ES2398709T5 - Mutaciones en EGFR y KRAS para predecir la respuesta de un paciente al tratamiento con inhibidores de EGFR - Google Patents

Description

DESCRIPCION

Mutaciones en EGFR y KRAS para predecir la respuesta de un paciente al tratamiento con inhibidores de EGFR 5 CAMPO DE LA INVENCION

[0001] La presente invencion se refiere al diagnostico y al tratamiento del cancer y, en particular, a la deteccion de mutaciones de diagnostico y/o pronostico.

10 ANTECEDENTES DE LA INVENCION

[0002] El receptor del factor de crecimiento epidermico (EGFR) es un miembro de la familia de receptores de factores de crecimiento de tirosina-cinasa del tipo 1, que desempenan papeles crlticos en el crecimiento, la diferenciacion y la supervivencia celulares. Tlpicamente, la activacion de estos receptores tiene lugar por medio de

15 una union a ligandos especlficos, lo que resulta en una hetero u homodimerizacion entre miembros de la familia de receptores, con la subsiguiente autofosforilacion del dominio de tirosina-cinasa. Esta activacion desencadena una cascada de rutas de senalizacion intracelular implicadas en la proliferacion celular (la ruta de la cinasa de ras/raf/MAP) y en la supervivencia (la ruta de la cinasa de PI3/Akt). A algunos miembros de esta familia, incluidos EGFR y HER2, se les atribuye una participacion directa en la transformacion celular.

20

[0003] Algunos tumores malignos estan asociados con una expresion aberrante o excesiva de EGFR y/o una expresion excesiva de sus ligandos especlficos, p. ej., el factor de crecimiento transformante a (Gullick, Br Med Bull 1991, 47: 87 - 98; Modijtahedi y Dean, Int J Oncol 1994, 4: 277 - 96; Salomon y col., Crit Rev Oncol Hematol 1995, 19: 183 - 232). La expresion excesiva de EGFR se ha asociado con un pronostico adverso en algunos canceres

25 humanos, incluido NSCLC. En algunos casos, la expresion excesiva de EGFR en tumores se ha correlacionado a la vez con quimiorresistencia y un mal pronostico (Lei y col., Anticancer Res 1999, 19: 221 - 8; Veale y col., Br J Cancer 1993, 68: 162 - 5). Estas observaciones sugieren que los agentes que inhiben eficazmente la activacion del receptor EGFR y la subsiguiente senalizacion posterior pueden tener actividad cllnica en diversos canceres humanos, incluido NSCLC.

30

[0004] Tarceva™ (tambien conocida como erlotinib; OSI-774), una quinazolina, es un potente inhibidor selectivo de la tirosina-cinasa de EGFR, activo por via oral. Erlotinib inhibe la tirosina-cinasa del EGFR humano con una CI50 de 2 nM (0,786 mg/ml) en un ensayo enzimatico in vitro. Esta inhibicion es selectiva para la tirosina-cinasa de EGFR, resulta en una parada del ciclo celular en la fase G1 y es reversible. La administracion de erlotinib por via

35 oral a ratones ha demostrado una reduccion superior al 70 % de la autofosforilacion de EGFR en xenoinjertos humanos y se ha demostrado una notable inhibicion del crecimiento de los xenoinjertos HN5 y A431 en ratones sin pelo. Ademas de su actividad como agente unico en sistemas de ensayo in vivo, erlotinib se ha evaluado en combinacion con varios agentes quimioterapeuticos para determinar posibles interacciones. Una interaccion aditiva se ha observado entre erlotinib y paclitaxel, cisplatino, gemcitabina y doxorrubicina.

40

[0005] El cancer de pulmon es la causa principal de mortalidad relacionada con el cancer, tanto para hombres como mujeres en los Estados Unidos. En el ano 2000 se estimo que se diagnosticarlan 164.000 nuevos casos y que 157.000 pacientes morirlan a causa de esta enfermedad (Greenlee y col., CA Cancer J Clin 2001, 51: 15 - 36). Aproximadamente el 75 % de estos pacientes habrlan tenido histologlas no microclticas y la mayorla se presentarla

45 con los estadios inoperables IIIB o IV de la enfermedad. Para aquellos pacientes con una enfermedad mas limitada en el momento de la presentacion (estadios I - IIIA), es comun una recalda despues de un tratamiento quirurgico estandar con o sin quimio y/o radioterapia adyuvante o neoadyuvante. Estos resultados dan lugar a una supervivencia general en cinco anos en el cancer de pulmon no microcltico (NSCLC) de aproximadamente el 12 % y sirven para resaltar las necesidades medicas aun no satisfechas en esta enfermedad.

50

[0006] El compuesto de platino cisplatino fue el primer agente quimioterapeutico en mostrar un beneficio cllnico en el tratamiento del NSCLC avanzado localmente o metastasico. Ensayos cllnicos aleatorizados demostraron una mejora en las tasas de respuesta, en la calidad de vida y en la supervivencia, en comparacion con el mejor tratamiento de apoyo (Rapp y col. 1988). Sin embargo, la magnitud de esta mejora fue moderada, medida

55 en semanas. Por consiguiente, se han evaluado varios agentes quimioterapeuticos nuevos como agentes unicos y en combinacion con las sales de platino para el tratamiento de primera llnea. La conclusion de estos estudios es que la moderna quimioterapia de “doblete” parece alcanzar tasas de respuesta del 15 - 20 %, una mediana del tiempo hasta la progresion de la enfermedad de 3 - 4 meses y una mediana de la supervivencia de 7 - 8 meses. Las mejoras moderadas de la eficacia con tratamientos combinados con respecto a los resultados obtenidos con

cisplatino han establecido estos tratamientos como tratamientos de referenda para los pacientes con NSCLC avanzado y un estado general aceptable (Non-Small Cell Lung Cancer Cooperative Group, Br Med J 1995, 311: 899 - 909; American Society of Clinical Oncology, J Clin Oncol 1997, 15: 2996 - 3018; Breathnach y col., J Clin Oncol 2001, 19: 1734 - 42).

5

[0007] Pao W., y col. (KRAS mutations and primary resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or erlotinib. PLOS MEDICINE. vol. 2, n°. 1, enero de 2005 (2005 - 01), pagina e17) describen que mutaciones en KRAS estan asociadas con una falta de sensibilidad a gefinitib o erlotinib, mientras que mutaciones en EGFR estan asociadas con sensibilidad a dichas moleculas y proponen mejorar las decisiones sobre el tratamiento mediante la

10 determinacion del estado mutacional de ambos, EGFR y KRAS.

DESCRIPCION RESUMIDA DE LA INVENCION

[0008] La presente invencion proporciona un procedimiento para la identification de un paciente que no es 15 sensible al tratamiento con un inhibidor de EGFR en combination con un agente quimioterapeutico, tal como se

define en las reivindicaciones.

[0009] En este documento se describe un procedimiento para la identificacion de un tumor sensible al tratamiento en un sujeto humano que comprende la determinacion de la presencia de un gen EGFR mutado o una

20 protelna EGFR mutada en una muestra de dicho tumor, en que dicha mutation se localiza en los exones 18 - 21 de EGFR, segun lo cual, la presencia de un gen EGFR mutado o una protelna EGFR mutada indican que el tumor es sensible al tratamiento.

[00010] En este documento se describe un procedimiento para el tratamiento de un tumor en un mamlfero que 25 comprende la identificacion de la presencia de una mutacion en EGFR en dicho tumor y el tratamiento de dicho

mamlfero con un agente contra el cancer.

[00011] En este documento se describe un procedimiento para la identificacion de una mutacion en EGFR en una muestra que comprende la puesta en contacto de un acido nucleico de dicha muestra con una sonda que es

30 capaz de hibridar especlficamente con el acido nucleico que codifica una protelna EGFR mutada o un fragmento de este que incorpora una mutacion y la detection de la hibridacion.

[00012] En este documento se describen sondas de acido nucleico capaces de hibridar especlficamente con un acido nucleico que codifica una protelna EGFR mutada o un fragmento de este que incorpora una mutacion.

