HU179727B

HU179727B - Process for producing water-insoluble enzyme composition

Info

Publication number: HU179727B
Application number: HU78KA1505A
Authority: HU
Inventors: Guenter Weidenbach; Dirk Bonse
Original assignee: Kali Chemie Ag
Priority date: 1977-06-10
Filing date: 1978-06-05
Publication date: 1982-11-29
Also published as: JPS6133557B2; AR222972A1; BE868020A; IT7823967A0; JPS548789A; YU137078A; NL7805996A; FI781821A; US4230803A; AU3692678A; DK257678A; FI62139B; SE7806679L; FR2393810A1; DK149757C; DE2726188C2; EP0000028B1; IT1094879B; FI62139C; DE2726188B1

Description

A találmány tárgya eljárás vízben oldhatatlan enzimkcszítmény előállítására.

Ismeretes, hogy enzimek szerves vagy szervetlen hordozóanyagokhoz kötve immobilizálhatók, azaz vízben oldhatatlanná tehetők. Ezáltal az enzimek ismételten felhasználhatókká és folyamatos üzemű eljárásokban alkalmazhatókká válnak.

A hordozóanyagként felhasznált szerves anyagok [például cellulóz: Biochem, J. 107 (1968), 669; nylon: Biochim. Biophys. Acta 220 (1970), 343; poliakrilamid: Sciencc 142 (1963), 678] közös hátránya, hogy mechanikai stabilitásuk nem kielégítő, egyes oldószerek hatásának nem állnak ellen, a közeg pH-jának és ionerősségénck változására érzékenyek, sőt egyes képviselőik mikroba* fertőződésre is hajlamosak, amelynek eredményeként a megkötött enzim leoldódhat a hordozóanyagról.

A fentiek figyelembevételével hordozóanyagként szervetlen anyagok alkalmazását javasolták, amelyekre az enzimek adszorpcióval (2 717 852 sz. USA szabadalmi leírás) vagy kovalens kötés útján (3 519 538 sz. USA szabadalmi leírás) rögzíthetők. Az enzim felvitelének legelőnyösebb módja minden esetben az enzim típusától és felhasználási körülményeitől, valamint a hordozóanyag minőségétől függ. Abban az esetben például, ha a szubsztrátum tömény sóoldatban van jelen, az adszorpciós felviteli mód nem alkalmazható, mert az enzim deszorpció révén eltávozhat a hordozóanyagról. Ekkor az enzimet előnyösen kovalens kötéssel rögzítik a hordozóanyagon. Ennek érdekében a hordozóanyag felületének specifikus rcakcióképes csoportokat kell tartal2 maznia, amelyek az enzimmel kovalens kémiai kötést képeznek. Minthogy a legtöbb esetben a hordozóanyag eredeti állapotában nem tartalmazza a szükséges reakcióképes csoportokat, az enzim felvitele előtt a hordozó5 anyag felületét előkezelésnek kell alávetni. Egy ismert módszer szerint például a szervetlen anyagokat szignókkal kezelik, és így a hordozóanyag felületén rcakcióképes szerves funkcionális csoportokat (például alkilamin-maradékokat) alakítanak ki, amelyek szerves 10 anyagokkal kovalens kémiai kötést képeznek (1 944 418 sz. NSZK-beli közzétett szabadalmi bejelentés, DAS). Egy másik ismert módszer szerint a szervetlen hordozóanyagot az enzim felvitele előtt szulfurilkloriddal, tionilkloriddal vagy cianurkloríddal kezelik. Ismert az is, 15 hogy a hordozóanyag felületére szabad rcakcióképes csoportokat tartalmazó, vízben oldhatatlan polimer bevonat (például a monomer-molekulák számára vonatkoztatva 10—70% szabad aldehid-csoportot tartalmazó poliakroleinből álló bevonat) vihető fel (3 821 083 sz. 20 USA szabadalmi leírás).

Szervetlen hordozóanyagként alumíniumoxidok, nikkeloxid, vasoxid, titánoxid, cirkóniumoxid, hidroxiapatit, szilikátok és porózus üvegek alkalmazását javasolták. (Tmmobilized Enzymes, Antigens, Antibodies and 25 Peptides: Preparation and Characterization, kiadó: Howard H. Weetall, New York, 1975, 41 -44. oldal.) Valamennyi javaslat megegyezik abban, hogy a hordozóanyag pórusszerkezetének lehetővé kell tennie az enzim és a szubsztrátum behatolását a belső felülethez; a hor30 dozóanyag további kívánt jellemzőiről, így például az

197727 optimális póruseloszlásról és a felület nagyságáról azonban nagymértékben eltérő és ellentmondó adatok állnak rendelkezésünkre.

