CS216234B2

CS216234B2 - Method of making the enzymatic preparation insoluble in water

Info

Publication number: CS216234B2
Application number: CS783707A
Authority: CS
Inventors: Guenter Weidenbach; Dirk Bonse
Original assignee: Kali Chemie Ag
Priority date: 1977-06-10
Filing date: 1978-06-07
Publication date: 1982-10-29
Also published as: JPS6133557B2; AR222972A1; BE868020A; IT7823967A0; HU179727B; JPS548789A; YU137078A; NL7805996A; FI781821A; US4230803A; AU3692678A; DK257678A; FI62139B; SE7806679L; FR2393810A1; DK149757C; DE2726188C2; EP0000028B1; IT1094879B; FI62139C

Description

(54) Způsob výroby ve vodě nerozpustného . enzymatického·- přípravku

Způsob výroby ve vodě nerozpustného enzymatického přípravku s glukosoisomerázovou nebo amyloglukosidázovou aktivitou, při kterém se anorganický nosič . s funkčními skupinami pro kovalentní vazbu enzymu nechává reagovat s · roztokem . · enzymu a enzym se o sobě známým způsobem váže na nosič a získaný enzymatický přípravek se izoluje, přičemž se nosič ze silikagelu o· průměru pórů 18 až 140 nm, s výhodou o průměru pórů 34 nm nechává reagovat s roztokem glukosoisomerázy se specifickou aktivitou ve volném stavu 50 až 70 jednotek/mg, obsahujícím 20 až 50 mg, · s výhodou 25 mg glukoisomerázy na gram nosiče nebo s roztokem amyloglukosidázy se specifickou aktivitou ve volném stavu 10 až 15 jednotek/mg, obsahujícím 25 až 75 mg amyloglukosidázy na gram nosiče. Při způsobu se používá silikagelového nosiče připraveného nastavením obsahu alkálie, vyjádřeného jakožto oxid sodný, na 0,1 až 0,5 % hmotnostních, vysušením a žíháním po dobu 5 až 10 hodin v proudu vzduchu obsahujícího vodní páru při teplotě 400 až 850 °C, s výhodou při teplotě 570 až 750 °C.

Vynález se týká způsobu výroby ve vodě nerozpustného enzymatického přípravku.

Je známo znehybňovat enzymy vazbou na organické nebo anorganické nosiče, to znamená učinit je nerozpustnými ve vodě, takže jsou opětovně použitelné a je možno je nasadit v nepřetržitě pracujících postupech.

Organické látky, například celulóza, nylon, polyakrylamid mají jako· nosiče velké nevýhody, protože nemají dostatečnou mechanickou stabilitu, mohou na ně působit rozpouštědla a jsou citlivé na měnící se hodnotu pH a na iontové síly. Dále pak mají sklon k napadení mikroby, čímž se může zničit vazba na enzym.

Byly proto jako nosiče navrženy anorganické látky, na nichž jsou enzymy vázány adsorpčně nebo kovalentně. Výhodný druh vazby závisí na druhu a podmínkách použití enzymu a na povaze substrátu. Je-li substrát například v silné solné koncentraci, není adsorpční metoda použitelná, protože je možná desorpce adsorbovaných molekul enzymy.

Proto se použije kovalentní vazby enzymu na nosič. Povrch nosiče musí pak obsahovat specifické funkční skupiny, které zajistí vazbu enzymu. Protože nosič ve většině případů tyto funkční skupiny nemá, je nutná předběžná úprava povrchu nosiče. Je například známo obložení anorganické látky sílaném, čímž povrch získá organicky funkční skupiny, například alkylaminy, které vytvoří s organickou látkou kovalentní vazbu. Dále byla zkoušena úprava anorganických nosičů sulfurylchloridem, thionylchloridem nebo kyanurchloridem. Kromě toho je možné potáhnout povrch nosiče ve vodě nerozpustným polymerem, který má volné funkční skupiny, například polyakroleinem, který má 10 až 70 % volných aldehydových skupin, počítáno na počet monomerních molekul.

Jako materiál pro· anorganické nosiče byly navrženy kysličníky hliníku, kysličník nikeínatý, kysličníky železa, kysličník titaničitý, kysličník zirkoničitý, hydroxylapatit, křemičitany a porézní sklo, jejichž struktura pórů umožňuje přístupnost enzymu a substrátu do vnitřního povrchu nosiče. Tyto nosiče však mají velmi rozdílné další žádoucí vlastnosti, jako je například optimální rozložení pórů nebo velikost povrchu.

