JP2688596B2 - 酵素固定化カラム用充填剤 - Google Patents
酵素固定化カラム用充填剤Info
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- JP2688596B2 JP2688596B2 JP63195678A JP19567888A JP2688596B2 JP 2688596 B2 JP2688596 B2 JP 2688596B2 JP 63195678 A JP63195678 A JP 63195678A JP 19567888 A JP19567888 A JP 19567888A JP 2688596 B2 JP2688596 B2 JP 2688596B2
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- Japan
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- enzyme
- column
- silica gel
- packing material
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- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、物理的吸着法によって酵素を固定化させた
カラム用充填剤に関する。
カラム用充填剤に関する。
（従来の技術） 不活性の担体に酵素を固定化させた既存の方法とし
て、共有結合法，イオン結合法，物理的吸着法，生化学
的親和力を利用した方法などがある。また、不活性の担
体として、セルロース，アガロース，チキン，コラーゲ
ン，アミノ酸ポリマー，ポリスチレン，エチレン−マレ
イン酸コポリマー，ポリアクリルアミド，ポリビニルア
ルコール，ナイロン,4,6−ジクロロ−ｓ−トリアジニル
イオン交換体，イオン交換樹脂，ガラスビーズ，ニッケ
ルシリカアルミナ，ジルコニア，セラミック，砂（アル
キルアミノ化），カーボン，活性炭，アルミナ，モレキ
ュラーシーブ，チタニア，ステンレススチール，リン酸
カルシウムゲル，フェノキシアセチル化物，タンニン，
シリコンゴム，アンバーライト，ジアイオン，セファデ
ックスなどがある。
て、共有結合法，イオン結合法，物理的吸着法，生化学
的親和力を利用した方法などがある。また、不活性の担
体として、セルロース，アガロース，チキン，コラーゲ
ン，アミノ酸ポリマー，ポリスチレン，エチレン−マレ
イン酸コポリマー，ポリアクリルアミド，ポリビニルア
ルコール，ナイロン,4,6−ジクロロ−ｓ−トリアジニル
イオン交換体，イオン交換樹脂，ガラスビーズ，ニッケ
ルシリカアルミナ，ジルコニア，セラミック，砂（アル
キルアミノ化），カーボン，活性炭，アルミナ，モレキ
ュラーシーブ，チタニア，ステンレススチール，リン酸
カルシウムゲル，フェノキシアセチル化物，タンニン，
シリコンゴム，アンバーライト，ジアイオン，セファデ
ックスなどがある。
（発明が解決しようとする課題） 従来の酵素固定化方法において、共有結合法は、調製
が困難で酵素の性質が変化する恐れがあるという欠点を
有する。生化学的親和力を利用した特異的結合法は、共
有結合法と同様に調製し困難であり、工業的規模の利用
を関しても両方法は調製が困難なために汎用性に乏し
く、再利用の際に担体の再生が困難である。また、物理
的吸着法は、一般に担体と酵素の結合が弱く、温度や共
存物質の濃度などの影響によって酵素が容易に脱離しや
すく、工業的規模の利用に関しても同様の欠点が残存す
る。従って、イオン結合法は、反応中の緩衝液の種類,p
Hイオン強度，温度などが固定化の効率や酵素の脱離に
大きく影響するけれども、現状では最も広範囲に工業的
規模の利用が行われている。
が困難で酵素の性質が変化する恐れがあるという欠点を
有する。生化学的親和力を利用した特異的結合法は、共
有結合法と同様に調製し困難であり、工業的規模の利用