35

[00013] En este documento se describe un procedimiento para la deteccion de un gen EGFR mutado en una muestra que comprende la amplification del acido nucleico de dicha muestra correspondiente al dominio de cinasa de dicho gen EGFr o a un fragmento de este del que se sospecha que contiene una mutacion y la comparacion de la movilidad electroforetica del acido nucleico amplificado con la movilidad electroforetica del correspondiente gen

40 EGFR natural o fragmento de este.

[00014] En este documento se describe un procedimiento para la identificacion en un sujeto humano de un tumor sensible al tratamiento con un inhibidor de EGFR que comprende (i) la determinacion de la presencia de una protelna o un gen KRAS naturales en una muestra de dicho tumor, segun lo cual, la presencia de una protelna o un

45 gen KRAS naturales indica que el tumor es sensible al tratamiento con un inhibidor de EGFR o (ii) la determinacion de la presencia de una protelna o un gen KRAS mutados en una muestra de dicho tumor, segun lo cual, la ausencia de una protelna o un gen KRAS mutados indica que el tumor es sensible al tratamiento con un inhibidor de EGFR.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS 50

[00015]

La figura 1 ilustra la secuencia aminoacldica de EGFR1 natural (SEQ ID NO: 1), en la que la secuencia senal son los restos 1 - 24, el dominio extracelular incluye los restos 24 - 645, el dominio transmembrana incluye los restos 646 - 55 668 y el dominio citoplasmico incluye los restos 669 - 1210. La region del dominio de tirosina-cinasa son los restos 718 - 964 y el sitio de fosforilacion de treonina es el resto 678.

Las figuras 2a a 2d contienen la secuencia de ADNc (SEQ ID NO: 2) de EGFR natural, en la que el exon 18 corresponde a los nucleotidos 2308 - 2430, el exon 19 corresponde a los nucleotidos 2431 - 2529, el exon 20

corresponde a los nucleotidos 2530 - 2715 y el exon 21 corresponde a 2716 - 2871.

La figura 3 es una representacion grafica de las regiones extracelular (arriba) e intracelular (abajo) de EGFR.

5 La figura 4 es una curva de Kaplan-Meier que muestra el tiempo hasta la progresion en pacientes con tumores de NSCLC que expresan EGFR natural (llnea continua) y EGFR mutante (llnea discontinua).

La figura 5 es una curva de Kaplan-Meier que muestra la supervivencia de pacientes con tumores de NSCLC que expresan EGFR natural (llnea continua) y EGFR mutante (llnea discontinua).

10

La figura 6 es una autorradiografla que ilustra la inhibicion de la autofosforilacion de EGFR natural y EGFR mutante (L858R y de1746 - 752) con concentraciones variables de erlotinib en celulas COS7 transfectadas de manera transitoria.

15 La figura 7 es una grafica que muestra la inhibicion de la autofosforilacion de EGFR natural y EGFR mutante (L858R y del 1746 - 752) con concentraciones variables de erlotinib en celulas COS7 transfectadas de manera transitoria.

La figura 8 ilustra mutaciones en los exones 18 y 19 del gen EGFR y en las secuencias de protelna. Los cambios de aminoacidos y nucleotidos, as! como las inserciones se indican en letra negrita subrayada, mientras que las 20 deleciones se muestran como guiones ( - ).

La figura 9 ilustra mutaciones en los exones 20 y 21 del gen EGFR y en aminoacidos y nucleotidos, as! como las inserciones se indican en deleciones se muestran como guiones ( - ).

25

DESCRIPCION DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS 00016 00017 *

[00016] Es un descubrimiento de la presente descripcion que en el receptor del factor de crecimiento epidermico (EGFR) tienen lugar mutaciones asociadas con la tumorigenesis. Aunque se sabla previamente que una

30 actividad aberrante de EGFR estaba asociada con diversos canceres, era desconocido que existlan mutaciones en el dominio de cinasa de EGFR (KDR) causantes de una actividad de senalizacion aberrante asociada con algunos canceres. Sorprendentemente, los pacientes que padecen tumores con mutaciones en el KDR de EGFR tienen un mejor pronostico que aquellos con el EGFR natural. Las mutaciones en el KDR del gen EGFR pueden implicar reorganizaciones como inserciones y deleciones, as! como mutaciones puntuales.

35

[00017] Las muestras de aproximadamente 250 pacientes participates en un estudio cllnico de fase III, con doble enmascaramiento y aleatorizado, denominado Tribute, se secuenciaron para identificar mutaciones en los exones 18 - 21 de EGFR. El estudio Tribute, que incluyo 1.079 pacientes en aproximadamente 150 centros en los Estados Unidos con NSCLC confirmada histologicamente que no hablan recibido quimioterapia anteriormente,

40 comparo el tratamiento con erlotinib + quimioterapia (carboplatino/paclitaxel) con solamente quimioterapia. Los pacientes recibieron paclitaxel (200 mg/m2, en 3 horas por infusion i.v.) seguido de carboplatino (ABC = 6 mg/ml x minuto por infusion durante 15 - 30 minutos segun la formula de Calvert) con o sin erlotinib (100 mg/dla por via oral, aumentados a 150 mg/dla para pacientes tolerantes). Las muestras de tumores de aproximadamente 250 pacientes, bloques o preparaciones sobre portaobjetos sin tenir incluidos en parafina y fijados con formalina, recogidas en el 45 estudio Tribute se enriquecieron en celulas tumorales mediante microdiseccion por captura con laser y a continuacion se extrajo el ADN. Los exones 18 - 21 se amplificaron por PCR anidada y las secuencias bidireccionales de cada producto de PCR se obtuvieron utilizando terminadores fluorescentes. Las mutaciones descubiertas en la secuenciacion se muestran en la tabla 1:

las secuencias de proteina. Los cambios de letra negrita subrayada, mientras que las

Mutacion en la protelna

Mutacion en el acido nucleico

G719A

2402G > C 18

G719C

2401G > T 18

G719S

2401G > A 18

E746-R748 del

2482 - 2490 del GGAATTAAGA (SEQ ID NO: 32) 19

E746-A750 del

2481 - 2495 del GGAATTAAGAGAAGC (SEQ ID NO: 33) 19

E746-R748 del

2482 - 2490 del GAATTAAGA 19

E749Q

2491G > C

A750P

2494G > C

L747-E749 del

2485 - 2493 del TTAAGAGAA 19

A750P

494G > C

L747S R748-P753 del

2486 - 2503 del TAAGAGAAGCAACATCTC (SEQ ID NO: 34) 19

L747-S752 del E746V

2485 - 2502 del TTAAGAGAAGCAACATCT 2483A > T (SEQ ID NO: 35) 19

L747-T751 del ins S

2486 - 2494 del TAAGAGAAGCAA (SEQ ID NO: 36) 19

S752-I759 del

2499 - 2522 del ATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAAT (SEQ ID NO: 37) 19

M766-A767 AI ins

2544 - 2545 ins GCCATA 20

S768-V769 SVA ins

2554 - 2555 ins CCAGCGTGG (2556C > T silenciosa) 20

L858R

2819T> G 21

G719C

2401G > T 18

S768I

2549G > T {2607G > A SNP silencioso} 20

G719C

2401G > T 18

V765M

2539G > A 20

S768I

2549G > T 20

A755V

2510C > T 19

L747S

2486T> C 19

E746K

2482G > A 19

P772-H773 V ins

2561 - 2562 ins GGT 20

L858P

2819T> C 21

L861Q

2576T> A 21

P772-H773 NS ins

2562 - 2563 ins AACTCC 20

H773Y

2563C > T

T790M

2615C > T 20

L858R

2819T> G 21

S784F

21

L858R

21

ins = insercion, del = delecion

5 [00018] La numeracion de los nucleotidos para las mutaciones se basa en la secuencia de referenda de las figuras 2a - 2d. 00019 00020

[00019] El resultado cllnico de los pacientes con tumores con mutaciones en EGFR y con EGFR natural se analizo de acuerdo con la respuesta (completa + parcial), el beneficio (respuesta + enfermedad estable) y la

10 progresion de la enfermedad. Las lesiones se evaluaron mediante los criterios de evaluacion de la respuesta en tumores solidos (RECIST), en los que “respuesta completa” (RC) se define como la desaparicion de todas las lesiones diana; “respuesta parcial” (RP) se define como una disminucion de al menos el 30 % en la suma de los diametros mayores de las lesiones diana, tomando como referencia la suma inicial de los diametros mayores; “progresion de la enfermedad” (PE) se define como un aumento de al menos el 20 % en la suma de los diametros 15 mayores de las lesiones diana, tomando como referencia la menor suma de los diametros mayores registrada desde el inicio del tratamiento o la aparicion de una o mas lesiones nuevas; y “enfermedad estable” (EE) se define como ni una disminucion suficiente para considerarse como respuesta parcial ni un aumento suficiente para considerarse como progresion de la enfermedad, tomando como referencia la menor suma de los diametros mayores desde el inicio del tratamiento.

