｎである。これにより、流動性と表面積とを
良好に調和した担体が得られる。

本発明による好ましい方法においては、担体を酵素の溶
液及び架橋剤で処理する。これによシ担体と酵素との間
の申し分ない付着が得られ、従って、極めて良好な物理
的安定性を有する固定イヒ酵累が得られる。

本発明による好ましい方法では、担体を流動イし物質と
して塔に導入し、可溶性酵素の溶液をスプレーとして塔
中に導入し、こうして製造した物質をその後塔から取９
出し、架橋剤で処理する。これＶＬより、担体上への酵
素の負荷量の極めて高い固定化酵素が本発明によシ得ら
れる。

本発明による好ましい方法では、担体を流動化物質とし
て塔に導入し、可溶性酵素の浴液及び架橋剤の混合物を
スプレーとして塔に２１ヨ人し、こうして製造した物質
をその後塔から取シ出す。これによシ担体上への酵素の
負荷量の極めて高い、本発明による固定化酵素を製造す
ることができる。

先の２つの節に示した好ましい実施態様に関して、担体
、架橋剤、酵素及び存在する場合更に別の試薬全任意の
順序で一緒に混合しうろことを考慮すべきである。この
ような別の試薬は、例えば造粒助剤（例えばセルロース
繊維又は微細で、硬い不活性粒子）、孔度増加剤として
の可溶性物質（例えばＮａＣｔ）又は他の蛋白質であっ
てよい。本発明による好ましい方法において、酵素はグ
ルコースイソメラーゼ、好ましくはバシラス・コアギユ
ランス（　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｏａｇｕｌａｎｓ　）
から生じるグルコースイソメラーゼである。こうして製
造された固定化グルコースイソメラーゼは、優れた活性
回復性及び連続カラム操作に関して優れた特性を有する
ことが判明した。

本発明による固定化酵素製剤をカラムに層として導入す
ることができ、その後酵素に対する基質の溶液を少なく
とも一部の基質を酵素によって変換させる速度で前記層
に通す。

下記の実施例は本発明方法を説明するものである。若干
の実施例では、担体の製造だけを記載する。これらのす
べての実施例に関して、担体を例１２に示したのと同じ
酵素溶液で処理し、更に処理して固定化酵素を製造する
ものとする。

以下に、種々のノＮ　（　ＮｏＶｏ　）参照文献を引用
する。これらの文献のコピーはすべてデンマークバズク
パードノボアレ−２８８０のＮｏＶ。

Ｔｎｄｕｓｔｒｉ　Ａ／Ｓ　から入手しうる。

若干の実施例には、カラム操作の間の圧力降下（物理的
強度）の数値を示す。この数値はノ？実験室操作の説明
であるＡＦ１６６／２により測定する。この圧力降下測
定に関係する若干の理論的考慮事項はスターチ／シュテ
ルケ（　Ｓｔａｒｃｈ／Ｓｔａｒｋｅ）３１（１９７９
　）ＡＩ、１３〜１６頁に記□載されている。公知の市
販品と比較するため、固定化グルコースイソメラーゼ製
剤スウィートディム（　ＳＷＥＥ’ｌ’ＺＹＭＥ　）に
関する圧力降下の最良値が約１　０　ｇ　／　ｃｍ２で
あることを挙げることができる。

本発明方法により製造される固定化酵素製剤による圧力
降下が２ｇ／ｃｒｎ２程度と小さく、すべての数値が１
０ｇ／α２よυ著しく低いことが実施例から分シ、これ
によシ本元明の技術的利点は明らかに証明された。

以下余白 例１ １０ｇ（７）ゼ：７Ｆ７プルーム（Ｂｌｏｏｍ　）　２
６０　’に水６０ｍ１中に分散し、６　Ｗ／Ｖ　％アル
ギン酸ナトリウム３３９ｆ添加し、混合物を６０℃に加
熱してゼラチン’４１解し、ハイフロ・セライ）（Ｈｙ
ｆｌ。