を関しても両方法は調製が困難なために汎用性に乏し
く、再利用の際に担体の再生が困難である。また、物理
的吸着法は、一般に担体と酵素の結合が弱く、温度や共
存物質の濃度などの影響によって酵素が容易に脱離しや
すく、工業的規模の利用に関しても同様の欠点が残存す
る。従って、イオン結合法は、反応中の緩衝液の種類,p
Hイオン強度，温度などが固定化の効率や酵素の脱離に
大きく影響するけれども、現状では最も広範囲に工業的
規模の利用が行われている。
本発明は、イオン結合法を含む従来の酵素固定化方法
における調製の困難さ及び再生の困難さを改善し、更に
物理的吸着法の欠点である酵素の脱離しやすさも防い
で、工業的規模の利用が可能であるカラム用充電剤を提
供することを目的としている。
における調製の困難さ及び再生の困難さを改善し、更に
物理的吸着法の欠点である酵素の脱離しやすさも防い
で、工業的規模の利用が可能であるカラム用充電剤を提
供することを目的としている。
（課題を解決するための手段） 上記目的を達成するために、本発明に係るカラム用充
填剤では、疎水的な性質を有する官能基でシリカゲルの
表面を修飾した化学結合型シリカゲルを不溶性担体とし
て用い、該シリカゲルが蛋白質つまり酵素を容易に吸着
する性質を利用して、物理的吸着によって酵素を固定化
させる。
填剤では、疎水的な性質を有する官能基でシリカゲルの
表面を修飾した化学結合型シリカゲルを不溶性担体とし
て用い、該シリカゲルが蛋白質つまり酵素を容易に吸着
する性質を利用して、物理的吸着によって酵素を固定化
させる。
本発明において不溶化担体として用いる化学結合型シ
リカゲルは、オクタデシル基（C18）を化学的に結合さ
せて製造する。シリカゲル表面を修飾するこれらの官能
基は、疎水的な性質を有し、酵素つまり蛋白質の疎水部
分との間に相互作用を生じて、酵素を吸着するものと推
定できる。また、用いるシリカゲルは粒径が１〜10000
μm,細孔径が０〜2000Å以下、形状が破砕状又は球形で
あり、その粒径はカラムのサイズに応じて定め、その細
孔径は400Å以下のものが機械的強度の点から好まし
く、且つ化学結合型シリカゲルは数種類を混合して使用
してもよい。
リカゲルは、オクタデシル基（C18）を化学的に結合さ
せて製造する。シリカゲル表面を修飾するこれらの官能
基は、疎水的な性質を有し、酵素つまり蛋白質の疎水部
分との間に相互作用を生じて、酵素を吸着するものと推
定できる。また、用いるシリカゲルは粒径が１〜10000
μm,細孔径が０〜2000Å以下、形状が破砕状又は球形で
あり、その粒径はカラムのサイズに応じて定め、その細
孔径は400Å以下のものが機械的強度の点から好まし
く、且つ化学結合型シリカゲルは数種類を混合して使用
してもよい。
酵素を不溶化担体に固定化させるには、酵素を水系溶
媒に溶かし、これを担体に充填したカラムに流し込めば
よい。反応に用いる溶媒としては、水系又は有機系溶媒
のいずれも可能である。このカラムは、一般に内径が１
〜4000mm、長さが10〜30000mmである。
媒に溶かし、これを担体に充填したカラムに流し込めば
よい。反応に用いる溶媒としては、水系又は有機系溶媒
のいずれも可能である。このカラムは、一般に内径が１
〜4000mm、長さが10〜30000mmである。
前記カラムの再生方法としては、酵素つまり蛋白質と
担体の間の疎水的相互作用を打ち消すような有機系溶媒
を該カラムに充填することで容易に行える。次に、この
有機系溶媒を洗い流してカラム内を水系溶媒で充填すれ
ば、次の酵素固定化に再使用できる。
担体の間の疎水的相互作用を打ち消すような有機系溶媒
を該カラムに充填することで容易に行える。次に、この
有機系溶媒を洗い流してカラム内を水系溶媒で充填すれ
ば、次の酵素固定化に再使用できる。
本発明において使用可能な酵素は、加水分解酵素（例
えばα−アミラーゼ，インベルターゼ，トリプシン，リ
パーゼ）、酸化還元酵素（例えばグルコースオキシダー
ゼ，アルコールデヒドロゲナーゼ）、転移酵素（例えば