20

[00020] Los resultados del analisis se resumen en la tabla 2.

I EGFR mutante n = 24 | EGFR natural n = 181

Tasa de respuesta/beneficio

Respuesta (RC + RP)

11 46 % 46 25 %

Beneficio (RC + RP + EE)

18 75 % 105 58 %

EE

7 29 % 59 33 %

PE

6 25 % 76 42 %

Supervivencia (dlas)

Mediana

435 309

Intervalo

133 - 687 9 - 643

RC = respuesta completa; RP = respuesta parcial; EE = enfermedad estable; PE = progresion de la enfermedad

5 [00021] El analisis del resultado cllnico revelo que los pacientes con tumores que expresan una mutacion en los exones 18 - 21 de EGFR tienen mejor pronostico que aquellos con tumores que expresan EGFR natural. Los pacientes con EGFR mutante mostraron mayor tasa de respuesta, mayor tasa de beneficio y mayor supervivencia al ser tratados con quimioterapia o con quimioterapia mas erlotinib. Estos resultados son utiles para predecir el resultado, de modo que los pacientes cuyos tumores presentan mutaciones en alguno de los exones 18 - 21 de 10 EGFR o en todos ellos tienen un pronostico mas favorable que los pacientes cuyos tumores no presentan tales mutaciones.

[00022] Por consiguiente, la presente descripcion proporciona un procedimiento para la determinacion del pronostico de un paciente con un tumor que comprende la determinacion de la presencia o ausencia de una o mas 15 mutaciones en los exones 18 - 21 de EGFR (o en la secuencia aminoacldica correspondiente a los exones 18 - 21) en una muestra de dicho tumor, segun lo cual, la presencia de dichas una o mas mutaciones en EGFR indica un mejor pronostico en comparacion con la ausencia de dichas una o mas mutaciones en EGFR. Con “pronostico” se indica respuesta y/o beneficio y/o supervivencia. Con “mutaciones en EGFR” se indican una secuencia aminoacldica o de acido nucleico que difiere de la protelna o el acido nucleico de EGFR natural, respectivamente, encontrada en 20 un alelo (heterocigoto) o en ambos alelos (homocigoto) y que pueden ser somaticas o de la llnea germinal. En una realizacion concreta, dicha mutacion se encuentra en la region del dominio de cinasa (KDR) de EGFR. En otra realizacion concreta, la mutacion es una sustitucion, una delecion o una insercion de aminoacidos, segun se muestra en la tabla 1. En una realizacion, la mutacion aminoacldica es una o mas de las siguientes: G719A, E746K, L747S, E749Q, A750P, A755V, S768I, L858P, E746-R748 del, R748-P753 del, M766-A767 AI ins y S768-V769 SVA ins. En 25 otra realizacion concreta, la mutacion es una mutacion puntual, una delecion o una insercion en el acido nucleico segun se muestra en la tabla 1. En una realizacion, la mutacion en el acido nucleico es una o mas de las siguientes: 2402G > C; 2482G > A; 2486T > C; 2491G > C; 2494G > C; 2510C > T; 2549G > T; 2819T > C; 2482 - 2490 del; 2486 - 2503 del; 2544 - 2545 ins GCCATA; y 2554 - 2555 ins CCAGCGTGG. 30 * * * * 35 * * * * 40 * * * * 45

30 [00023] Los exones 18 - 21 del EGFR de la llnea celular tumoral H1975, que mostraba resistencia al

tratamiento con erlotinib, se secuenciaron y se encontro que incorporaban una mutacion T790M en combinacion con

una mutacion L858R. Por consiguiente, la presente descripcion proporciona ademas un procedimiento para

determinar el pronostico de un paciente con un tumor que comprende la determinacion de la presencia o ausencia

de la mutacion T790M en EGFR en una muestra de dicho tumor, segun lo cual, la presencia de dicha mutacion

35 T790M en EGFR indica un peor pronostico en comparacion con la ausencia de dicha mutacion T790M en EGFR.

Ademas, se proporciona un procedimiento para la identification de pacientes con un tumor menos sensible al

tratamiento con un inhibidor de EGFR como erlotinib o gefitinib, ya sea en combinacion con quimioterapia o no, que

comprende la determinacion de la presencia o ausencia de una mutacion T790M en EGFR en el tumor del paciente,

segun lo cual, la presencia de dicha mutacion indica que el paciente respondera menos a dicho tratamiento en

40 comparacion con un paciente con un tumor que no tiene dicha mutacion T790M en EGFR. Ademas, se proporciona

un procedimiento para la identificacion de un tumor resistente al tratamiento con un inhibidor de EGFR, como un

inhibidor de la union al dominio de cinasa (por ejemplo, erlotinib o gefitinib), ya sea en combinacion con

quimioterapia o no, que comprende la determinacion de la presencia o ausencia de una mutacion T790M en EGFR

en una muestra del tumor, segun lo cual, la presencia de dicha mutacion indica que el tumor es resistente a dicho

45 tratamiento. Se entiende que la determinacion de la mutacion se realiza en la protelna o en un acido nucleico (ADN genomico o ARNm) y se lleva a cabo mediante tecnicas como las que se describen en este documento. En una realizacion concreta, dicho inhibidor de EGFR compite con ATP en el dominio de cinasa de EGFR. En una realizacion concreta el inhibidor de EGFR es erlotinib.

[00024] Tambien se describe un procedimiento para el tratamiento de un paciente con un tumor que incorpora una protelna o gen EGFR con la mutacion T790M (o el tratamiento de un tumor que incorpora una protelna o gen EGFR con la mutacion T790M) que comprende la coadministracion a dicho paciente de (o la puesta en contacto de

5 dicho tumor con) un primer compuesto que se une a y/o inhibe la senalizacion de dicho EGFR con la mutacion T790M en combination con un segundo compuesto que se une a y/o inhibe la senalizacion de EGFR natural o un EGFR que incorpora una mutacion activadora. En una realization concreta, dicha mutacion activadora es una o mas de las descritas en la tabla 1 (distintas de T790M). En una realizacion concreta, dichos primero y segundo compuestos se administran secuencialmente o concomitantemente. En una realizacion concreta, dicho segundo 10 compuesto es erlotinib.

[00025] Tambien se describe un procedimiento para la identification de compuestos que inhiben la senalizacion de una protelna EGFR mutante que incorpora la mutacion T790M, que comprende la puesta en contacto de dicho EGFR mutante con un compuesto de prueba en presencia de un sustrato de fosforilacion y ATP y la detection de un

15 cambio en el grado de fosforilacion de dicho sustrato, segun lo cual, una reduction de la fosforilacion de dicho sustrato en comparacion con un control o en comparacion con la fosforilacion del sustrato en ausencia del compuesto de prueba indica que dicho compuesto de prueba es un inhibidor de la senalizacion del EGFR mutante. En una realizacion, dicho procedimiento se lleva a cabo in vitro en presencia de un ligando para dicho EGFR mutante, como EGF o TGF-a.

20

[00026] En una realizacion concreta, la actividad inhibidora de un compuesto de prueba puede determinarse in vitro por el grado de inhibition de la fosforilacion de tirosina en un sustrato exogeno (p. ej., Lys3-gastrina o copollmero al azar poliGluTyr (4: 1) (I. Posner y col., J Biol Chem 267 (29): 20638 - 47 (1992)) por la cinasa del receptor del factor de crecimiento epidermico por un compuesto de prueba en relation con un control. Un EGFR