Az alkalmazott felviteli módoktól függetlenül eddig még egyik ismert hordozóanyagon sem sikerük az enzimeket úgy immobilizálni, hogy azok specifikus aktivitása immobílizák állapotban megközelítse a szabad enzimek specifikus aktivitását. D. L. Latigue adatai szerint (Immobilized Enzymes fór Industrial Reactors, London, 1975, 127. oldal) a legkedvezőbb immobilizációs körülmények között is a hordozóanyagra felvitt enzim legföljebb 80%-a van aktív állapotban jelen.

A találmány értelmében a vízben oldhatatlan enzimkészítmények előállítására alkalmazott, önmagában ismert eljárást, amelynek során egy kovalens kötések kialakítására alkalmas, reakcióképes csoportokat hordozó szervetlen hordozóanyagot enzimoldattal hoznak érintkezésbe, oly módon kívánjuk tökéletesíteni, hogy minimális enzimfelhasználás mellett maximális aktivitással rendelkező enzimkészítményekhez jussunk.

Találmányunk tárgya eljárás vízben oldhatatlan enzimkészítmények előállítására, valamely enzim kovalens megkötésére alkalmas funkciós csoportokat tartalmazó szervetlen hordozóanyag és valamely enzim-oldat érintkezésbe hozása, az enzimnek a hordozón önmagában ismert eljárással történő megkötése és a kapott enzimkészítmények elkülönítése útján, oly módon, hogy először a leggyakoribb pórusátmérőben különböző hordozókat az enzim-koncentrációban különböző enzimoldatokkal hozunk érintkezésbe, az enzimet a hordozón megkötjük, az enzimkészítményeket izoláljuk, aktivitásukat meghatározzuk, és a felhasznált különböző hordozók közül azzal a leggyakoribb pórusátmérővel rendelkező hordozót választjuk ki, mely a rajta megkötött enzimmennyiség ellenére a legnagyobb aktivitású készítményt biztosítja, majd a kiválasztott hordozóanyagot enzimtartalmukban különböző enzim-oldatokkal hozzuk érintkezésbe, az enzimet a hordozón megkötjük, az enzimkészltményeket izoláljuk, aktivitásukat és fajlagos aktivitásukat meghatározzuk, és a felhasznált különböző enzim-oldatok közül azt az enzim-oldatot választjuk ki, mely a legnagyobb aktivitású és az enzim szabad állapotban mért fajlagos aktivitásához közelesö vagy azzal azonos fajlagos aktivitású készítményt biztosítja.

A találmány értelmében hordozóanyagként olyan leggyakoribb pórusátmérővcl rendelkező szervetlen anyagot alkalmazunk, amely a megkötött enzimmcnnyiscgtől függetlenül maximális aktivitású enzimkészítményt szolgáltat, és ezt a hordozóanyagot olyan enzimoldattal hozzuk érintkezésbe, amely csupán annyi enzimet tartalmaz, hogy az így kialakult készítmény specifikus enzimaktivitása elérje vagy megközelítse az enzim szabad állapotban meghatározott specifikus aktivitását.

A találmány szerint először különböző leggyakoribb pórusátmérővel rendelkező hordozóanyagokat ismert módon olyan kapcsolószerekkel kezelünk, amelyek egyrészt megfelelő szilárdsággal kapcsolódnak a hordozóanyaghoz, másrészt pedig alkalmasak arra, hogy az enzimmel kovalens kötést képezzenek. A kapcsolószert előnyösen kovalens kötés kialakításával rögzítjük a hordozóanyagon. E tekintetben különösen előnyösnek bizonyult a szervetlen hordozóanyagok szilánozása, kapcsolószerként azonban — miként már említettük — egyéb anyagokat is felhasználhatunk. A hordozóanyagnak kellően nagy számú kapcsoló tagot kell tartalmazo riia; a felvihető kapcsoló tagok száma nagymértékben függ a hordozóanyag felületi jellemzőitől.