ヘキソキナーゼ,mRNAポリメラーゼ）、リアーゼ（例え
ばフマラーゼ，アルドウーゼ）、イソメラーゼ（例えば
グルコースイソメラーゼ,UDPグルコースエピメラー
ゼ）、リガーゼ（例えばアセチルCoAシンテターゼ，グ
ルタミンシンテターゼ）などである。
えばα−アミラーゼ，インベルターゼ，トリプシン，リ
パーゼ）、酸化還元酵素（例えばグルコースオキシダー
ゼ，アルコールデヒドロゲナーゼ）、転移酵素（例えば
ヘキソキナーゼ,mRNAポリメラーゼ）、リアーゼ（例え
ばフマラーゼ，アルドウーゼ）、イソメラーゼ（例えば
グルコースイソメラーゼ,UDPグルコースエピメラー
ゼ）、リガーゼ（例えばアセチルCoAシンテターゼ，グ
ルタミンシンテターゼ）などである。
（作用） 本発明のカラム用充填剤である酵素固定化カラムに
は、一般に市販の基質溶液を連続的に通液して反応させ
る。この反応の進行は、第１図又は第２図に示すように
高速液体クロマトグラフィー（HPLC）による分析クロマ
トグラムから容易に確認できる。また、本発明のカラム
用充填剤は、例えば第３図に示すように基質を30日間通
液し続けてもグルコースの生成量が殆ど変わらないこと
から、耐久性についても問題がない。
は、一般に市販の基質溶液を連続的に通液して反応させ
る。この反応の進行は、第１図又は第２図に示すように
高速液体クロマトグラフィー（HPLC）による分析クロマ
トグラムから容易に確認できる。また、本発明のカラム
用充填剤は、例えば第３図に示すように基質を30日間通
液し続けてもグルコースの生成量が殆ど変わらないこと
から、耐久性についても問題がない。
（実施例） 本発明を実施例に基づいて説明するが、本発明は実施
例に限定されるものではない。
例に限定されるものではない。
実施例１ 用いる酵素はα−アミラーゼであり、該酵素はBacill
us Licheniformis由来であり、アミロースよりグルコー
スが５個重合したマルトペンタオース（G5）を比較的多
く生成する。不溶性担体として、シリカゲル表面にオク
タデシル基を化学結合させた化学結合型シリカゲルを用
い、該シリカゲルの粒径は50μｍ、細孔径は120Å、形
状は球形である。このシリカゲルを充填するカラムのサ
イズは、内径が6mm、長さが300mmである。
us Licheniformis由来であり、アミロースよりグルコー
スが５個重合したマルトペンタオース（G5）を比較的多
く生成する。不溶性担体として、シリカゲル表面にオク
タデシル基を化学結合させた化学結合型シリカゲルを用
い、該シリカゲルの粒径は50μｍ、細孔径は120Å、形
状は球形である。このシリカゲルを充填するカラムのサ
イズは、内径が6mm、長さが300mmである。
市販のα−アミラーゼ液を蒸留水に懸濁し、不溶物を
過によって除去した液をHPLC用ポンプによって前記
のカラムに通液させ、これによってα−アミラーゼを化
学結合型シリカゲルに固定化させる。通液時のポンプ流
速は2ml/分で30分間通液を行い、更に未吸着のα−アミ
ラーゼを洗い流すために蒸留水を同じ流速で60分間通液
して、固定化を完了する。
過によって除去した液をHPLC用ポンプによって前記
のカラムに通液させ、これによってα−アミラーゼを化
学結合型シリカゲルに固定化させる。通液時のポンプ流
速は2ml/分で30分間通液を行い、更に未吸着のα−アミ
ラーゼを洗い流すために蒸留水を同じ流速で60分間通液
して、固定化を完了する。
反応に用いた基質は、マルトヘキサオース（G6）以上
の糖が比較的高い割合で含有されているオリゴ糖シロッ
プであり、このシロップを蒸留水で10倍に希釈した液を
反応の基質として用いる。このときの濃度は４％（W/
V）である。この基質溶液をHPLC用ポンプで連続的に通
液し、このときのポンプ流速はHPLC装置の最小単位であ
る0.1ml/分である。反応は室温で行い、反応の確認は、
第１図に示すようにHPLCによる分析で行う。第１図
（ａ）は、この基質の分析クロマトグラムであり、グリ