25 humano con la mutacion T790M purificado soluble (96 ng) se preincuba en un tubo de microcentrlfuga con EGF (2 pg/ml) en un tampon de fosforilacion con vanadato (PBV: HEPES 50 mM, pH 7.4; NaCl 125 mM; MgCl2 24 mM; ortovanadato de sodio 100 pM), en un volumen total de 10 pl, durante 20 - 30 minutos a temperatura ambiente. El compuesto de prueba disuelto en dimetilsulfoxido (DMSO) se diluye en PBV y 10 pl se mezclan con la mezcla de EGFR mutante y EGF y se incuban durante 10 - 30 minutos a 30 °C. La reaction de fosforilacion se inicia por la 30 adicion de 20 pl de una mezcla de 33P-ATP y sustrato (Lys3-gastrina 120 pM (secuencia de aminoacidos en el codigo de una sola letra KKKGPWLEEEEEAYGWLDF - SEQ ID NO: 38); Hepes 50 mM, pH 7,4; ATP 40 pM; y-[33P]-ATP 2 pCi) a la mezcla de EGFR mutante y EGF y se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente. La reaccion se detiene por la adicion de 10 pl de disolucion de parada (EDTA 0,5 M, pH 8; ATP 2 mM) y 6 pl de HCl 2N. Los tubos se centrifugan a 14.000 rpm a 4 °C durante 10 minutos. Se pipetean 35 pl del sobrenadante de cada tubo sobre 35 clrculos de 2,5 cm de papel Whatman P81, que se lavan cuatro veces todos juntos en acido acetico al 5 %, con 1 l por lavado y despues se secan al aire. Esto resulta en la union del sustrato al papel con perdida de ATP libre en el lavado. El [33P] incorporado se mide por recuento de centelleo en llquido. La incorporation en ausencia de sustrato (p. ej., Lys3-gastrina) se sustrae de todos los valores como un valor de fondo y se calcula el porcentaje de inhibicion con respecto a los controles sin compuesto de prueba presente. Tales ensayos, llevados a cabo con una serie de 40 dosis de los compuestos de prueba, permiten la determination de un valor de CI50 aproximado para la inhibicion in vitro de la actividad cinasa de EGFR con la mutacion T790M. 00027 * *

[00027] Tambien se describe un procedimiento para la identificacion de un tumor sensible al tratamiento en un sujeto humano que comprende la determinacion de la presencia de un gen EGFR mutado o una protelna EGFR

45 mutada en una muestra de dicho tumor, en que dicha mutacion se localiza en los exones 18 - 21 de EGFR, segun lo cual, la presencia de un gen EGFR mutado o una protelna EGFR mutada indica que el tumor es sensible al tratamiento con un agente contra el cancer. En una realizacion concreta, el agente contra el cancer es un agente quimioterapeutico que puede ser citotoxico o citostatico. Los tumores incluyen neuroblastoma, carcinomas intestinales, como carcinoma de recto, carcinoma de colon, carcinoma de poliposis adenomatosa familiar y cancer 50 colorrectal hereditario no poliposo, carcinoma esofagico, carcinoma labial, carcinoma de laringe, carcinoma de hipofaringe, carcinoma lingual, carcinoma de glandulas salivales, carcinoma gastrico, adenocarcinoma, carcinoma

medular de tiroides, carcinoma papilar de tiroides, carcinoma renal, carcinoma del parenquima renal, carcinoma ovarico, carcinoma cervical, carcinoma del cuerpo uterino, carcinoma de endometrio, coriocarcinoma, carcinoma de pancreas, carcinoma de prostata, carcinoma testicular, carcinoma de mama, carcinoma urinario, melanoma, tumores 55 cerebrales como glioblastoma, astrocitoma, meningioma, meduloblastoma y tumores neuroectodermicos perifericos, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin, linfoma de Burkitt, leucemia linfatica aguda (LLA), leucemia linfatica cronica (LLC), leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia mieloide cronica (LMC), linfoma/leucemia de linfocitos T de adultos, carcinoma hepatocelular, carcinoma de la veslcula biliar, carcinoma bronquial, carcinoma de pulmon microcltico, carcinoma de pulmon no microcltico, mieloma multiple, basalioma, teratoma, retinoblastoma, melanoma

de coroides, seminoma, rabdomiosarcoma, craniofaringioma, osteosarcoma, condrosarcoma, miosarcoma, liposarcoma, fibrosarcoma, sarcoma de Ewing y plasmocitoma. Algunos tumores concretos incluyen los del cerebro, hlgado, rinon, vejiga, mama, gastricos, ovaricos, colorrectales, de prostata, pancreas, mama, pulmon, vulva, tiroides, colorrectales, de esofago, carcinomas hepaticos, sarcomas, glioblastomas, tumores de cuello y cabeza, leucemias y 5 tumores linfoides.

[00028] Algunos agentes quimioterapeuticos concretos incluyen, pero no se limitan a (i) antimetabolitos como citarabina, fludarabina, 5-fluoro-2'-desoxiuridina, gemcitabina, hidroxiurea o metotrexato; (ii) agentes de fragmentacion de ADN como bleomicina, (iii) agentes de entrecruzamiento de ADN como clorambucilo, cisplatino,

10 ciclofosfamida o mostaza nitrogenada; (iv) agentes intercalantes como adriamicina (doxorrubicina) o mitoxantrona; (v) inhibidores de la slntesis de protelnas como L-asparaginasa, cicloheximida, puromicina o toxina de la difteria; (vi) inhibidores de topoisomerasa I como camptotecina o topotecan; (vii) inhibidores de topoisomerasa II como etoposido (VP-16) o teniposido; (viii) agentes dirigidos a los microtubulos como colcemida, colchicina, paclitaxel, vinblastina o vincristina; (ix) inhibidores de cinasas como flavopiridol, estaurosporina, STI571 (CPG 57148B) o UCN-01 (715 hidroxiestaurosporina); (x) agentes miscelaneos en investigacion como tioplatino, PS 341, fenilbutirato; ET-18-OCH3 o inhibidores de farnesil-transferasa (L-739749, L-744832); polifenoles como quercetina, resveratrol, piceatanol, galato de epigalocatequina, teaflavinas, flavanoles, procianidinas, acido betullnico y derivados de estos; (xi) hormonas como glucocorticoides o fenretinida; (xii) antagonistas de hormonas como tamoxifeno, finasterida o antagonistas de LHRH. En una realizacion, el compuesto quimioterapeutico es uno o mas de entre gemcitabina, 20 cisplatino, doxorrubicina, daunorrubicina, paclitaxel, taxotera y mitomicina C. En una realizacion concreta, el compuesto quimioterapeutico es uno o mas de entre gemcitabina, cisplatino y paclitaxel. Segun la presente invention, el inhibidor de EGFR es una molecula pequena que compite con ATP como Tarceva™ (erlotinib, OSI Pharmaceuticals), Iressa™ (gefitinib, Astra-Zeneca), tirfostinas descritas por Dvir y col., J Cell Biol 113: 857 - 865 (1991); compuestos triclclicos de pirimidina descritos en la patente de los EE. UU. 5.679.683; el compuesto 6-(2,6- 25 diclorofenil)-2-(4-(2-dietilaminoetoxi)fenilamino)-8-metil-8H-pirido(2,3-d)pirimidin-7-ona (conocido como PD 166285) descrito en Panek y col., Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 283: 1433 - 1444 (1997).

[00029] Tambien se describe un procedimiento para la identification de una mutation en EGFR en una muestra que comprende la puesta en contacto de un acido nucleico de dicha muestra con una sonda de acido nucleico capaz

30 de hibridar especlficamente con un acido nucleico que codifica una protelna EGFR mutada o un fragmento del mismo que incorpora una mutacion y la detection de dicha hibridacion. En una realizacion concreta, dicha sonda se marca para su deteccion, por ejemplo, con un radioisotopo (3H, 32P, 33P, etc.), un agente fluorescente (rodamina, fluorescelna, etc.) o un agente cromogenico. En una realizacion concreta, la sonda es un oligomero no codificante, por ejemplo, APN, fosforoamidatos de morfolina, ANB o 2'-alcoxialcoxi. La sonda puede ser de aproximadamente 35 ocho nucleotidos a aproximadamente 100 nucleotidos o de aproximadamente diez a aproximadamente 75, de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 o de aproximadamente 20 a aproximadamente 30 nucleotidos. En otro aspecto, dichas sondas se proporcionan en un kit para la identificacion de mutaciones en EGFR en una muestra, en que dicho kit comprende un oligonucleotido que hibrida especlficamente con un sitio de mutacion en el gen EGFR o con un sitio adyacente al anterior. Ademas, el kit puede comprender instrucciones para el tratamiento de pacientes 40 con tumores que contienen mutaciones en EGFR con un inhibidor de EGFR sobre la base del resultado de una prueba de hibridacion mediante el uso del kit. 00030 00031

[00030] Tambien se describe un procedimiento para la deteccion de un gen EGFR mutado en una muestra que comprende la amplification de un acido nucleico de dicha muestra que corresponde al dominio de cinasa de dicho

45 gen EGFR, o a los exones 18 - 21, o a un fragmento del mismo del que se sospecha que contiene una mutacion y la comparacion de la movilidad electroforetica del acido nucleico amplificado con la movilidad electroforetica del gen EGFR natural correspondiente o fragmento del mismo. Una diferencia en la movilidad indica la presencia de una mutacion en la secuencia de acido nucleico amplificada. La movilidad electroforetica puede determinarse en un gel de poliacrilamida.