A fentiek szerint előkezelt hordozóanyagokat ezután változó mennyiségű enzimmel (azaz változó koncentrációjú enzimoldatokkal) hozzuk érintkezésbe, és az enzimet ismert módon, kovalens kötés kialakítása révén a kapcsoló tagokhoz (és ezzel a hordozóanyaghoz) rögzítjük. E kísérletsorozat végén meghatározzuk a kapott enzimkészítmények aktivitását. Az eredmények azt mutatják, hogy az enzimkészítmények aktivitása — a megkötött enzimmcnnyiscgtől függetlenül — a leggyakoribb pórusátmcrőtől függően változik, és az aktivitás/leggyakoribb pórusátmérő görbe maximumon megy keresztül. Az eredmények azt is igazolják, hogy a maximum helyzete független a hordozóanyag szemcseméretétől ; a hordozóanyag szemcsemérete csupán a maximum abszolút értékét befolyásolja. A hordozóanyag szemcsemérete tehát alárendelt jelentőségű tényező, és ténylegesen alkalmazandó értékét elsősorban egyéb körülmények, így az enzim felhasználási területe, a szubsztrátum viszkozitása, az eljárásmód és hasonlók szabják meg.

A leggyakoribb pórusátmérő szempontjából értékelt és optimálisnak bizonyult hordozóanyagokat ezután változó mennyiségű enzimmel hozzuk érintkezésbe, és vizsgáljuk az enzimkoncentráció és az aktivitás összefüggését. E vizsgálatok alapján megállapítható, hogy meghatározott enzimkoncentrációk alkalmazásakor olyan enzimkészítményekhez jutunk, amelyek specifikus enzimaktivitása eléri vagy megközelíti az enzim szabad állapotban mért aktivitását, azaz relatív aktivitásuk 100% vagy ahhoz közel eső érték.

A találmány értelmében optimális tulajdonságokkal rendelkező szilíciumdioxid-gél-alapú hordozóanyagokat alakíthatunk ki úgy, hogy a gél nátriumoxidban kifejezett és száraz anyagra vonatkoztatott alkálitartalmát 0,1—0,5 súly% értékre állítjuk be, a gélt szárítjuk, majd 400—850 C°-os, előnyösen 570—750 C°-os vízgöztartalmú levegőáramban 5—10 órán át hevítjük.

A gélt előnyösen vízgőzzel telített levegőben, 180— 200. C°-on szárítjuk. A gél hevítésekor célszerűen 40— 80% relatív nedvességtartalmú levegőáramot használunk fel.

A fentiek szerint előállított hordozóanyag leggyakoribb pórusátméröje 175 A és 3000 Á közötti, előnyösen 250 A és 600 A közötti, kiemelkedően előnyösen 340 A körüli érték.

A találmány szerinti immobilizációs eljárást az összes technikai és analitikai szempontból jelentős enzim rögzítésére alkalmazhatjuk. A felhasználható enzimek közül példaként a következőket említjük meg: hidrolázok (így amilázok, glükozidázok és protcázok), oxidoreduktázok (így glükóz-oxidáz és kataláz), izomerázok (így glükóz-izomeráz) és transzferázok (így dextrán-szacharáz).

Abban az esetben, ha enzimként szabad állapotban 10—15 egység/mg specifikus aktivitással rendelkező amiloglükozidázt használunk fel, akkor jutunk optimális tulajdonságokkal rendelkező enzimkészítményekhez, ha az optimális leggyakoribb pórusátmérővcl rendelkező hordozóanyagot olyan enzimoldattal hozzuk érintkezésbe, amely 1 g hordozóanyagra vonatkoztatva 25—75 mg, előnyösen 50 mg amiloglükozidázt tartalmaz.

Szabad állapotban 50—70 egység/mg specifikus aktivitással rendelkező glükóz-izomeráz felhasználásakor úgy alakíthatunk ki optimális tulajdonságokkal rendelkező enzimkészltményeket, ha az optimális leggyakoribb pórusátmérővel rendelkező hordozóanyagot olyan enzimoldattal hozzuk érintkezésbe, amely 1 g hordozóanyagra vonatkoztatva 20—50 mg, előnyösen 25 mg glükóz-izomerázt tartalmaz.

A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük.