Ｃｅ１ｉｔｅ　）　（珪藻土）１０ｇを添加し、混合物
全体を５５℃で１０分間攪拌し、ポ゛ンプで振動注入器
に導通して極めて微細な小滴を生成させ、これを５℃に
保持した２　Ｗ／Ｖ　％　Ｃ＆Ｃ１２２Ｈ２０ｇ液中に
滴下した。こうして製造した球状粒子をＣａ　ＣＬ　２
溶液中で数分間攪拌し、次いで溶液から取り出し、脱イ
オン水で洗浄し、室温で２日間乾燥した。次に、粒子１
ｐＨ８，５のＩＷ／Ｖ％グルタルアルデヒド溶液２００
１ｎｌ中で１時間緩和に攪拌し、取り出し、脱イオン水
で洗浄し、再び乾燥した。この方法で、約２瓢の直径を
有し、優れた流動性を示す球形の、極めて硬い凝集粒子
が得られた。圧力降下は２　ｆｌ　７ｃｍ２であった。

粒子を必要に応じてクエン酸塩又は燐酸塩で処理して、
粒子に悪影響を及＋÷ ぼすことなく、Ｃａ　及びアルギン酸塩を除去すること
ができた。

ｆ！／ｕ２ 半量、即ち５ｇのゼラチン、及び２倍量、即ち２０、ｌ
ｉ＋のハイクロ・セライトを使用し、グルタルアルデヒ
ドで処理する前に粒子を乾燥しない以外は、例１に記載
した操作を繰り返した。こうして硬度が多少低下したが
、はぼ同程度の優れた流動性を有する、本質的に同一の
粒子が得られた。圧力降下は３．！ｉＩ／副　であった
。

し０３ ゼラチンブルーム２００を使用し、その量ｆｔ４ｇに減
少した以外は例２に記載した操作を繰り返した。グルタ
ルアルデヒドの濃度を０．２Ｗ／Ｖ％に低下した。。こ
の方法で本質的に同一の性質を有する粒子が得られた。

し１４ この例には、パイロットグランド装置を使用した。アー
＆セル（Ａｒｂｏｃｅｌ　）Ｂ　Ｃ２００型のセルロー
ス繊維０．７ｋｇ、クラ−セル−セライト（ＣＩａｒｅ
ａｌ、Ｃｅ１ｉ、ｔｏ）（珪藻土）２．８ｋｇ及び２０
Ｗ／Ｗ％ゼラチンブルーム２００　４ｋｇをすべて６０
℃でレエディダ（Ｌｏｄｉｇｅ　）　ＦＭ　１３０Ｄ型
のすきの刃ミキサー中で混合し、こうして得られた濃稠
混合物を１．５１のスクリーンを備えた押出機によって
押出し、米国特許第３２７７５２０号明細書に記載され
ているマルメライザーで球形にした。押出機は２本スク
リュウ型ＥＸＤＣ−１００であシ、球形成形機はＱ−４
００型であった。こうして得られた粒子を流動原基〔ブ
ラット（Ｇｌ＆ｔｔ）型ＷＳＧ　１５　：］中で乾燥し
、篩過し、１．２〜２．０簡のフラクションを集め、残
分を循環した。次に１０ｇの試料を室温でｐｉ（７，０
に調節したＩＷ／Ｖ％グルタルアルデヒド溶液１００Ｔ
ｎｌで処理し、溶液から取り出し、脱イオン水で充分洗
浄した。こうして得られた粒子は、乾燥しなくても、極
めて硬く、凝集性であり、優れた流動性を有していた。

圧力降下は２ｇ／ｃｒｎ２であった。この例において、
不連続相は粒子の６５重量−を構成した。

汐ｌＪ５ この例では、押出機を使用しない以外は例４と同じマル
メライデーを使用した。更に、不連続相の含有率を担体
の総重量の９４　Ｗ／Ｗ％に増加した。粒径０．７〜１
．０　ｍのスヵモル（Ｓｋａｍｏｌ）粘土粒子１．５ｋ
ｐｉ球形成形機中に装入し、６０℃でハイフロ・セライ
ト０．４　ｋｇ及びＩＯＷ／Ｗ％ゼラチンプルーム８０
啓液１．１５ｋｇを、塊の形成を避けるため、交互に添
加した。こうして得られた粒子を例４と同様に処理して
、極めて良好な流動性を有する、極めて微細な粒子を得
た。圧力降下は５ｇ／Ｃｒｎ２であった。