50

[00031] Alternativamente, el acido nucleico del gen o fragmento del gen EGFR amplificado puede analizarse para la deteccion de mutaciones mediante el procedimiento de deteccion enzimatica de mutaciones (EMD) (Del Tito y col., Clinical Chemistry 44: 731 - 739, 1998). El procedimiento EMD usa la endonucleasa VII de T4, una resolvasa bacteriofagica, que recorre el ADN bicatenario hasta que detecta y corta las distorsiones estructurales causadas por

55 apareamientos de bases erroneos que resultan de mutaciones puntuales, inserciones y deleciones. La deteccion, por ejemplo, mediante electroforesis en gel, de dos fragmentos de poca longitud formados por el corte con la resolvasa, indica la presencia de una mutacion. Los beneficios del procedimiento EMD son un unico protocolo para la identificacion de mutaciones puntuales, deleciones e inserciones que se aplica directamente sobre reacciones de PCR, con lo que se elimina la necesidad de purificar la muestra, se reduce el tiempo de hibridacion y se aumenta la

relacion entre la senal y el ruido. Es posible analizar muestras mixtas que contienen un exceso de hasta 20 veces de ADN normal y fragmentos de un tamano de hasta 4 kb. Sin embargo, el procedimiento EMD no identifica los cambios de bases concretos producidos en las muestras positivas para mutacion, con lo que se requieren procedimientos adicionales de secuenciacion para identificar la mutacion en caso es necesario. La enzima CEL I puede usarse de 5 manera similar a la resolvasa endonucleasa VII de T4, segun se demuestra en el documento US5869245.

[00032] Otro kit simple para la deteccion de mutaciones de EGFR es una tira de prueba para hibridacion inversa similar al ensayo Haemochromatosis StripAssay™ (Viennalabs, http: //
www.bamburghmarrsh.com/pdf/4220.pdf) para la deteccion de multiples mutaciones en los genes HFE, TFR2 y

10 FPN1, causantes de hemocromatosis. Un ensayo tal se basa en una hibridacion especlfica de la secuencia despues de la amplificacion por PCR. Para ensayos de mutaciones unicas, puede aplicarse un sistema de deteccion basado en una microplaca, mientras que para ensayos de mutaciones multiples, las tiras de prueba pueden usarse como “macromatrices”. Los kits pueden incluir reactivos listos para usar para la extraccion de ADN de las muestras, la amplificacion y la deteccion de la mutacion. Los protocolos de amplificacion multiplex proporcionan comodidad y 15 permiten la prueba de muestras con volumenes muy limitados. Mediante el sencillo formato del StripAssay, puede llevarse a cabo la prueba de 20 y mas mutaciones en menos de cinco horas sin un equipamiento costoso. El ADN se alsla de una muestra y el gen EGFR (o los exones 18 - 21 o el KDR o segmentos del mismo) se amplifica in vitro (p. ej., por PCR) y se marca con biotina, preferentemente en una reaccion de amplificacion unica (“multiplex”). Los productos de PCR se hibridan selectivamente con sondas oligonucleotldicas (especlficas del tipo natural y del 20 mutante) inmovilizadas sobre un soporte solido como una tira de prueba, en la que las sondas estan inmovilizadas como llneas o bandas paralelas. Los amplicones biotinilados unidos se detectan con estreptavidina-fosfatasa alcalina y sustratos coloreados. Un ensayo tal puede detectar todas las mutaciones de la tabla 1 o un subconjunto de las mismas. Con respecto a una banda de una sonda mutante concreta, es posible uno de los tres patrones de senalizacion siguientes: (i) una banda solo para la sonda natural que indica un EGFR normal, (ii) bandas para la 25 sonda natural y una sonda mutante que indican un genotipo heterocigoto y (iii) una banda solo para la sonda mutante que indica un genotipo mutante de EGFR homocigoto. Por consiguiente, se proporciona ademas un procedimiento para la deteccion de mutaciones de EGFR que comprende el aislamiento de un acido nucleico de una muestra, la amplificacion del gen EGFR o de un fragmento del mismo (p. ej., el KDR o los exones 18 - 21 o de menor tamano), de modo que el acido nucleico amplificado comprende un ligando, la puesta en contacto del gen o 30 fragmento del gen EGFR amplificado con una sonda que comprende un compuesto detectable de union con el ligando, en que la sonda es capaz de hibridar especlficamente con una mutacion en EGFR y despues la deteccion de la hibridacion de dicha sonda con dicho gen o fragmento del gen EGFR amplificado. En una realizacion concreta, el ligando es biotina y el compuesto de union comprende avidina o estreptavidina. En una realizacion concreta, el compuesto de union es estreptavidina-fosfatasa alcalina que es detectable con sustratos coloreados. En una 35 realizacion concreta, las sondas se inmovilizan, por ejemplo, en una tira de prueba, en la que las sondas complementarias de diferentes mutaciones estan separadas entre si. Alternativamente, el acido nucleico amplificado se marca con un radioisotopo, en cuyo caso la sonda no necesita comprender un ligando.

[00033] Las muestras de tumores se analizaron tambien con respecto a mutaciones en KRAS (denominado 40 como p21a). Las mutaciones concretas detectadas en el exon 1 son: G12C, G12A, G12D, G12R, G12S, G12V,

G13C y G13D que se correlacionan con un mal pronostico con quimioterapia, as! como con quimioterapia mas el tratamiento con erlotinib. Por consiguiente, la description proporciona ademas un procedimiento para la identification de pacientes que no son sensibles al tratamiento con un inhibidor de EGFR como erlotinib o a erlotinib en combination con quimioterapia que comprende la determination de la presencia o ausencia de una mutacion en 45 KRAS, segun lo cual, la presencia de dicha mutacion indica un paciente que no respondera a dicha terapia. Alternativamente, se proporciona un procedimiento para la identificacion de un tumor sensible al tratamiento con un inhibidor de EGFR en un sujeto humano que comprende (i) la determinacion de la presencia de una protelna o gen KRAS natural en una muestra de dicho tumor, segun lo cual, la presencia de una protelna o gen KRAS natural indica que el tumor es sensible al tratamiento con un inhibidor de EGFR o (ii) la determinacion de la presencia de un gen o 50 protelna KRAS mutados en una muestra de dicho tumor, segun lo cual, la ausencia de una protelna o gen KRAS mutados indica que el tumor es sensible al tratamiento con un inhibidor de EGFR. En una realizacion concreta, la mutacion en KRAs es una mutacion activadora. En una realizacion concreta, la mutacion es en el exon 1 de KRAS. En otra realizacion, la mutacion en KRAS es al menos una de entre G12C, G12A, G12D, G12R, G12S, G12V, G13C y G13D. Alternativamente, los individuos que tienen tumores con KRAS mutante pueden tratarse con inhibidores de 55 EGFR cuando tambien se tratan con un inhibidor de KRAS, antes, despues o durante el tratamiento con el inhibidor de EGFR. Los procedimientos para determinar la presencia de mutaciones en KRAS son analogos a los usados para identificar mutaciones en EGFR descritos en detalle en este documento.

[00034] Se observo ademas que los pacientes en cuyos tumores se encontro la presencia de mutaciones en

KRAS y se tenlan positivamente para EGFR mediante IHQ presentaban una supervivencia significativamente inferior al tratarlos con erlotinib en combinacion con quimioterapia, en comparacion con aquellos pacientes tratados solamente con quimioterapia. Las tablas 3 y 4 siguientes resumen estos resultados. Por consiguiente, la invention proporciona un procedimiento, segun se define en las reivindicaciones, para la identification de un paciente que no 5 es sensible al tratamiento con un inhibidor de EGFR como erlotinib en combinacion con un agente quimioterapeutico que comprende la determination de la presencia o ausencia de una mutation en KRAS y un EGFR en un tumor de dicho paciente, segun lo cual, la presencia simultanea de una mutacion en KRAS y un EGFR en dicho tumor indica que el paciente no respondera a dicho tratamiento con un inhibidor de EGFR en combinacion con quimioterapia. En este contexto “no sensible” significa que el paciente tendra una supervivencia inferior a la de un paciente similar (con 10 mutaciones en KRAS y la presencia de EGFR en un tumor) tratado solamente con quimioterapia. Dicho EGFR puede ser tanto un EGFr mutante como natural. Las mutaciones en KRAS se refieren a mutaciones en la protelna o acido nucleico KRAS y se detectan mediante procedimientos analogos a los usados para la deteccion de las mutaciones en EGFR. La presencia de EGFR se determina mediante inmunohistoqulmica (IHQ). En una realization, el EGFR es el EGFR natural. En otra realizacion, el EGFR es un EGFR mutante.