1. példa

A hordozóanyagot a következőképpen állítjuk elő: Nátriumszilikát-oldatból kénsawal kicsapott, 0,3 súly% nátriumoxidot tartalmazó szilíciumdioxid-gélt vízgőzzel telített levegőben 3 órán át 180 C³-on szárítunk. 1 kg így kapott anyagot 2 1/perc sebességű, 80%-os relatív páratartalmú levegőáramban 6 órán át 730 C°-on hevítünk. Az így kapott hordozóanyag (1. hordozóanyag) leggyakoribb pórusátmérője 1400 Á. Az 1. hordozóanyagot szitáljuk, és a következő műveleteket a szitálással elkülönített, 0,25 -0,5 mm szemcseméretű frakcióval hajtjuk végre.

150 g, a fentiek szerint előállított hordozóanyag-frakcióhoz 4 liter 10%-os benzolos γ-amino-propil-trietcxiszilárL-oIdatot adunk, ésazelegyet8 órán át visszafolyatás közben forraljuk. Lehűlés után a szilárd anyagot 3 x 1000 ml benzollal és 3 x 1000 ml acetonnal mossuk. Az oldószert szobahőmérsékleten, vákuumban lepároljuk, és a kapott hordozóanyagot 0,05 mólos foszfátpuffer-oldattal (pH=7) kétszer, majd kétszer desztillált vízzel háromszor mossuk. A hordozóanyagot vákuumban foszforpentoxid fölött szárítjuk. A szén- és nitrogéntartalom meghatározásakor kapott átlagértékek szerint az 1. hordozóanyag 0,13 mólekvivalens/g szilánt tartalmaz. _z g, a fentiek szerint előállított hordozóanyagot 1 g amiloglükozidázt (Merek 1330) tartalmazó 20 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldatban (pH=7) szuszpendálunk. A felhasznált amiloglukozidáz aktivitása 11,75 egység/mg (1 egység=az enzim 1 perc alatt 25 C’-on 1 uniói glükózt fejleszt). A szuszpenziót 20 percig vákuumban tartjuk, majd ismét levegőztetjük, és 2 óra elteltével újabb 20 percre vákuum alá helyezzük. 4 óra elteltével a hordozóanyagot kiszűrjük, kétszer desztillált vízzel háromszor, majd 0,01 mólos foszfátpuffer-oldattal (pH=5) háromszor mossuk, végül a kapott mintát (1.1. minta) 4 C'-on foszfátpuffer-oldatban (pH—5) tároljuk. Szén- és nitrogénelemzés alapján a minta fehérjetartalma 16,5 mg/g.

g, a korábbiakban ismertetett módon szilánozott

1. hordozóanyagot 0,5 g amiloglükozidáz (Merch 1330) 20 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldattal (pH=7) készített oldatában szuszpendálunk. A szuszpenziót az 1.1. minta előállításánál ismertetett módon dolgozzuk fel. Az így kapott minta (1.2. minta) szén- és nitrogénelemzés alapján 9,0 mg/g fehérjét tartalmaz.

2. példa

A hordozóanyagot a következőképpen állítjuk elő: nátriumszilikát-oldatból kénsavval kicsapott, 0,3 súly% nátriumoxidot tartalmazó szilíciumdioxid-gélt az 1. példában ismertetett módon szárítunk. 1 kg így kapott anyagot 2 1/perc sebességű, 80% relatív páratartalmú levegőáramban 6 órán át 680 C^c-on hevítünk. A kapott hordozóanyag (2. hordozóanyag) leggyakoribb pórusátmérője 340 A. A 2. hordozóanyagot szitáljuk, és a következő műveleteket a szitálással elkülönített, 0,25— 0,5 mm szemcseméretű frakcióval végezzük.

150 g, a fentiek szerint kapott hordozóanyag-frakcióhoz 4 liter 10%-os benzolos γ-amino-propil-trictoxiszilán-oldatot adunk, és az elegyet az 1. példában közöltek szerint kezeljük. Á kapott 2. hordozóanyag a szenes nitrogénelemzés átlagértékei alapján grammonként 0,19 mólekvivalens szilánt tartalmaz.

g, a fentiek szerint előállított hordozóanyagot 1 g amiloglukozidáz (Merek 1330) 20 ml, 0,05 mólos foszfátpufferoldattal (pH=7) készített oldatában szuszpéndálunk, és a szuszpenziót az 1. példában közöltek szerint kezeljük. A kapott 2.1. minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 30,8 mg fehérjét tartalmaz.

g, a korábbiakban ismertetett módon szilánozott

2. hordozóanyagot 0,5 g amiloglukozidáz (Merek 1330) 20 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldattal (pH=7) készített oldatában szuszpendálunk, majd a szuszpenziót az 1.2. minta előállításánál közöltek szerint kezeljük. A kapott

2.2. minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 17,4 mg fehérjét tartalmaz.