コースの重合度６以上の糖が存在している。一方、第１
図（ｂ）は、この基質をα−アミラーゼ固定化カラムに
通液した後の反応液の分析クロマトグラムであり、重合
度６以上の糖は殆ど検出されていない。この結果、第１
図（ａ）の基質の分析クロマトグラムとの差異が明確で
あり、カラム内において反応が進行していることが証明
できる。
の糖が比較的高い割合で含有されているオリゴ糖シロッ
プであり、このシロップを蒸留水で10倍に希釈した液を
反応の基質として用いる。このときの濃度は４％（W/
V）である。この基質溶液をHPLC用ポンプで連続的に通
液し、このときのポンプ流速はHPLC装置の最小単位であ
る0.1ml/分である。反応は室温で行い、反応の確認は、
第１図に示すようにHPLCによる分析で行う。第１図
（ａ）は、この基質の分析クロマトグラムであり、グリ
コースの重合度６以上の糖が存在している。一方、第１
図（ｂ）は、この基質をα−アミラーゼ固定化カラムに
通液した後の反応液の分析クロマトグラムであり、重合
度６以上の糖は殆ど検出されていない。この結果、第１
図（ａ）の基質の分析クロマトグラムとの差異が明確で
あり、カラム内において反応が進行していることが証明
できる。
実施例２ 用いる酵素はインベルターゼであり、該酵素は酵母に
由来し、シュクロースよりグルコースとフルクトースを
生成する。不溶性担体として、シリカゲル表面にオクタ
デシル基を化学結合させた化学結合型シリカゲルを用
い、該シリカゲルの粒径は５μｍ、細孔径は120Å、形
状は球形である。このシリカゲルを充填するカラムのサ
イズは、内径が6mm、長さが300mmである。
由来し、シュクロースよりグルコースとフルクトースを
生成する。不溶性担体として、シリカゲル表面にオクタ
デシル基を化学結合させた化学結合型シリカゲルを用
い、該シリカゲルの粒径は５μｍ、細孔径は120Å、形
状は球形である。このシリカゲルを充填するカラムのサ
イズは、内径が6mm、長さが300mmである。
市販のインベルターゼを蒸留水に懸濁し、不溶物を
過によって除去した液をHPLC用ポンプによって前記の
カラムに通液させ、これによってインベルターゼを化学
結合型シリカゲルに固定化させる。通液時のポンプ流速
は2ml/分で、30分間通液を行い、更に未吸着のインベル
ターゼを洗い流すための蒸留水を同じ流速で60分間通液
して、固定化を完了する。
過によって除去した液をHPLC用ポンプによって前記の
カラムに通液させ、これによってインベルターゼを化学
結合型シリカゲルに固定化させる。通液時のポンプ流速
は2ml/分で、30分間通液を行い、更に未吸着のインベル
ターゼを洗い流すための蒸留水を同じ流速で60分間通液
して、固定化を完了する。
反応に用いた基質には、試薬用として市販されている
シュクロースを用い、このシュクロースをpH4.5に調製
したリン酸塩緩衝液に溶かす。このときの濃度は５％
（W/V）である。この基質溶液をHPLC用ポンプで流速0.1
ml/分で連続的に通液する。反応は室温で行い、反応の
確認は、第２図に示すようにHPLCによる分析を行う。第
２図（ａ）は、この基質の分析クロマトグラムであり、
基質であるシュクロース（Ｓ）、該シュクロースによる
生成物であるグルコース（Ｇ）とフルクトース（Ｆ）の
標準品の分析クロマトグラムである。一方、第２図
（ｂ）は、この基質をインベルダーゼ固定化カラムに通
液した後の反応液の分析クロマトグラムであり、シュク
ロースの分解物であるグルコースとフルクトースだけが
検出され、シュクロースは殆ど検出されていない。この
結果、第２図（ａ）の基質の分析クロマトグラムとの差
異が明確であり、カラム内において反応が進行している
ことが証明できる。
シュクロースを用い、このシュクロースをpH4.5に調製
したリン酸塩緩衝液に溶かす。このときの濃度は５％
（W/V）である。この基質溶液をHPLC用ポンプで流速0.1
ml/分で連続的に通液する。反応は室温で行い、反応の
確認は、第２図に示すようにHPLCによる分析を行う。第