15

[00035] Tambien se describe un procedimiento para la determinacion de si un tumor respondera al tratamiento con un inhibidor de EGFR en combinacion con un agente quimioterapeutico, que comprende la determinacion de la presencia de una protelna o acido nucleico KRAS y un EGFR en una muestra de dicho tumor, segun lo cual, la presencia simultanea de la protelna o acido nucleico KRAS mutante y un EGFR indica que el tumor no respondera al 20 tratamiento con un inhibidor de EGFR. En este contexto, “responde” significa que el tumor se reduce en tamano o volumen o que se reduce la tasa de aumento de tamano o volumen. En una realizacion concreta, dicho tratamiento con un inhibidor de EGFR es anterior, simultaneo o posterior al tratamiento con quimioterapia.

Tabla 3

25

KRAS natural

Erlotinib + quimioterapia Solo quimioterapia

EGFR IHQ-

n

48 56

Mediana de la SG (meses) (IC del 95 %) Valor P de la prueba de rango logarltmico

12,1 (9,0, 16,6) 0,9557 12,7 (9,1, 16,8)

EGFR IHQ +

n

53 38

Mediana de la SG (meses) (IC del 95 %) Valor P de la prueba de rango logarltmico Cociente de riesgos instantaneos (IC del 95 %)

12,1 (8,0, 16,6) 0,7892 1,1 (0,6, 1,9) 10,3 (8,3, .)

KRAS mutante

Erlotinib + quimioterapia Solo quimioterapia

EGFR IHQ-

n

11 9

Mediana de la SG (meses) (IC del 95 %) Valor P de la prueba de rango logarltmico

9,0 (3,4, 12,9) 0,5507 12,8 (3,3, .)

EGFR IHQ +

n

12 20

Mediana de la SG (meses) (IC del 95 %) Valor P de la prueba de rango logarltmico Cociente de riesgos instantaneos (IC del 95 %)

3,4 (2,1, 4,4) < 0,001 4,9 (2,1, 11,5) 13,5 (11,1, 15,1)

5 [00036] Las alteraciones de un gen natural de acuerdo con la presente invention abarcan todas las formas de mutation como inserciones, inversiones, deleciones y/o mutaciones puntuales. Las mutaciones somaticas son aquellas que solo se producen en ciertos tejidos, por ejemplo en el tejido tumoral, y que no se heredan en la llnea germinal. Las mutaciones de la llnea germinal pueden encontrarse en cualquier tejido del cuerpo. La mutacion somatica de uno solo de los alelos indica un estado neoplasico temprano. Sin embargo, la mutacion de los dos 10 alelos indica un estado neoplasico tardlo.

[00037] De acuerdo con el procedimiento de diagnostico y pronostico de la presente description, se detecta la alteration del gen EGFR natural. Por lo tanto, la detection de mutaciones en EGFR es un indicador de diagnostico y pronostico segun se describe en este documento.

15

[00038] Las mutaciones en EGFR encontradas en tejidos tumorales pueden resultar en un aumento de la actividad de serialization, con respecto a EGFR natural, que conduce a un estado canceroso. Con el fin de detectar la alteracion del gen EGFR natural, se obtiene una muestra o biopsia del tumor por los procedimientos bien conocidos en la tecnica, apropiados para el tipo y localization concretas del tumor. Por ejemplo, pueden obtenerse

20 muestras de cancer de pulmon por resection, broncoscopia, aspiration con aguja fina, cepillado bronquial o de esputo, llquido pleural o sangre. Los procedimientos para el enriquecimiento de una preparation de tejido en celulas tumorales son conocidos en la tecnica. Por ejemplo, el tejido puede aislarse de secciones de parafina o de criostato. Las celulas cancerosas tambien pueden separarse de las celulas normales por citometrla de flujo o microdiseccion por captura con laser. Estos, al igual que otros procedimientos para la separation de las celulas tumorales de las 25 celulas normales son bien conocidas en la tecnica. Si el tejido tumoral esta muy contaminado con celulas normales, la deteccion de las mutaciones es mas diflcil.

[00039] La deteccion de mutaciones puntuales puede llevarse a cabo por donation molecular del alelo (o alelos) de EGFR y secuenciacion de dicho(s) alelo(s) mediante procedimientos bien conocidos en la tecnica.

30 Alternativamente, puede usarse la reaction en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar secuencias genicas directamente a partir de una preparacion de ADN genomico del tejido tumoral. La secuencia de ADN de las secuencias amplificadas puede determinarse y las mutaciones pueden identificarse a partir de esta. La reaccion en cadena de la polimerasa es bien conocida en la tecnica y se describe en Saiki y col., Science 239: 487, 1988; documento U.S. 4.683.203 y documento U. S. 4.683.195.

35

[00040] Los pares de cebadores especlficos que pueden usarse para la amplification por PCR de los exones 18 - 21 de EGFR incluyen:

< 5pEGFR.ex18.out > CAAATGAGCTGGCAAGTGCCGTGTC (SEQ ID NO: 39)

40 < 3pEGFR.ex18.out > GAGTTTCCCAAACACTCAGTGAAAC (SEQ ID NO: 40)

< 5pEGFR.ex19.out > GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTC (SEQ ID NO: 41)

< 3pEGFR.ex19.out > CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG (SEQ ID NO: 42)

< 5pEGFR.ex20.out > CCATGAGTACGTATTTTGAAACTC (SEQ ID NO: 43)

< 3pEGFR.ex20.out > CATATCCCCATGGCAAACTCTTGC (SEQ ID NO: 44)

5 < 5pEGFR.ex21.out > CTAACGTTCGCCAGCCATAAGTCC (SEQ ID NO: 45)

< 3pEGFR.ex21.out > GCTGCGAGCTCACCCAGAATGTCTGG (SEQ ID NO: 46)

< 5pEGFR.ex18.in.m13f > TGTAAAACGACGGCCAGTCAAGTGCCGTGTCCTGGCACCCAAGC (SEQ ID NO: 47)

< 3pEGFR.ex18.in.m13r > CAGGAAACAGCTATGACCCCAAACACTCAGTGAAACAAAGAG (SEQ ID NO: 48)

10

< 5pEGFR.ex19.in.m13f > TGTAAAACGACGGCCAGTCCTTAGGTGCGGCTCCACAGC (SEQ ID NO: 49)

< 3pEGFR.ex19.in.m13r > CAGGAAACAGCT AT GACCCATTTAGGAT GT GGAGAT GAGC (SEQ ID NO: 50)

< 5pEGFR.ex20.in.m13f > TGTAAAACGACGGCCAGTGAAACTCAAGATCGCATTCATGC (SEQ ID NO: 51)

15 < 5pEGFR.ex20.in.m13f > TGTAAAACGACGGCCAGTGAAACTCAAGATCGCATTCATGC (SEQ ID NO: 51)

< 5pEGFR.ex21.in.m13f > TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCATAAGTCCTCGACGTGG (SEQ ID NO: 53)

< 3pEGFR.ex21.in.m13r > CAGGAAACAGCT AT GACCCATCCTCCCCT GCAT GT GTT AAAC (SEQ ID NO: 54)

20 Los pares de cebadores especlficos que pueden usarse para la amplificacion por PCR del exon 1 de KRAS incluyen:

< 5pKRAS-out > TACTGGTGGAGTATTTGATAGTG (SEQ ID NO: 55)

< 3pKRAS-out > CTGTATCAAAGAATGGTCCTG (SEQ ID NO: 56)

25 < 5pKRAS-in.m13f > T GT AAAACGACGGCCAGTT AGT GT ATT AACCTT AT GT G (SEQ ID NO: 57)

< 3pKRAS-in.m13r > CAGGAAACAGCT AT GACCACCT CT ATT GTT GGAT CAT ATTCG (SEQ ID NO: 58)

[00041] La reaccion en cadena de la ligasa, conocida en la tecnica, tambien puede usarse para la amplificacion de secuencias de EGFR. Vease Wu y col., Genomics vol. 4, pags. 560 - 569 (1989). Ademas, puede emplearse una