Se žádným z uvedených nosičů se nepodařilo, nezávisle na použitém typu vazby, enzymy natolik znehybnět, aby se jejich specifická aktivita blížila specifické aktivitě ve volném stavu. Podle údajů od D. L. Latigue, Immobilized Enzymes for Industrial Reactors, London 1975, str. 127, zůstává i za nejlepších immobilizujících podmínek maximálně jen 80 enzymu, naneseného na nosič, v aktivní formě.

Úkolem vynálezu je vylepšit známé způsoby výroby ve vodě nerozpustných enzymatických přípravků, u nichž se uvádí ve styk anorganický nosič s funkčními skupinami za účelem tvorby kovalentní vazby s roztokem enzymu takovým způsobem, aby sé s minimální spotřebou enzymu dosáhlo maximálně aktivního přípravku.

Nevýhody dosud známých způsobů výroby byly odstraněny při způsobu výroby ve vodě nerozpustného enzymatického přípravku podle vynálezu, při němž se ve vodě nerozpustný enzymatický přípravek s glukoisomerázovou nebo amyloglukosidázovou aktivitou vyrábí tak, že se anorganický nosič s funkčními skupinami pro kovalentní vazbu · enzymu nechává reagovat s roztokem enzymu a enzym se o sobě známým způsobem váže na nosič a získaný enzymatický přípravek se izoluje, a který je vyznačen tím, že se nosič ze silikagelu o průměru pórů 18 až 140 . nm, s výhodou o průměru pórů 34 nm nechává reagovat s roztokem glukosoisomerázy se specifickou aktivitou ve volném stavu 50 až 70 jednotek/mg, obsahujícím 20 až · 50 mg, s výhodou 25 mg glukosoisomerázy na gram nosiče nebo s roztokem amyloglukosidázy, se specifickou aktiviou ve volném stavu 10 až 15 jednotek/mg, obsahujícím 25 až 75 mg amyloglukosidázy na gram nosiče.

Při způsobu se používá silikagelového nosiče připraveného nastavením obsahu alkálie, vyjádřeného jakožto· oxid sodný, na 0,1 až · 0,5 % hmotnostních, vysušením a žíháním po dobu 5 až 10 hodin v proudu vzduchu obsahujícího vodní . páru při teplotě 400 až 850 °C, s výhodou při teplotě 570 až 750 stupňů Celsia. Sušení se s výhodou provádí na · vzduchu nasyceném vodní párou při teplotě 180 až 200 °C a žíhání silikagelu se s výhodou provádí v proudu vzduchu obsahujícího vodní páru o relativní vlhkosti 40 až 80 · %.

Při provádění způsobu podle vynálezu se nejdříve opatří nosič s uvedeným průměrem pórů o sobě známými způsoby prostředky pro · spojení, které jednak dostatečně pevně drží na nosiči, zejména prostřednictvím kovalentní vazby, a jednak jsou schopny vytvořit kovalentí vazbu s enzymem. Vedle dosud nejpoužívanějších silanů pro tento účel je možno použít také jiných spojovacích prostředků. · Počet spojovacích místná nosiči musí být značný a závisí ve velké míře na povrchu nosiče.

Na takto předem upravené nosiče se pak nanáší různé množství enzymu tím, že se tyto nosiče uvedou do styku s roztoky enzymu různé koncentrace a vytvoří se o sobě známými postupy kovalentní vazba enzymu ke spojovacímu členu a tím k nosiči.

Po' ' stanovení aktivity takto získaných přípravků še ukázalo, že bez ohledu na množství vázaného enzymu závisela aktivita preparátu · · na nejčastěji se vyskytujícím průměru pórů. Kromě toho se ukázalo, že velikost zrn nosiče je pro uložení maximálního množství enzymu bezvýznamná a nanejvýše ovlivňuje jeho absolutní hodnotu. Velí216234 kost zrn nosiče má tudíž pro postup podle vynálezu jenom podřadný význam a řídí se ve velké míře podle předpokládaného účelu použití, například podle viskozity substrátu, ovládání průběhu celého postupu a podobně.