例に の例では、米国特許第４１０６９９１号明細書に記載さ
れている高速チョッ・母−を備えたすきの刃型ミキサー
であるレエディダＦＭ５０の造粒機にクラ−セル・セラ
イト５．０ｋｇを装入し、この中に５．９５ｋｇ０１６
　ｗ／ｗ％ゼラチンプルームｚｏ。

をスフレ−した。その際、処理時間並びにミキサー及び
チョッパーの回転速度を、０．７〜１．５ｍの粒径が生
じるように選択した。これらの粒子金的４と同様に処理
して、例４と本質的に同じ性質を有する担体粒子を得た
。圧力降下は４　、ｌｉｔ　／　ｃｍ２であった。

例７ セルロース繊維１　ｋｇ、クラ−セル・セライト４ｋｇ
及びこの例により製造される循環物質ＩＱｋｇにすきの
刃型レエディダミキサーＦＭ１３０Ｄ中で１０．５ｋｇ
のＩＯＷ／Ｗチゼラテンプレーム２００をスプレーし、
これによシ種々の大きさの丸み付けされた粒子全製造し
た。前記のすべての操作の間成分及び装置を５５℃に保
持した。丸み付けされた粒子を流動床塔中で乾燥し、篩
過し、０．５〜０．７瓢のフラクション（３２％）を集
めた・ミリングした粗粒及び直接使用した微粒を含む残
分をこの例の始めに記載したように循環した。

例８ 例４に記載したのと同じミキサー、即ちレエディグＦＭ
１３０Ｄにセルロース繊維３ｋｇ、クラ−セル・セライ
ト１ｏ、ｓｋ＆及びアルブミン１．５　ｋｇ　ｆ環境温
度で装入し、水１５．２に９をスプレーした。

処理時間及ｄミキサー及びチョッ・９−の回転速度は、
好ましい粒径の粒子が製造されるように選択した。粒子
を流動床で乾燥した。乾燥した粒子の篩過分析は下記の
粒径分布を示した： ＞１ｏｏｏμｍ　　　　　１９．７チ ）８５０−３５．６％ 〉　７０７−　　　　　５８．８チ ）６００−７８．２チ ＞５００−９２．１％ （４２０−１，１チ 例９ アルブミンの代わりに、等電点可溶性大豆蛋白加水分解
物１．５ユを使用し、水の量を１４．８に９にした以外
は例８の操作を繰り返した。乾燥した粒子の篩過分析は
下記の粒径分布を示した：）１０００μｍ　　　　　２
４．２チ ）８５０−４３．２％ ）７０７−６６．１チ ＞　　ｅｏＯ＋’　　　　　　８４．４チ＞５００−９
５．２チ （４２０−１，０チ 例１０ 例６に記載したのと同じミキサー、即ちレエディダＦＭ
５０にＡｔ２０５１１．３　ｋｇ及びセルロース繊維３
．０　ｋｇを装入し、水４．５５ｋｇ中の６５０．９の
ゼラチンプルーム２００をスプレーした。温度ヲ５５℃
に保持した。ミキサー及びチョッパーの回転によって形
成された粒子を流動床で乾燥した。

篩過分析は下記の粒径分布を示した： ）　１０００　μｍ　　　　　　８．５％）８５０−　
　　　１６．１％　　　　　′）６００−４６．２チ ＞５００−６５．３％ （４２０−１５，６％ 例１ル 工７’、ｌ　ｆＦＭｌ　３０　Ｄミキサーにセルロース
繊維２．］、ｋｇ、クラ−セル・セライ）８．４ｋｇ及
び塩化す）！ＪつＡ４．５ｋｇ１ｉ入し、１１．Ｑｋｇ
の１９％（Ｗ／Ｗ）ゼラチンプルーム８０をスル−シタ
。