3. példa

A 3. hordozóanyagot a következőképpen állítjuk elő: nátriumszilikát-oldatból kénsavval kicsapott, 0,3 súly% nátriumoxidot tartalmazó szilíciumdioxid-gélt az 1. példában ismertetett módon szárítunk. 1 kg így kapott anyagot 2 1/perc sebességű, 60% relatív páratartalmú levegőáramban 6 órán át 640 C°-on hevítünk. A kapott

3. hordozóanyag leggyakoribb pórusátmérője 180 A. A 3. hordozóanyagot szitáljuk, és a következő műveleteket a szitálással elkülönített, 0,25—0,5 mm szemcseméretű frakcióval végezzük.

150 g, a fentiek szerint kapott hordozóanyag-frakcióhoz 4 liter 10%-os benzolos γ-amino-propil-trietoxi-szilán-oldatot adunk, és az clcgyct az í. példában közöltek szerint kezeljük. A kapott 3. hordozóanyag a szén- és nitrogénelemzés átlagértékei alapján grammonként 0,51 mólekvivalens szilánt tartalmaz.

g, a fentiek szerint előállított hordozóanyagot 1 g amiloglükozidáz (Merek 1330) 20 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldattal (pH=7) készített oldatában szuszpendálunk, és a szuszpenziót az 1. példában közöltek szerint kezeljük. A kapott 3.1. minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 26,2 mg fehérjét tartalmaz.

g, a korábbiakban ismertetett módon szilánozott

3. hordozóanyagot 0,5 g amiloglükozidáz (Merek 1330) 20 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldattal (pH=7) készített oldatában szuszpendálunk, és a szuszpenziót az 1. példában közöltek szerint kezeljük. A kapott 3.2. minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 12,7 mg fehérjét tartalmaz.

4. példa

A 2. hordozóanyagból szitálással elkülönítjük a 0,25— 0,5 mm szemcseméretű frakciót. 50 g így elkülönített, 340 A leggyakoribb pórusátmérőjű hordozóanyag-frakciót 500 ml 12,5%-os vizes glutárdialdehid-oldathoz adunk, és az elegyet 5 percig szobahőmérsékleten, kever jük. Ezután azelegvhez 500 ml telített, vizes ammóniumklorid-oldatot adiink, és az elegye t 4 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután a szilárd anyagot leszűrjük, vízzel k lórid mentesre.- mossuk, és vákuumban foszforpentoxid fölött szárítjuk. 10 g így kapott hordozóanyagot 1 g amiloglükozidáz (Merek 1330) 20. ml 0,05 mqífls foszfátpuffer-oldattal (pH=7) készített oldatában szuszpendálunk, és a szuszpenziót az 1. példában közöltek szerint kezeljek.

Az így kapott 4.L minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 29,8 mg fehérjét tartalmaz.

További 10 g, az előzőek szer-int előkezelt 2. hordozóanyagot 0,5 g amiloglükozidá?. (Merek 1330) 20 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldattal (pH—7) készített oldatában szuszpendálunk, és a szuszpenziót az 1. példában az 1.2. minta előállításánál közöltek szerint kezeljük. A kapott

4.2. minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 17,9 mg fehérjét tartalmaz,

A 4.1. és 4.Λ mintával végzett kísérletek eredményei —τ amelyeket a későbbiekben ismertetünk — azt igazolják, hogy a kapcsolószer minősege semmiképpen nem befolyásolja az enzimkészítmeny aktivitását.