Na nosič, optimální z hlediska nejčastěji se vyskytujícího průměru pórů, byla pak opětovně aplikována různá množství enzymu. Přitom se ukázalo, že při určitých koncentracích enzymu se získají preparáty, jejichž specifická aktivita se blíží specifické aktivitě enzymu ve volném stavu nebo i tuto aktivitu dosáhne, to znamená, že relativní aktivita přípravku pak dosáhne hodnoty 100 °/o.

U nosičů, vyrobených z gelu kysličníku křemičitého, je možno dosáhnout další úpravou základní myšlenky vynálezu optimálního nosiče, když se gel žíhá po úpravě obsahu alkálií, přepočteno na Na₂O a počítáno na suchou substanci, na 0,1 až 0,5 hmotnostních procent, a po- sušení po dobu 5 až 10 hodin v proudu vzduchu obsahujícím vodní páru při teplotě 400 až 850 °C, s výhodou při teplotě 570 až 750 °C.

S výhodou se sušení provádí vzduchem nasyceným vodní párou při teplotě 180 až 200 stupňů Celsia. Pro· žíhání se ukázal jako vhodný proud vzduchu obsahující vodní páru v relativní vlhkosti 40 až 80 %.

Takto vyrobený nosič měl největší počet pórů v průměru 17,5 až 300,0 nm, výhodně 25,0 až 60,0 nm a s optimální velikostí cca 34,0 nm.

Immobilizační postup podle vynálezu je použitelný pro· všechny technicky a analyticky důležité enzymy, například pro· hydrolázy, jako amylázy, glykosidázy, proteázy, dále pro oxidoreduktázy, jako jsou glukosooxidázy, katalázy, a pro isomerázy — glukosoisomerázy a transferázy — dextransukrázy.

V případě, že jako enzymu se použije amyloglukosidázy, mající ve volném stavu specifickou aktivitu 10 až 15 jednotek na mg, získá se tehdy optimální přípravek, když se optimální nosič uvede do styku s roztokem obsahujícím 25 až 75 mg, s výhodou 50 g amyloglukosidázy na gram nosiče.

Použije-li se jako enzymu glukosoisomerázy, mající ve volném stavu specifickou aktivitu 50 až 70 jednotek/mg, získá se optimální preparát, když se tento optimální nosič uvede ve styk s roztokem obsahujícím 20 až 50 mg, výhodně 25 mg glukosoisomerázy na gram nosiče.

Příklady provedení

Příklad 1

Při přípravě nosiče 1 byl sušen po dobu tří hodin křemičitý gel vypadlý z roztoku křemičitanu sodného s kyselinou sírovou o obsahu 0,3 % hmotnostních kysličníku sodného při teplotě 180 °C ve vzduchu nasyceo ném vodní párou. 1 kg této látky pak byl žíhán po dobu 6 hodin při teplotě 730 °C v proudu vzduchu - v množství 2 1/rnin. o relativním obsahu vlhkosti 80 %. Po tomto· zpracování měl kysličník křemičitý nejčastější průměr pórů 140,0 nm. Nosič se pak rozdělil sítováním na frakce. Další preparace se pak děla s frakcí od 0,25 do 0,5 mm.

150 g této frakce nosiče se vařilo po dobu 8 hodin se 4 1 10% roztoku χ-aminopropyltrietoxysilanu v benzenu za zpětného toku a po ochlazení byla tato frakce promyta třikrát vždy 1000 ml benzenu a 100 ml acetonu. Po odpaření rozpouštědla při teplotě místnosti ve vakuu byl nosič dvakrát promyt 0,05 m fosforečnanovým · pufrem a třikrát redestilovanou vodou. Sušení se provádělo ve vakuu nad kysličníkem fosforečným. Počítáno· na bázi střední hodnoty stanovení C a N obsahoval nosič 1 0,13 m ekv. silanu/g.

g tohoto nosiče bylo suspendováno ve 20 ml roztoku 1 g amyloglukosidázy (Merek 1330) v 0,05 M fosfo-rečnanového pufru (pH 7). Aktivita amyloglukosidázy činila 11,75 U/mg, přičemž jako míry aktivity U bylo použito tvorby 1 μ mol glukózy/mín při teplotě 25 °C. Suspenze byla držena po dobu 20 minut pod vakuem, opětovně provzdušněna a po dvou hodinách ještě jednou na 20 minut vakuována. Po 4 hodinách se pak provedlo oddělení nosiče od roztoku filtrací, pak následovalo· trojí promytí redestilovanou vodou a konečně trojnásobné promytí 0,01 m fosforečným pufrem [pH 5). Hotový vzorek 1.1 byl uchován ve fosforečném pufru (pH 5) při teplotě 4 °C. C—N analýza ukázala obsah proteinu 16,5 mg/g.