温度は５５℃であった。粒子を形成させ、乾燥した。篩
過分析は下記の粒径分布を示した：）１０００μｍ　　
　　　　１４．２％：＞　８５０−　　　　２３．７チ ）７０７−４０．１％ ＞６００−５９．１％ ＞５００−７９．１チ ＜４２ｒｙ−５，８％ 例１２ この例は本発明による固定化酵素製剤の製造方法を説明
するものである。例４と同＠に製造し、グルタにアルデ
ヒドで処理し、洗浄し、乾燥した担体粒子４．５ｋｇを
パイロットプラント流動床装装置（ダラット型ＷＳＧ１
５）中で流動化し、パシラス・コアキ、ランスＮＲＲＬ
　５６５０がら（７）１９Ｗ／Ｗ％の部分的に精製され
たグルコースイソメラーゼ（活性３２４０単位／９乾燥
物質、活性単位はＮ０ＶＯａｎａｌｙａ＠ｆｏｒｓｋｒ
１ｆｔ　ＡＦ　１８９／１　）の溶液９、３　ｋｇを５
０〜５５℃で粒子にスプレーし、粒子を乾燥した。こう
して得た生成物は２８重量％の部分的に精製されたグル
コースイソメラーゼを含み、酵素活性回収率／′ｉ８５
％であった。これらの粒子２０ｇ’ｃ、０．０６　Ｍ　
ＮａＨ２ＰＯ４’　２Ｈ２０，１、４Ｍ　Ｎａ２ＳＯ４
及び０．１Ｗ／Ｖ％グルタルアルデヒド全含みＩ　Ｎ　
ＮａＯＨでｐＨ７，０に調節した溶液５００ｄ中で処理
した。室温で１時間後、粒子を取ｐ出し、ｐＨ７，０の
０．０６Ｍ燐酸ナトリウムで充分洗浄し、次いで脱イオ
ン水で衣面的に洗浄し、粒子の一部を乾燥した。湿った
粒子及び乾燥粒子は元の担体と同じ優れた流動性を示し
、活性の漏出は検出されなかった。しかしながら、湿っ
た粒子では、酵素活性回収率は７０％であシ、乾燥粒子
では、酵素活性回収率は僅か４８％であった。

例１３ 例４と同様にして製造した乾燥担体粒子２０ｐをうｆ（
Ｌａｂ）型流動床で流動化した。パシラスＮＲＲＬ　Ｂ
−１１，２２９からの高温性ラクターゼ８０．ＩＵ／ｇ
を含む１１．０Ｗ／Ｗ％均質細胞スラッジ（デンマーク
特許出願Ａ　５１９０　／　７９号明細書の例１に示さ
れているようにして発酵、アンマーク特許出願Ａ３１９
０／７９号明細書の例４に記載されているようにして製
造したスラッジ）４５．８Ｊを担体粒子上に３０〜４０
℃でスグレーし、被覆した粒子を乾燥した。ラクターゼ
活性単位は下記の反応条件下に毎分１μｍｍｏｌのラク
ターゼを分離するラクターゼの量で示す。基質濃度＝１
０％ラクターゼ、温度＝６０℃、ｐｉ４＝６．５及び反
応時間＝３０分。酵素活性回収率は７９．８％であった
。

次に、被覆した球１０．９をｐＨ７，５の０．０６ＭＮ
ａ２ＨＰＯ４”　２Ｈ２０，１，４Ｍ　Ｎａ２ＳＯ４及
び０．１Ｗ／Ｖ％グルタルールデヒドを含む溶液２５　
Ｑ　ｍｌ中で処理した。室温で１時間後、粒子を取り出
し、−７，５の０．０６　Ｍ　Ｋ２ＨＰＯ４で充分洗浄
した。架橋工程に関する酵素活性は１７．２　％であっ
た。