２図（ａ）は、この基質の分析クロマトグラムであり、
基質であるシュクロース（Ｓ）、該シュクロースによる
生成物であるグルコース（Ｇ）とフルクトース（Ｆ）の
標準品の分析クロマトグラムである。一方、第２図
（ｂ）は、この基質をインベルダーゼ固定化カラムに通
液した後の反応液の分析クロマトグラムであり、シュク
ロースの分解物であるグルコースとフルクトースだけが
検出され、シュクロースは殆ど検出されていない。この
結果、第２図（ａ）の基質の分析クロマトグラムとの差
異が明確であり、カラム内において反応が進行している
ことが証明できる。
本発明に係るカラム用充填剤の耐久生を判定するため
に、インベルターゼを固定化させた前記のカラムを用い
る。検査方法は、上記と同様に基質を30日間通液し続け
て、固定化させたインベルターゼの活性の安定性を調べ
る。このために、反応液を経時的にHPLCで分析し、反応
生成物の量、特にこの場合はグルコースの生成量の変化
によって耐久性を求める。この結果を第３図に示し、第
３図ではグルコースの生成量をHPLCによる分析で表示さ
れるピークの高さで示す。この結果から、30日目の反応
液においてもグルコースの生成量に顕著な差異が認めら
れないことから、耐久性は問題なしと判断できる。
に、インベルターゼを固定化させた前記のカラムを用い
る。検査方法は、上記と同様に基質を30日間通液し続け
て、固定化させたインベルターゼの活性の安定性を調べ
る。このために、反応液を経時的にHPLCで分析し、反応
生成物の量、特にこの場合はグルコースの生成量の変化
によって耐久性を求める。この結果を第３図に示し、第
３図ではグルコースの生成量をHPLCによる分析で表示さ
れるピークの高さで示す。この結果から、30日目の反応
液においてもグルコースの生成量に顕著な差異が認めら
れないことから、耐久性は問題なしと判断できる。
（発明の効果） 本発明に係るカラム用充填剤は、化学結合型シリカゲ
ルを不溶性担体として物理的吸着で酵素を固定化させて
おり、これまで実施された例が存在しない。本発明のカ
ラム用充填剤は、調製がきわめて容易であり、酵素固定
化に要するコストが低くて経済的に有利である。また、
固定化させた酵素の耐久性も問題なく、工業的利用にお
ける汎用性も十分優れている。
ルを不溶性担体として物理的吸着で酵素を固定化させて
おり、これまで実施された例が存在しない。本発明のカ
ラム用充填剤は、調製がきわめて容易であり、酵素固定
化に要するコストが低くて経済的に有利である。また、
固定化させた酵素の耐久性も問題なく、工業的利用にお
ける汎用性も十分優れている。
第１図（ａ）はα−アミラーゼの反応に用いる基質の分
析クロマトグラム、第１図（ｂ）は第１図（ａ）の基質
をα−アミラーゼ固定化カラムに通液した後の反応液の
分析クロマトグラム、第２図（ａ）はインベルターゼの
反応に用いる基質の分析クロマトグラム、第２図（ｂ）
は第２図（ａ）の基質をインベルターゼ固定化カラムに
通液した後の反応液の分析クロマトグラム、第３図はHP
LCによる分析で表示されるピークの高さで示すグルコー
スの生成量を表わすグラフである。
析クロマトグラム、第１図（ｂ）は第１図（ａ）の基質
をα−アミラーゼ固定化カラムに通液した後の反応液の
分析クロマトグラム、第２図（ａ）はインベルターゼの
反応に用いる基質の分析クロマトグラム、第２図（ｂ）
は第２図（ａ）の基質をインベルターゼ固定化カラムに
通液した後の反応液の分析クロマトグラム、第３図はHP
LCによる分析で表示されるピークの高さで示すグルコー
スの生成量を表わすグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭63−30311（ＪＰ，Ａ) 特開 昭50−145582（ＪＰ，Ａ) 特公 昭57−4319（ＪＰ，Ｂ２)
Claims (4)
- 【請求項１】疎水的な性質を有するオクタデシル基でシ
リカゲルの表面を修飾した化学結合型シリカゲルを不溶
性担体として用い、該シリカゲルは粒径が１〜10000μ