K přípravě roztoku 1.2 bylo suspendováno 10 g silanového nosiče 1 ve 20 ml roztoku 0,5 g amyloglukosidázy (Merck 1330) v 0,05 M fosforečnanového pufru (pH 7). Další postup byl obdobný jako· při přípravě vzorku 1.1. G—N analýza hotového vzorku

1.2 zjistila obsah proteinu 9,0 mg/g.

Příklad 2

Za účelem přípravy nosiče 2 byl usušen SiO₂ gel vypadlý z roztoku křemičitanu sodného s kyselinou sírovou obdobně jako bylo· popsáno v příkladu 1. SiO₂ gel obsahoval 0,3 % hmotnostní Na2O. 1 kg této látky byl žíhán po dobu šesti hodin při teplotě 680 °C v proudu vzduchu v množství 2 1/min, o· relativním obsahu vlhkosti 80 %. Po tomto zpracování měl SiO2 póry s nejčastějším průměrem 34,0 nm. Nosič 2 se sítováním rozdělil na frakce. Další preparace se pak prováděla s frakcí 0,25 až 0,5 mm.

150 g této frakce nosiče bylo potom zpracováváno po dobu 8 hodin se 4 1 10%í roztoku r-aminopropyltrietoxysilanu v benzenu obdobným způsobem jak bylo uvedeno při postupu v příkladě 1.

Nosič 2 obsahoval, přepočteno na bázi střední hodnoty stanovení C a N, 0,19. m ekv. silanu/g.

g · tohoto nosiče bylo suspendováno v 20 ' ml · roztoku 1 g amyloglukosidázy (Merek 1330] v 0,05 M fosforečnanového pufru (pH 7), a preparováno obdobně jak uvedeno· v příkladě 1. Hotový vzorek 2.1 obsahoval dle C—N analýzy protein v množství 30,8 mg/ /g·

Dalších 10 · g sllanového nosiče 2 bylo suspendováno· ve 20 ml roztoku 0,5 g amyloglukosidázy (Merck 1330) v 0,05 M fosforečnanového pufru (pH 7) a obdobně jako v příkladě 1 (vzorek 1.2) dále zpracováno.

C—N analýza hotového vzorku 2.2 prokázala obsah proteinu 17,4 mg/g.

Příklad 3

Za účelem přípravy nosiče 3 byl usušen SiO₂ gel vypadlý z roztoku křemičitanu sodného s kyselinou sírovou obdobně jako bylo· popsáno v příkladě 1. Gel obsahoval 0,3 proč, hmotnostní Na₂O. 1 kg této · látky byl žíhán po dobu 6 hodin při teplotě 640 °C v proudu vzduchu v množství 2 1/min, o relativním obsahu vlhkosti 60 %. Po· tomto zpracování měl SiO₂ póry s nejčetnějším průměrem 18,0 nm. Nosič 3 se pak síťováním rozdělil na frakce. Další preparace se pak prováděla s frakcí 0,25 až 0,50 mm.

150 g této frakce nosiče bylo potom zpracováváno po dobu 8 hodin se 4 1 10% roztoku χ-aminopropyltrietoxysilanu v benzenu způsobem obdobným jak uvedeno v příkladě 1.

Nosič 3 obsahoval, přepočteno na bázi střední hodnoty stanovení C a N, 0,51 m ekv. silanu/g.

g tohoto nosiče bylo suspendováno v 20 ml roztoku 1 g amyloglukosidázy (Merek 1330) v 0,05 M fosforečnanového pufru (pH 7) a preparováno obdobně jak uvedeno· v příkladě 1.

Hotový vzorek 3.1 obsahoval podle C—N analýzy protein v množství 26,2 mg/g.

Dalších 10 g silanového· nosiče 3 bylo suspendováno v 20 ml roztoku 0,5 amyloglukosidázy (Merek 1330) v 0,05 M fosforečnanového pufru (pH 7) a obdobně jako v příkladě 1 (vzorek 1.2) dále zpracováno.