例１４ 低分子成分を除去して乾燥固形分３９．６　Ｗ／Ｗ％（
活性２６１０　ＩＡＧ／ｇ、活性単位はノボ・アナリー
ゼフォアスクリフト（Ａｎａｌｙａｅｆｏｒｓｋｒｉｆ
ｔ　）、ＡＦ１５９／２に定義されている）にするため
、市販品ＡＭＧ２００Ｌ（）ＩＩ’？７７レツトＡＭＧ
ＢＯ２０，９−ＧＢ２５００に記載されている、１９８
２年７月）の限外濾過によって製造された黒色アスペル
ギルス（Ａ、　ｎｉｇｅｒ　）からの部分的に精製した
アミロダルコシダーゼの３９．６Ｗ／Ｗチ溶液２０．２
ｐ中に浸漬した。１時間真空を施した。こうして得た生
成物は２５重量％の酵素乾燥物質を含み、酵素活性回収
率は７７．９％であった・ 乾燥物質７１．８％の粒子２０．９をｐＨ４，５のＩＷ
／Ｖ％Ｎａ　Ｈ２ＳＯ４，２０Ｗ／　Ｎ’　％　Ｎｈ２
８０ａ及び０．２％グルタルアルデヒドの酸液１６００
ＴＩＬｌ中で処理した。１時間後、粒子を濾過によって
取り出し、ｐ１４４．５の１　％　ＮａＨ２ＰＯ４で洗
浄した。

架橋工程に関する酵素活性回収率は５５．１％であった
。

例１５ 例４に示したようにして製造した、乾燥物質含有率９８
．８％の担体粒子４０ｇ及びダルコース５チ及び硫酸す
）　ＩＪウム８％を含み、真空蒸留され、部分的に精製
されたパシラス・コアギユランス・グルコース・イソメ
２−ゼ（ＮＲＲＬ　５６５０潰厚物（乾燥物質４１．８
％）２４ｇを混合し、真空処理によって粒子の孔中の空
気を液体で置き代えた。混合後の重量は６３．２２ＩＩ
であった。乾燥物質は７９．２チであった。

この製剤１８ｇ（乾燥物質的１４ｇ）宛を、すべての場
合に硫酸ナトリウム２２％、グルコース５％及び燐酸ナ
トリウム１チを含む、ｐＨ７，５に調節し、更にグルタ
ルアルデヒド０．１％又は０．２％又は０．３％を含む
溶液３７５ｍ１で室温で１時間処理した。

この処理後、製剤をｐＨ７，５の１％燐酸ナトリウム約
１５０１１Ｌｌで５回洗浄した。

粒子から液体を排出した後、ＡＦ１８９／１によシ酵素
活性を測定した。排水した粒子について乾燥物質を測定
した。

以下余白 乾燥物質５１Ｃ相当する量を圧力降下傾ついて試験した
。

０．１％　　　　　　　３５ ０．２％　　　　　　　１３ ０．３％　　　　　　　２３ 例１６ 例４と同じミキサー、即ちレエディダＦＭ１３０Ｄニセ
ルロース繊維３ｋｇ及びクラ−セル・セライト１３．５
ｋｇ’ｉ装入し、１５ｋｇ（７）１０Ｗ／Ｖｌｒポリエ
チレンイミンＰＥＴ１５Ｔ（大乎産業株式会社）を環境
温度でスプレーし、その抜水３．０　ｋｇ及び最後に５
０Ｗ／Ｖ％グルタルアルデヒド２ゆをスプレーした。処
理時間並びにミキサー及びチョッノや−の回転速度を、
好ましい粒径の粒子が得られるように選択した。粒子を
流動床で乾燥した。

例１７ 例４と同じミキサー、即ちレエディダＦＭ１３０Ｄにセ
ルロース繊維３に９及び活性炭ベカクティフ（Ｐｅｃａ
ｃｔｉｆ　）　ＦＧＶ（フランス国Ｃｅｄｅｘ　Ｌｅｖ
ａｌｌｏｉｓのｐｓｃａ　Ｓ、Ａ、社製）１２．０ｋｇ
を装入し、１０Ｗ／Ｗ％ゼラチンプルーム２００溶液２
０．０ゆ及び最後に１４．５ｋｇ’にスプレーした。処
理時間並びにミキサー及びチョッｉ＋−の回転速度を、
好ましい粒径の粒子が得られるように選択した。粒子を
流動床で乾燥した。

本発明により製造された固定化酵素生成物は、下記の適
用実験から明らかである。固定化ダルコースイソメラー
ゼ生成物は一般に例１２と同様に製造した。生成物は３
２．６重量％の部分的に精製したグルコースイソメラー
ゼを含み、架橋を例１２と同様、に鰹節した。