30 tecnica conocida como PCR especlfica de alelo. (Vease Ruano y Kidd, Nucleic Acids Research, vol. 17, pag. 8392, 1989). De acuerdo con esta tecnica, se usan cebadores que hibridan en sus extremos 3' con una mutacion concreta de EGFR. Si la mutacion concreta de EGFR no esta presente, no se observa un producto de amplificacion. Tambien puede usarse el sistema de mutacion resistente a la amplificacion (ARMS), segun se describe en la publicacion de solicitud de patente europea n° 0332435 y en Newton y col., Nucleic Acids Research, vol. 17, pag. 7, 1989. Las

35 inserciones y deleciones en genes pueden detectarse tambien mediante clonacion, secuenciacion y amplificacion. Ademas, pueden usarse sondas de polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccion (RFLP) para el gen o genes marcadores circundantes, con el fin de detectar la alteracion de un alelo o una insercion en un fragmento polimorfico. Tambien puede usarse el analisis de polimorfismos de conformacion de cadena unica (SSCP) para detectar variantes de cambios de bases de un alelo. (Orita y col., Proc Natl Acad Sci USA vol. 86, pags. 2766 -

40 2770, 1989 y Genomics, vol. 5, pags. 874 - 879, 1989). Tambien pueden usarse otros procedimientos para la deteccion de inserciones y deleciones, segun se conocen en la tecnica.

[00042] La alteracion de genes naturales puede detectarse tambien sobre la base de la alteracion de un producto de expresion natural del gen. Tales productos de expresion incluyen tanto el ARNm de EGFR como el

45 producto proteico de EGFR. Las mutaciones puntuales pueden detectarse mediante la secuenciacion y amplificacion del ARNm o por medio de la clonacion molecular del ADNc producido a partir del ARNm. La secuencia del ADNc clonado puede determinarse mediante procedimientos de secuenciacion de ADN bien conocidos en la tecnica. El ADNc puede secuenciarse tambien por medio de la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR).

50 [00043] Son apareamientos erroneos, de acuerdo con la presente invencion, los duplex de acidos nucleicos hibridados que no son complementarios al 100 %. La falta de una complementariedad total puede deberse a deleciones, inserciones, inversiones, sustituciones o mutaciones del marco de lectura. La deteccion de apareamientos erroneos puede usarse para detectar mutaciones puntuales en el gen o en su producto de ARNm. Mientras que estas tecnicas son menos sensibles que la secuenciacion, son mas faciles de realizar en un gran

55 numero de muestras tumorales. Un ejemplo de una tecnica de corte de apareamientos erroneos es el procedimiento de proteccion frente a ARNasa, que se describe en detalle en Winter y col., Proc Natl Acad Sci USA, vol. 82, pag. 7575, 1985 y Meyers y col., Science, vol. 230, pag. 1242, 1985. Este procedimiento implica el uso de una ribosonda marcada complementaria de la secuencia codificante del gen EGFR natural humano (o los exones 18 - 21 o el KDR del mismo). La ribosonda y bien el ARNm o el ADN aislados del tejido tumoral se alinean (hibridan) conjuntamente y

a continuation se digieren con la enzima ARNasa A, que es capaz de detectar algunos apareamientos erroneos en una estructura duplex de ARN. Si la ARNasa detecta un apareamiento erroneo, corta en el sitio de dicho apareamiento erroneo. Por lo tanto, cuando la preparation de ARN alineado se separa en una matriz de gel de electroforesis, si la ARNasa A ha detectado y cortado un apareamiento erroneo, se observara un producto de ARN 5 de menor tamano que el duplex de ARN de longitud completa formado por la ribosonda con el ARNm o el ADN. La ribosonda no necesita tener la longitud completa del ARNm o el gen EGFR, sino que puede corresponder a los exones 18 a 21 o al KDR de EGFR o a segmentos del mismo. Si la ribosonda comprende solo un segmento del ARNm o gen EGFR, sera deseable usar varias de estas sondas para analizar toda la secuencia de ARNm con respecto a apareamientos erroneos.

10

[00044] De manera similar, es posible usar sondas de ADN para la detection de apareamientos erroneos a traves de un corte enzimatico o qulmico. Vease, por ejemplo, Cotton y col., Proc Natl Acad Sci USA, vol. 85, pag. 4397, 1988 y Shenk y col., Proc Natl Acad Sci USA, vol. 72, pag. 989, 1975. Alternativamente, los apareamientos erroneos pueden detectarse por cambios de la movilidad electroforetica de los duplex con apareamientos erroneos

15 con respecto a los duplex correctamente apareados. Vease, por ejemplo, Cariello, Human Genetics, vol. 42, pag. 726, 1988.Tanto con ribosondas como con sondas de ADN, el ARNm o ADN celular que pudiera contener una mutation puede amplificarse mediante PCR antes de la hibridacion. Tambien es posible la deteccion de cambios en el ADN del gen EGFR mediante hibridacion de Southern, especialmente si los cambios son reorganizaciones de importancia, como deleciones o inserciones.

20

[00045] Las secuencias de ADN del gen EGFR amplificadas mediante la reaction en cadena de la polimerasa pueden analizarse tambien con sondas especlficas de un alelo. Estas sondas son oligomeros de acido nucleico, cada uno de los cuales contiene una region de la secuencia del gen EGFR con una mutacion conocida. Por ejemplo, un oligomero puede tener una longitud de aproximadamente 30 nucleotidos, correspondientes a una portion de la

25 secuencia del gen EGFR. Mediante el uso de una baterla de tales sondas especlficas de alelo, pueden analizarse los productos de amplification por PCR para detectar la presencia de una mutacion previamente identificada en el gen EGFR. La hibridacion de sondas especlficas de alelo con las secuencias amplificadas de EGFR puede llevarse a cabo, por ejemplo, en un filtro de nailon. La hibridacion con una sonda concreta en condiciones de hibridacion restrictivas indica la presencia de la misma mutacion en el tejido tumoral que en la sonda especlfica de un alelo.

30

[00046] Las secuencias de ADN del gen EGFR que han sido amplificadas mediante la reaccion en cadena de la polimerasa tambien pueden analizarse para identificar mutaciones por tecnicas de espectroscopla de masas. Las regiones amplificadas del gen con una mutacion tendran un patron espectroscopico de masas distinto del de la misma region sin mutaciones.

35

[00047] La alteration de los genes EGFR naturales puede detectarse tambien mediante la identification de alteraciones de la protelna EGFR natural. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos monoclonales inmunorreactivos con EGFR para analizar un tejido. La falta de un antlgeno afln indicara una mutacion en EGFR. Para detectar un producto mutante del gen EGFR tambien podrlan usarse anticuerpos especlficos para los productos de alelos

40 mutantes. Los anticuerpos pueden identificarse a partir de colecciones de fagos que exponen estas moleculas. Tales ensayos inmunologicos pueden realizarse en cualquier formato conveniente conocido en la tecnica. Estos incluyen, ensayos de inmunotransferencia, ensayos inmunohistoqulmicos y ensayos ELISA. Cualquier procedimiento para la deteccion de una protelna EGFR alterada puede usarse para la deteccion de una alteracion de los genes EGFR naturales.

45

[00048] Los genes o productos genicos mutantes de EGFR pueden detectarse a partir de tumores o de otras muestras corporales como orina, esputo o suero. Las mismas tecnicas discutidas anteriormente para la deteccion de genes o productos genicos mutantes de EGFR en muestras tumorales pueden aplicarse a las otras muestras corporales. Las celulas cancerosas se desprenden de los tumores y aparecen en tales muestras corporales. Al

50 analizar tales muestras corporales puede conseguirse un sencillo diagnostico temprano para muchos tipos de cancer. Ademas, el progreso de la quimioterapia o la radioterapia puede controlarse mas facilmente mediante el analisis de tales muestras corporales con respecto a la presencia de genes o productos genicos mutantes de EGFR.

[00049] Los procedimientos de diagnostico de la presente description pueden aplicarse a cualquier tumor en el

55 que EGFR desempene un papel en la tumorigenesis, por ejemplo, de pulmon, mama, colon, glioma, vejiga,

estomago y prostata. El procedimiento de diagnostico de la presente invention es util para los medicos, para poder decidir sobre el tratamiento adecuado. Por ejemplo, un tumor que muestre alteracion en los dos alelos de EGFR podrla sugerir un regimen de tratamiento mas agresivo que un tumor que muestre un solo un alelo de EGFR alterado.