C—N analýza hotového vzorku 3.2 prokázala obsah proteinu 12,7 mg/g.

Příklad 4

Aby se dokázalo, že spojovací prostředek nemá žádného vlivu na aktivitu přípravku, byla z nosiče 2 s nejčastějším průměrem pórů 34,0 nm oddělena prosátím frakce 0,25—0,5 mm. 50 g této frakce bylo mícháno v 500 ml 12,5% vodném roztoku glutardialdehydu po dobu 5 minut při teplotě místnosti. Poté bylo přidáno 500 ml nasyceného· roztoku NH4C1. Po čtyřhodinovém míchání pří teplotě místnosti byl vzorek promyt vo dou ' · až do · odstranění chloridových iontů a usušen nad P₂0₅ ve · vakuu.

· g tohoto nosiče bylo suspendováno ve 20 · · ’ ml · roztoku . · 1 g amyloglukosidázy (Měrek 1330) v 0,05 M fosforečnanovém pufru (pH 7) · · a · preparováno· obdobně jako v příkladě

1.

Hotový vzorek 4.1 měl podle C—N analýzy obsah proteinu 29,8 mg/g.

Dalších 10 g nosiče 2 bylo suspendováno ve 20 ml roztoku 0,5 g amyloglukosidázy (Merek 1330) v 0,05 M fosforečnanovém pufru (pH 7) a dále zpracováno jako v příkladě 1 u vzorku 1.2.

Hotový vzorek 4.2 měl podle C—N analýzy obsah proteinu 17,9 mg.

Příklad 5 g nosiče s nejčastějším průměrem pórů 140,0 nm bylo susepndováno ve 40 ml roztoku 0,05 M fosforečnanového pufru (pH 7), obsahujícího 0,5 glukózoisomerázy (Y. Takasaki, Agr. Biol. Chem. 33, Nr. 11, 1527—1534/1969). Doba reakce činila 30 minut při teplotě místnosti. Vždy po 10 minutách byla reakční nádoba vyvakuována a po ukončení reakce byl zbylý roztok odsát. Poté byl produkt 3krát promyt vodou a 0,05 M fosforečnanovým pufrem (pH 7).

Hotový vzorek 5.1 měl podle C—N analýzy obsah proteinu 4,8 mg/g.

Pro přípravu · vzorku 5.2 bylo suspendováno dalších 10 g nosiče ve 40 ml roztoku 0,05 M fosforečnanového pufru (pH 7), obsahujícího 0,25 g glukózoisomerázy. Další postup probíhal obdobně jako při preparaci vzorku 5.1.

C—N analýza hotového vzorku 5.2 ukázala obsah proteinu 2,0 mg/g.

Příklad 6 g nosiče 2 o nejčastějším průměru pórů 34,0 nm bylo suspendováno· ve 40 ml roztoku 0,05 M fosforečnanového pufru (pH 7), obsahujícího 0,5 g glukosoisomerázy.

Další zpracování bylo· prováděno způsobem jako v příkladě 5. Hotový vzorek 6.1 obsahoval podle C—N analýzy obsah proteinu 22,0 mg/g.

Pro přípravu vzorku 6.2 bylo dále suspendováno 10 g nosiče 2 ve 40 ml roztoku 0,05 M fosforečnanového pufru (pH 7), obsahujícího 0,25 g glukoisomerázy. Další postup byl obdobný jako v příkladě 5. C—N analýza hotového vzorku 6.2 stanovila obsah proteinu 10,2 mg/g.

Příklad 7 g nosiče 3 o nejčastější velikosti pórů 18,0 nm bylo suspendováno ve 40 ml roztoku 0,05 M fosforečnanového pufru (pH 7), obsahujícího 0,5 g glukosoisomerázy. ,

Další zpracování bylo obdobné jako v příkladě 5. Hotový vzorek 7.1 obsahoval podle

С—N analýzy obsah proteinu 11,2 mg/g.

Pro přípravu, vzorku 7.2 bylo suspendováno dalších 10 g nosíce 3 ve 40 ml roztoku 0,05 M fosforečnanového pufru (pH 7), obsahujícího 0,25 glukózoisomerázy. Další postup zpracovávání byl obdobný jako u přípravy vzorku 5.1.