m,細孔径が０〜2000Å以下、形状が破砕状又は球形であ
り、この化学結合型シリカゲルをそのままカラムに充填
し、ついで該カラムの中に水系溶媒に溶かした酵素を所
定時間流し込み、この通液だけで酵素を物理的吸着によ
って化学結合型シリカゲルに固定化させて調製する酵素
固定化カラム用充填剤。 - 【請求項２】未吸着の酵素を洗い流すために、蒸留水を
カラムに所定時間通液して酵素の固定化を完了させる請
求項１記載のカラム用充填剤。 - 【請求項３】物理的吸着させる酵素として、加水分解酵
素、酸化還元酵素、転移酵素、リアーゼ、イソメラーゼ
又はリガーゼを用いる請求項１記載のカラム用充填剤。 - 【請求項４】オクタデシル基でシリカゲルの表面を修飾
した化学結合型シリカゲルをそのままカラムに充填し、
ついで該カラムの中に水系溶媒に溶かした酵素を流し込
んで調製した充填剤であって、このカラム内の充填剤を
再生するには、酵素と担体の間の疎水的相互作用を打ち
消すような有機系溶媒を所定時間充填し、ついでこの有
機系溶媒を洗い流してから水系溶媒をカラム内に所定時
間充填する酵素固定化カラム用充填剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63195678A JP2688596B2 (ja) | 1988-08-05 | 1988-08-05 | 酵素固定化カラム用充填剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63195678A JP2688596B2 (ja) | 1988-08-05 | 1988-08-05 | 酵素固定化カラム用充填剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0246282A JPH0246282A (ja) | 1990-02-15 |
| JP2688596B2 true JP2688596B2 (ja) | 1997-12-10 |
Family
ID=16345182
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63195678A Expired - Lifetime JP2688596B2 (ja) | 1988-08-05 | 1988-08-05 | 酵素固定化カラム用充填剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2688596B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL138990A0 (en) * | 1999-02-12 | 2001-11-25 | Biostream Inc | Matrices for drug delivery and methods for making and using the same |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2267992A1 (ja) * | 1974-04-19 | 1975-11-14 | Rhone Poulenc Ind | |
| JPS6020091B2 (ja) * | 1980-06-09 | 1985-05-20 | 新日本製鐵株式会社 | 低温加熱鍛接造管法 |
| IL78678A0 (en) * | 1986-05-04 | 1986-08-31 | Yeda Res & Dev | Substituted silica |
-
1988
- 1988-08-05 JP JP63195678A patent/JP2688596B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0246282A (ja) | 1990-02-15 |
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