5. példa g 1. hordozóanyagot (leggyakoribb pórusátmérő: 1400 Á) 0,5 g gliikóz-izomcráz [Y. Takasaki: Agr. BióC Chem. 33, Nr. 11, 1527—1534 (1969)] 40 ml 0,05 mólos .foszfátpuffer-oldattal (pH =7) készített oldatában szuszpendálunk. A szuszpenziót 30 percig szobahőmérsékleten.tartjuk. A reakcióedényt 10 percenként evakuáljuk, majd a reakció lezajlása után az oldat maradékát leszívatjuk· A szilárd anyagot vízzel és 0,05 mólos foszfátpuffer-oldattal (pH—7) háromszor mossuk. Az így kapott 5.1. minta szén-'és nitrogénelemzés alapján grammonként 4,8 mg fehérjét tartalmaz.

Az 5.2. minta előállítása során 10 g 1. hordozóanyagot 40 mj 0,05 mólos foszfátpuffer-oldatban (pH=7), amely 0,25 g glükóz-izomerázt tartalmaz, szuszpendálunk, majd a szuszpenziót az 5.1, minta előállításánál ismertetett módon kezeljük. A kapott. 5.2. minta szenes nitrogénelemzés alapján grammonként 2,0 mg fehérjét tartalmaz. ,

6. példa . 10 g 2. hordozóanyagot (leggyakoribb pórusátmérő: 340 Á) 0,5 g glükóz-izomerázt tartalmazó 40 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldatban (pH =7) szuszpendálunk. A szuszpenziót az 5. példában közöltek szerint kezeljük. Az így kapott 6.1. minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 22,0 mg fehérjét tartalmaz.

A 6.2..minta előállítása során 10 g 2. hordozóanyagot 0,25 g glükóz-izomerázt tartalmazó 40 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldatban (pH^7) szuszpendálunk, majd a szuszpenziót az 5. példában közöltek szerint kezeljük. A kapott 6.2. minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 10,2 mg fehérjét tartalmaz.

7. példa g 3. hordozóanyagot (leggyakoribb pórusátmérő: 180 Á) 0,5 g glükóz-izomerázt tartalmazó 40 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldatban (pH=7) szuszpendálunk, és a szuszpenziót az 5. példában közöltek szerint kezeljük. Az így kapott 7.1. minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 11,2 mg fehérjét tartalmaz.

A 7.2. minta előállítása során 10 g 3. hordozóanyagot 0,25 g glükóz-izomerázt tartalmazó 40 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldatban (pH=7) szuszpendálunk, majd a szuszpenziót az 5.1. minta előállításánál ismertetett módon kezeljük. A kapott 7.2. minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 5,1 mg fehérjét tartalmaz.

8. példa g, a 4. példában ismertetett hordozóanyagot (leggyakoribb pórusátmérő: 340 Á; vizes glutárdialdehidoldattal kezelt anyag) 0,5 g glükóz-izomerázt tartalmazó 40 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldatban (pH=7) szuszpendálunk, és a szuszpenziót az 5. példában közöltek szerint kezeljük. A kapott 8.1. minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 21,3 mg fehérjét tartalmaz.

A 8.2. minta előállítása során 10 g, a fentiekben közölt minőségű hordozóanyagot 0,25 g glükóz-izomerázt tartalmazó 40 ml 0,05 mólos foszfátpuffer-oldatban (pH= =7) szuszpendálunk, majd a szuszpenziót az 5.1. minta előállításánál megadottak szerint kezeljük. A 8.2· minta szén- és nitrogénelemzés alapján grammonként 9,8 mg fehérjét tartalmaz.

9. példa

Az 1—4. példában ismertetett 1.1., 1.2,, 2.1., 2.2., 3.1., 3.2., 4.1. és 4.2. minta, valamint a hordozóanyagon rögzített szabad enzim (amiloglükozidáz, Merek 1330) aktivitását dinitroszalicílsavas módszerrel határoztuk meg [Rick, V., Stcgbauer, ÍI. P.: Meth. d. Enzymatischcn Analyse (szerk.: Bergmeyer, H. U., kiadó: Verlag Chcrnie 1970), 848, és következő oldalak]. Egy aktivitási egységnek (U) azt az enzimmennyiséget tekintjük, amely az inkubálás körülményei között percenként 1 mikroekvivalens redukálandó csoportot (glükózt) szabadít fel.

Az inkubálást a következő körülmények között végeztük: 2%-os szubsztrátum-oldat (Zulkowsky-keményítő, Merek 1257); oldószer: 0,1 mólos acetát-puffcr (pH=5,0); hőmérséklet: 25 C°; reakcióidő: 30perc.