Ｉ　Ｗ／Ｖ’ＮＡｒ１ｋ＋　）　！Ｊ　ウｂ　（ｐＨ＝
７．０　）　Ｔ：洗浄した後、粒子乾燥物質１０ｇに相
当する湿めった粒子２７．６　ｇを直径１．５国の水ジ
ャケット付きカラム中に充填した。カラムを６５℃に維
持し、ｐｉ−１７，８（Ｎａ２Ｃｏ、で調節）の４５Ｗ
／Ｗ％グルコースシロップを、フラクトースへのグルコ
ースの変換率を４０〜４２チにするような速度で酵素床
に連続的に導通した。初期活性は５３８　ＩＧＩｃ／ｇ
沈殿した乾燥物質（活性はノボ・アナリーゼフォアスク
リフトＡＦ１４７／６により１１算した）であり、活性
半減期は４５０時間であった。出口ｐＨは７．４〜７．
５であった。

比較のため、広く使用されている市販の固定化グリコー
スイソメラーゼ・スウィートザイムが２２５〜３００　
ＩＧＩＣ／ｐの活性及び同様の活性半減期１有じ、前記
と同じ条件、即ち６５℃及び４５Ｗ／ＷｑＡグルコース
シロツプで、スウィートザイム■を用いて７．４〜７．
５の出口ＰＨを得るために、８．２の入口ｐＨが必要と
することを挙げることができる。

特許出願人 ／ｙＷ　　イ：／ｆ、’、トリ　アクティーゼルスヵプ
特許出願代理人 弁理士　　官　木　　　朗 弁理士西舘和之 弁理士　　内　１）幸　男 弁理士　　　山　　口　　昭　　之 弁理士　　西　山　雅　也