Podle C—N analýzy obsahoval vzorek 7.2 protein v množství 5,1 mg/g.

Příklad 8 g nosiče s nejčastějším průměrem pórů 34,0 nm a zpracovávaného vodným roztokem glutardíaldehydu, uvedeného v příkladě 4, bylo suspendováno ve 40 ml roztoku 0,05 M fosforečnanového pufru (pH 7), obsahujícího 0,5 g glukosoisomerázy. Další zpracování bylo obdobné jako v příkladu 5. Hotový vzorek 8.1 měl podle C—N analýzy obsah proteinu 21,3 mg/g.

Pro přípravu vzorku 8.2 bylo suspendováno dalších 10 g téhož nosiče ve 40 ml roztoku 0,05 M fosforečnanového pufru (pH 7), obsahujícího 0,25 glukózoisomerázy. Další postup byl obdobný jako při preparaci vzorku 5.1. C—N analýza stanovila v hotovém vzorku 8.2 obsah proteinu 9,8 mg/g.

Příklad 9

3.2, 4.1, 4.2, jakož i aktivita enzymu použitého к fixaci, tj. amyloglukosidázy Merck 1330, byla stanovena podle metody dinitrosalicylové kyseliny (srovnej Rick, W. Stegbauer, Η. P. v Bergmeyer, H. U. „Meth. der Enzymatischen Analyse“, Verlag Chemie 1970, str. 848 a další). Jednotka aktivity (U) odpovídá množství enzymu, které uvolňuje za inkubačních podmínek 1 μ ekvivalent redukujících skupin, počítáno jako glukózu, za minutu.

Inkubační podmínky

2% roztok substrátu Zulkowsky-škrob Merck 1257 v 0,1 M octanovém pufru, pH 5,0, 30 minut, 25 °C.

Na nosiči fixované přípravky byly za výše uvedených podmínek suspendovány ve 40 ml reaktoru při rychlosti míchadla 600 min“¹, přičemž doba pro tvorbu produktu je nezávislá na rychlosti míchání.

Obsah proteinu v přípravcích byl zjištěn na základě středních hodnot C—N stanovení. Nejčastější průměr pórů nosičů byl staonoven z rozložení pórů, měřeno vysokotlakým pórometrem.

V následující tabulce 1 jsou shrnuty výsledky ze vzorků 1 až 4. Použité parametry byly definovány následovně:

Aktivita preparátů 1.1, 1.2, 2.1, 2.2, 3.1, nejčastěji se vyskytující průměr pórů zachycení enzymu aktivita specifická aktivita specifická aktivita ve volném stavu relativní aktivita

D (nm) c_E (mg enzymu/g nosiče)

U (jednotky/g vzorku)

U_s = U/c_E (jednotky/mg enzymu) UsF (jednotky/mg enzymu) u_rel = 100 . -zý- [ %;)

USF

Tabulka 1 (Fixovaná amyloglukosidáza) vzorek nejčastější průměr zachycení enzymu aktivita pórů U U_s U_rel U_SF

1.1	140,0	16,5	98,4	5,96	51	11,75
1.2		9,0	100,5	11,16	95
2.1	34,0	30,8	208,8	6,77	58
2.2		17,4	203,9	11,71	100
3.1	18,0	26,2	150,0	5,72	49
3.2		12,7	149,5	11,77	100
4.1	34,0	29,8	199,7	6,70	57
4.2		17,9	209,4	11,70	100

Inkubační podmínky

Příklad 10

Aktivita preparátů popsaných v příkladech 5 až 8, a to 5.1, 5.2, 6.1, 6.2, 7.1, 7.2, 8.1, 8.2, jakož i aktivita glukosoisomerázy použité к fixaci byla stanovena metodou Takasaki (viz Y. Takasaki: Agr. Biol. Chem. sv. 30, č. 12, 1247—1253, 1966 a Z. Dische a E. Borenfreund: J. Biol. Chem. 192, 583, 1951). Jednotka aktivity (U) byla definována jako množství enzymu, které za inkubačních podmínek vytvoří 1 mg fruktózy.

teplota 65 °C reakční dobal hod.

substrát 0,1 M glukózy x H₂O (Merck

8342 v 0,05 M fo-sforečnanovém pufru, pH 8,0, s 0,0004 M MgSO₄

Prepráty fixované na nosiči byly suspendovány v reaktoru s míchadlem za standardních podmínek obdobně jako je uvedeno v příkladě 9.