A hordozón rögzített enzimkészítményeket 40 ml-es reaktorba mértük be, és a szuszpenziót a fenti körülmények között 600/’perc sebességgel kevertük. A termék képződési sebessége független a keverés sebességétől.

Az enzimkészítmények fehérjetartalmát a szén- és nitrogénmeghatározáskor kapott átlagértékek alapján számítottuk ki. A hordozóanyagok leggyakoribb pórusátmérőjét a póruseloszlás vizsgálatakor kapott adatokból határoztuk meg. A póruseloszlást nagynyomású poroziméter felhasználásával határoztuk meg.

Az 1.1.—4.2. minta jellemző adatait az 1, táblázatban soroljuk fel. Az 1. táblázatban felsorolt rövidítések jelentése a következő:

D:	leggyakoribb pórusátmérő, Á,
C_E:	enzimfelvétel, mg enzim/g hordozó-
	anyag,
U:	aktivitás, egység/g minta,

(=U/C_E):

U_s specifikus aktivitás, cgység/mg enzim,

U_SF: szabad állapotban észlelhető specifikus aktivitás, egység/mg enzim, _n, flOOxLU

U_re): relatív aktivitás i = -I.

I ^USF I

1.táblázat

Rögzített amiloglükozidáz

Minta száma		Aktivitási adatok
D	c_E	u	u.		U_SF
1.1.	1400	16,5	. 98,4	5,96	51	11,75
1.2.		9.0	100,5	11,16	95
2.1.	340	30,8	208,8	6,77	58
2.2.		17,4	203,9	11,71	100
3.1.	180	26,2	150,0	5,72	49
3.2.		12,7	149,5	11,77	100
4.1.	340	29,8	199,7	6,70	57
4.2.		17,9	209,4	11,70	100

10. példa

Az 5—8. példában ismertetett 5.1., 5.2., 6.1., 6.2., 7.1., 7.2., 8.1. és 8.2. sz. minta, valamint a hordozóanyagon rögzített szabad enzim (glükcz-izomcráz) aktivitását Takasaki-módszenel határoztuk meg [lásd Y. Takasaki: Agr. Bioi. Chem. 30 (12), 1247—1253 (1966) és Z. Dische és E. Borenfreund: J. Bioi. Chem. 192, 583 (1951)]. Egy aktivitási egységnek (U) azt az enzimmennyiséget tekintjük, amely az inkubálás körülményei között 1 mgfruktózt képez.

Az inkubálást a következő körülmények között végeztük: hőmérséklet: 65 C³; reakcióidő: 1 óra; szubsztrátum: 0,1 mól glükózxH₂O-t (Merek 8342) és 0,0004 mól niagnéziumszulfátot tartalmazó 0,05 mólos foszfátpuffer-oldat (pH—8,0).

A hordozóra felvitt enzimkészítményeket a 9. példában ismertetett módon, standard körülmények között keverős reaktorban szuszpendáltuk. A készítmények fehérje-tartalmát a szén- és nitrogénelemzés átlagértékei alapján számítottuk ki.

A vizsgálatok eredményeit a 2. táblázatban közöljük. A 2. táblázatban feltüntetett rövidítések jelentése azonos a 9. példában közöltekkel.

2. táblázat

Rögzített glükóz-izemeráz

Minta száma	Aktivitási adatok
D	^CE	u	U_s	u_rc]	u_SF
5.1.	1400	4,8	115,4	24,0	41	58,9
5.2.		2,0	117,3	58,7	99
6.1.	340	22,0	558,5	25,4	43
6.2.		10,2	556,1	54,5	93
7.1.	180	11,2	291,0	26,0	44
7.2.		5,1	292,3	57,3	97
8.1.	340	21,3	543,2	25,5	43
8.2.		9,8	544,0	55,5	94

A felsorolt adatok alapján a következőket állapíthatjuk meg:

1. A vizsgált minták aktivitása (U) maximumgörbe szerint változik; a maximum helyzete a hordozóanyag leggyakoribb pórusátmérőjétöl függ.