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、表面に酵素を結合した担体を含む粒状固定化酵素態
   剤を製造するため、２相、即ち、ａ）水性媒体に少なく
   とも一部溶解又は分散きれた水溶性結合剤の連続相及び
   ｂ）担体の成形を妨害しない程度に充分小さい粒径を有
   する多数のばらばらの硬質不活性端子の不連続相を配合
   し、結合剤を必要に応じて、酵素が最終的−利用される
   媒体に不溶性にすることによって担体を形成し、担体を
   担体表面に結合する酵素と接触させることを特徴とする
   粒状固定化酵素製剤の製造方法。 ２．２つの成分の配合が連続相及び不連続相の混合であ
   り、混合物をその後粒状、好ましくは球形担体に成形す
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３、成形が米国特許第３，２７７．５２０号明細書によ
   るマルメライザー（Ｍａｒｕｍｅｒｉｚｅｒ　）で実施
   される球形化シーである特ｆｈｉＷ求の範囲第２項記載
   の方法。 ４、成形が米国特許第４．１０６．．９９１号明細書に
   記載されている造粒装置で実施される球形化処理である
   特許請求の範囲第２項記載の方法。 ゛５．不連続相と混合する前、間又は後に連続相にダル
   化剤を添加し、その後、こうして得た物質を押出成形す
   るか、父はダル化媒体中に滴加し、その際架橋剤をこれ
   らの任意の工程で添加することができる特許請求の範囲
   第２項記載の方法。 ６、ダル化剤がゼラチン、アルギン酸塩、カラジーナン
   又はキトサンである％　Ｗｆ請求の範囲第５項記載の方
   法。 ７、ダル化媒体がＣａ＋＋、Ｂａ＋＋、Ｋ＋、ポリホス
   フェート又はフェリシアン化物を含む溶液、又は冷水、
   又は冷風流である特許請求の範囲第５項記載の方法。 ８、連続相が蛋白質、特にゼラチン、大豆蛋白質、カゼ
   イン、アルブミン、ゼイン、グルテン、又は蛋白質加水
   分解物、又は多糖類、特に寒天、アルギン酸塩又は他の
   ゴム質、小麦粉、澱粉、又はキトサン又は合成物質、例
   えばカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、
   エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒド
   ロキシプロピルセルロース、ポリビニルアルコール、ホ
   リビニルビロリドン又は珪酸ナトリウムである特ｉ′１
   請求の範囲第１項〜第７項のいずれか１項に記載の方法
   。 ９　不連続相が珪藻土、破砕砂、れんが屑、粘土、ナイ
   ロン、不溶性金属酸化物若しくは不離性金属塩の粉末、
   粉砕シリカ、エーロシル、粉砕アルミナ、コランダム、
   粉砕ガラス、粉砕フリント、粉砕石英、粉砕みかげ石、
   燐酸アルミニウム、カオリン、ベントナイト、パーライ
   ト、ゼオライト、珪酸カルシウム、微孔性沖過助剤、破
   砕珪酸マグネシウム、タルク、石綿、樹層角閃石、二酸
   化チタン、酸化第二錫、磨き粉、粉砕珪酸ツルコニウム
   、カーボンブラック、活性炭、骨粉、フライアッシュ又
   は金属微粉である特許請求の範囲第１項〜第８項のいず
   れか１項に記載の方法。 １０、不連続相の量が担体の総重量に対して約１０〜約
   ９８重量％、好ましくは担体の総重量に対して５０〜９
   ５重、騒優である特許請求の範囲第１項〜第９項のいず
   れか１項に記載の方法。 １１、不連続相における単一の不活性粒子の線寸法が、
   その単一不活性粒子と同じ体積を有する球の直径として
   計算して、担体粒子の直径の１１５よシ小さく、好まし
   くは担体粒子の直径の１／２０より小さい特許請求の範
   囲第１項〜第１０項のいずれか１項に記載の方法。 １２゜連続相を適当な架橋剤、好ましくはグルタルアル
   デヒドで架橋することによって不溶化する特許請求の範
   囲第１項〜第１１項のいずれか１項に記載の方法。 １３　　担体の形が球形又は丸く、担体の平均直径が０
   ．１〜５鰭、好ましくは０．２〜２關、更に好ましくは
   ０．２〜１泪である特許請求の範囲第１項〜第１２項の
   いずれか１項に記載の方法。 １４、担体を酵素の溶液及び架橋剤で処理する特許請求
   の範囲第１項〜第１Ａ項のいずれか１項に記載の方法。 　　　　　　　　　奄 １５、　ｔＬＩ体を流動化物質として塔に導入し、可溶
   性酵素の溶液をスプレーとして塔中に導入し、こうして
   製造した物質をその後塔示ら取シ出し、架欄剤で処理す
   る特許請求の範囲第１４項記載の方法。 １６　　担体を流動化物質として塔に導入し、可溶性酵
   素の溶液及び架橋剤の混合物をスル−として塔に導入し
   、こうして製造した物質をその後浴から取り出す特許請
   求の範囲第１４項記載の方法。 １７、酵素が、好ましくはパシラス・コアギユランス（
   Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｏａｇｕｌａｎｓ　）から生じる
   グルコースイソメラーゼである特許請求の範囲第１項〜
   第１６項のいずれか１項に記載の方法。 １８、下記の成分を含む、固定床又は流動床連続酵素反
   応に適合する固定化酵素粒子： ａ）酵素反応媒体に不溶性の連続相親水性結合剤物質、
   及び ｂ）酵素反応媒体に不溶性の不連続相粒状不活性充填剤
   物質、及び Ｃ）前記粒子の表面で結合剤物質に固定された酵素。 １９　　下記の成分を含む、水性媒体に使用するため適
   合した固定化酵素粒子： ａ）親水性結合剤物質の連続相及び粒状不活性充填剤物
   質の不連続相（前記結合剤及び充填剤は水に不溶性であ
   る）、及び ｂ）前記粒子の表面で結合剤物質に架橋結合された酵素
   。 ２０　　グルタルアルデヒドとの反応によって水に不溶
   性にされた蛋白質結合剤及びグルタルアルデヒドとの反
   応により結合剤物質に架橋結合された酵素を含む特許請
   求の範囲第１９項記載の固定化酵素粒子。 ２１、更にゼラチン結合剤及び珪藻土及びセルロース繊
   維充填剤物質、及び酵素としてグルコースイソメラーゼ
   を含む特許請求の範囲第２０ｊＪ記戦の酵素粒子。