Obsah proteinu preparátů byl zjištěn na Význam použitých značek je uveden v bázi středních hodnot C—N analýzou. příkladě 9.

V následující tabulce 2 jsou shronuty výsledky zkoušek vzorků 5 až 8.

Tabulka 2 (Fixovaná glukosoisomeráza) vzorek nejčastěji se vysky- zachycení enzymu tující průměr pórů U aktivita

Us U_re]

Usf

5.1	140.0	4,8	115,4	24,0	41
5.2		2,0	117,3	58,7	99
6.1	34,0	22,0	558,5	25,4	43
6.2		10,2	556,1	54,5	93
7.1	18,0	11,2	291,0	26,0	44
7.2		5,1	292,3	57,3	97
8.1	34,0	21,3	543,2	25,5	43
8.2		9,8	544,0	55,5	94

Z výsledků zkoušek vyplývají následující závěry.

Aktivita U analyzovaných vzorků je závislá na nejvíce se vyskytujícím průměru pórů nosiče.

Specifická aktivita U_s závisí od zachycení enzymů a dosahuje při určité koncentraci enzymu C_E hodnotu aktivity enzymu ve volném stavu U_Sf, takže U_rei = 100. Překročí-li se toto množství enzymu, klesá specifická aktivita, přičemž z U_s a c_E zůstává konstantní.

Množství enzymu, zachycené nosičem, je funkcí nejčastěji se vyskytující velikosti průměru pórů. Systém enzym/nosič dává maximální aktivitu při co nejméně možném použití enzymu, když optimální nosič 2 s nejčastějším průměrem pórů 34,0 nm zadr ží 17,4 mg amyloglukosidázy/g, popřípadě

10,2 mg glukosoisomerázy/g (vzorky 2.2, případně 6.2).

Zachycení enzymu a aktivita u zkoušených vzorků je nezávislá na prostředku pro spojení.

Protože náklady na enzym jsou značné a velmi rychle stoupají s požadovaným stupněm čistoty a z hlediska hospodářského využití tedy hrají významnou roli, bylo pomocí způsobu podle vynálezu poprvé umožněno technicky zpracovat i drahé enzymy. Způsob podle vynálezu totiž umožňuje optimalizovat množství enzymu, potřebného pro maximální aktivitu, při použití nosiče připraveného právě způsobem podle vynálezu.

Claims

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

1. Způsob výroby ve vodě nerozpustného enzymatického přípravku s glukosoisomerázovou nebo amyloglukosidázovou aktivitou, při kterém se anorganický nosič s funkčními skupinami pro kovalentní vazbu enzymu nechává reagovat s roztokem enzymu a enzym se o sobě známým způsobem váže na nosič a získaný enzymatický přípravek se izoluje, vyznačený tím, že se nosič ze silikagelu o průměru pórů 18 až 140 nm, s výhodou o průměru pórů 34 nm nechává reagovat s roztokem glukosoisomerázy se specifickou aktivitou ve volném stavu 50 až 70 jednotek/mg, obsahujícím 20 až 50 mg, s výhodou 25 mg glukosoisomerázy na gram nosiče nebo s roztokem amyloglukosidázy se specifickou aktivitou ve volném stavu 10 až 15 jednotek/mg, obsahujícím 25 až 75 mg amyloglukosidázy na gram nosiče.
2. Způsob podle bodu 1, vyznačený tím, že se s roztokem enzymu nechává reagovat silikagelový nosič, připravený nastavením obsahu alkálie, vyjádřeného jakožto oxid sodný, na 0,1 až 0,5 % hmotnostních, vysušením a žíháním po dobu 5 až 10 hodin v proudu vzduchu obsahujícího vodní páru při teplotě 400 až 850 °C, s výhodou při teplotě 570 až 750 °C.
3. Způsob podle bodu 2, vyznačený tím, že se s roztokem enzymu nechává reagovat silikagelový nosič sušený na vzduchu nasyceném vodní párou při teplotě 180 až 200 stupňů Celsia.
4. Způsob podle bodu 2 nebo 3, vyznačený tím, že se s roztokem enzymu nechává reagovat silikagelový nosič žíhaný v proudu vzduchu obsahujícího vodní páru o relativní vlhkosti 40 až 80 '%.