2. A minták specifikus aktivitása (IJJ az enzimfelvételtől függően változik, és meghatározott C_E enzimkoncentráció esetén eléri az enzim szabad állapotban mért aktivitását (U_SF), azaz ebben az esetben U_rel értéke 100%. E meghatározott crizimkoncentráció túllépésekor a minták specifikus aktivitása csökken, mimellett U_s és C_h szorzata állandó érték marad.

3. A hordozó által felvett enzimmennyiség a leggyakoribb pórusátmérő függvényében változik. Az enzimből és hordozóanyagból kialakított rendszer maximális aktivitása a lehető legkisebb enzimkoncentráció alkalmazásakor jelentkezik ; ekkor az optimálisnak bizonyult, 340 Á leggyakoribb pórusátmérővel rendelkező 2. hordozó grammonként 17,4 mg amiloglükozidázt (2.2. minta), illetve grammonként 10,2 mg glükóz-izomerázt (6.2. minta) vesz fel.

4. A vizsgált minták cnzimfeivétclc és aktivitása független az alkalmazott kapcsolószer minőségétől.

Az enzimes műveletek gazdaságosságát jelentős mértékben befolyásolja a felhasznált enzim költsége, amely rendszerint eleve nagy, és a kívánt tisztasági fok növelésével igen nagy mértékben fokozódik. A találmány szerinti eljárás elsőként nyújt lehetőséget arra, hogy költséges enzimeket ipari méretekben is gazdaságosan alkalmazhassunk, a találmány szerinti eljárással ugyanis a maximális aktivitás eléréséhez szükséges enzimmennyiseget optimálj·'' értékre állíthatjuk be.

Claims

1. Eljárás vízben oldhatatlan enzimkészítmények előállítására, valamely enzim kovalens megkötésére alkalmas funkciós csoportokat tartalmazó szervetlen hordozóanyag és valamely enzim-oldat érintkezésbe hozása, az enzimnek a hordozón önmagában ismert eljárással történő megkötése és a kapott enzimkészítmények elkülönítése útján azzal jellemezve, hogy a leggyakoribb pórusátmérőben egymástól különböző hordozókat az enzim-koncentrációban különböző enzim-oldatokkal hozunk érintkezésbe, az enzimet a hordozón megkötjük, az enzimkészítményeket izoláljuk, aktivitásukat meghatározzuk, és a felhasznált különböző hordozók közül azzal a leggyakoribb pórusátmérővel rendelkező hordozót választjuk ki, mely a rajta megkötött enzimmennyiségtöl függetlenül a legnagyobb aklivitású készítményt biztosítja, majd a kiválasztott hordozóanyagot enzimtartalmukban különböző enz’m-oldatokkal hozzuk érintkezésbe, az enzimet a hordozón megkötjük, az enzimkészítményeket izoláljuk, aktivitásukat és fajlagos aktivitásukat meghatározzuk és a felhasznált különböző enzim-oldatok közül azt az enzim-oldatot választjuk ki, mely a legnagyobb aktivitású és az enzim szabad állapotban mért fajlagos aktivitásához közel eső vagy azzal azonos fajlagos aktivitású készítményt biztosítja.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy hordozóanyagként nátriumoxidban kifejezve 0,1—0,5 súly% alkálitartalmú, szárított, majd 400 850 C^;-os, előnyösen 570- 750 C°-os

II vízgőztartalmú levegőáramban 5—10 órán át hevített szilíciumdioxid-gélt használunk fel.

3. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a gélt vízgőzzel telített levegőben 180— 200C°-on szárítjuk.

4. A 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a gélt 40—80% relatív nedvességtartalmú levegöáramban hevítjük.

5. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy enzimként amiloglükozidázt használunk fel.

6. Az 5. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy szabad állapotban 10 — 15 egység/mg specifikus aktivitással rendelkező amiloglü kozidázt használunk fel, és a hordozóanyagot 1 g hordozóanyagra vonatkoztatva 25—75 mg, előnyösen 50 mg amiloglükozidázt tartalmazó oldattal hozzuk érintkezésbe.

5

7. Az 1—4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy enzimként glükóz-izomerázt használunk fel.

8. A 7. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy szabad állapotban 50—70 egy10 ség/mg specifikus aktivitással rendelkező glükóz-izomcrázt használunk fel, és a hordozóanyagot 1 g hordozóanyagra vonatkoztatva 20—50 mg, előnyösen 25 mg glükóz-izomerázt tartalmazó oldattal hozzuk érintkezésbe.