[00050] Los pares de cebadores de la presente descripcion son utiles para la determinacion de la secuencia nucieotldica de un alelo concreto de EGFR mediante la reaccion en cadena de la polimerasa. Los pares de cebadores de ADN monocatenario pueden alinearse con secuencias dentro o alrededor del gen EGFR con el fin de

5 cebar la slntesis de amplificacion del ADN del gen EGFR mismo. Un conjunto de estos cebadores permite la slntesis de todos los nucleotidos de los exones 18 a 21 de EGFR. Tambien pueden usarse cebadores especlficos de un alelo. Tales cebadores se alinean solo con alelos mutantes concretos de EGFR y, por lo tanto, solo amplificaran un producto en presencia del alelo mutante como molde. Con el fin de facilitar la clonacion subsiguiente de las secuencias amplificadas, los cebadores pueden tener secuencias de sitios para enzimas de restriccion anadidas a 10 sus extremos. Por lo tanto, todos los nucleotidos de los cebadores derivan de los exones 18 - 21 de EGFR o de secuencias adyacentes a estos, excepto por los pocos nucleotidos necesarios para formar un sitio para una enzima de restriccion. Tales enzimas y sitios son bien conocidos en la tecnica. Los cebadores mismos pueden sintetizarse mediante procedimientos bien conocidos en la tecnica. Generalmente, los cebadores pueden prepararse con maquinas sintetizadoras de oligonucleotidos, disponibles en el comercio. El diseno de cebadores concretos se 15 encuentra dentro de las capacidades de los expertos en la tecnica.

[00051] Las sondas de acido nucleico proporcionadas por la presente descripcion son utiles para una serie de finalidades. Pueden utilizarse en una hibridacion de Southern con ADN genomico y en el procedimiento de proteccion frente a ARNasa para la deteccion de mutaciones puntuales discutido anteriormente. Las sondas pueden

20 usarse para la deteccion de productos de amplificacion por PCR. Tambien pueden usarse para la deteccion de apareamientos erroneos con el gen EGFR o su ARNm mediante otras tecnicas. Los apareamientos erroneos pueden detectarse mediante enzimas (p. ej., nucleasa S1), compuestos qulmicos (p. ej., hidroxilamina o tetroxido de osmio y piperidina) o cambios en la movilidad electroforetica de los hlbridos apareados erroneamente en comparacion con los hlbridos perfectamente apareados. Estos procedimientos son conocidos en la tecnica. Vease Novack y col., Proc 25 Natl Acad Sci USA, vol. 83, pag. 586, 1986. Generalmente, las sondas son complementarias de las secuencias de los exones 18 - 21 de EGFR, aunque generalmente tambien se contemplan sondas para el dominio de cinasa y segmentos del mismo. Es posible usar una baterla completa de sondas de acido nucleico para componer un kit para la deteccion de la alteracion de genes EGFR naturales. El kit permite la hibridacion de toda la secuencia de los exones 18 - 21 del gen EGFR. Las sondas pueden solaparse entre si o ser contiguas.

30

[00052] Si se usa una ribosonda para la deteccion de apareamientos erroneos con ARNm, esta es complementaria del ARNm del gen EGFR. Por lo tanto, la ribosonda es una sonda no codificante, en el sentido de que no codifica la protelna EGFR porque es complementaria de la cadena codificante. Generalmente, la ribosonda se marca con material radiactivo, colorimetrico o fluorimetrico, lo que puede realizarse por cualquier procedimiento

35 conocido en la tecnica. Si la ribosonda se utiliza para la deteccion de apareamientos erroneos con ADN, esta puede ser de cualquier polaridad, codificante o no codificante. De manera similar, tambien pueden usarse sondas de ADN para la deteccion de apareamientos erroneos.

[00053] La predisposicion a canceres puede averiguarse mediante el analisis de cualquier tejido de un humano 40 con respecto a la presencia de mutaciones del gen EGFR. Por ejemplo, una persona que ha heredado una mutacion

en EGFR de llnea germinal sera propensa a padecer cancer. Esto puede determinarse mediante el analisis del ADN de cualquier tejido corporal. Por ejemplo, puede extraerse sangre y, de las celulas de la sangre, extraerse el ADN. Ademas, puede llevarse a cabo un diagnostico prenatal mediante el analisis de celulas fetales, celulas placentarias o llquido amniotico con respecto a la presencia de mutaciones del gen EGFR. Una alteracion de un alelo natural de 45 EGFR, por ejemplo, por mutacion puntual o por delecion, puede detectarse por cualquiera de los procedimientos discutidos anteriormente.

EJEMPLOS:

50 Ejemplo 1 Preparaciones sobre portaobjetos - desparafinado y tincion

[00054] Secciones sumergidas en las disoluciones siguientes:

xilenos recien preparados (para desparafinar las secciones) - 5 min 55 xilenos recien preparados - 5 min etanol al 100 % - 15 s etanol al 95 % - 15 s etanol al 70 % - 15 s agua desionizada - 15 s

hematoxilina de Mayer - 30 s agua desionizada - lavado (x 2) - 15 s etanol al 70 % - 15 s eosina Y - 15 s 5 etanol al 95 % - 15 s etanol al 95 % - 15 s etanol al 100 % - 15 s etanol al 100 % - 15 s

xilenos (para asegurar la deshidratacion de la seccion) - 60 s

10

Secado al aire durante aproximadamente 2 minutos o mediante el uso suave de aire comprimido para eliminar completamente los xilenos. El tejido quedo as! listo para microdiseccion por captura con laser (LCM).

Ejemplo 2 Microdiseccion por captura con laser y extraccion de ADN

15

Materiales:

[00055]

20 Sistema de LCM PixCell II

Tapones para LCM CapSure HS o CapSure Macro Dispositivo ExtractSure (solo HS)

Cuchillas (esteriles de fabrica)

Tubos de 0,5 ml 25 Tubos de 0,2 ml

Kit de extraccion de ADN PicoPure Incubador de 65 °C

Procedimiento:

30

[00056]

Tapon CapSure colocado sobre el area de tejido que debla recogerse.

2. Laser aplicado sobre el area deseada.

35 Tapon levantado del tejido.

20 pl de tampon de digestion PicoPure junto con proteinasa K anadidos a un tubo de 0,5 ml.

Tapon con el material diseccionado colocado en el tubo para cerrarlo firmemente.

Tubo invertido para que el tampon de digestion cubriera el tapon.

Incubado a 65 °C durante 24 horas.

40 Tubo con el tapon centrifugado para recoger el material digerido en el fondo del tubo.

Digerido transferido a tubos en tira de 0,2 ml.

Proteinasa K inactivada a 95 °C durante 10 minutos en un termociclador con tapa caliente.

10. Uso de 1 - 2 pl de la muestra en una reaccion de PCR de 50 pl. No se necesito purificacion.

45 Ejemplo 3 Amplificacion por PCR

Cebadores de PCR:

[00057] Se disenaron pares de cebadores para cada exon por secuenciar (exones 18, 19, 20 y 21 de EGFR). 50 Las secuencias de los cebadores usados fueron las siguientes:

< 5pEGFR.ex18.out > CAAATGAGCTGGCAAGTGCCGTGTC (SEQ ID NO: 39)

< 3pEGFR.ex18.out > GAGTTTCCCAAACACTCAGTGAAAC (SEQ ID NO: 40)

55 < 5pEGFR.ex19.out > GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTC (SEQ ID NO: 41)

< 3pEGFR.ex19.out > CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG (SEQ ID NO: 42)

< 5pEGFR.ex20.out > CCATGAGTACGTATTTTGAAACTC (SEQ ID NO: 43)

< 3pEGFR.ex20.out > CATATCCCCATGGCAAACTCTTGC (SEQ ID NO: 44)

< 5pEGFR.ex21.out > CTAACGTTCGCCAGCCATAAGTCC (SEQ ID NO: 45)

< 3pEGFR.ex21.out > GCTGCGAGCTCACCCAGAATGTCTGG (SEQ ID NO: 46)

5 < 5pEGFR.ex18.in.m13f > TGTAAAACGACGGCCAGTCAAGTGCCGTGTCCTGGCACCCAAGC (SEQ ID NO: 47)

< 3pEGFR.ex18.in.m13r > CAGGAAACAGCTATGACCCCAAACACTCAGTGAAACAAAGAG (SEQ ID NO: 48)

< 5pEGFR.ex19.in.m13f > TGTAAAACGACGGCCAGTCCTTAGGTGCGGCTCCACAGC (SEQ ID NO: 49)

< 3pEGFR.ex19.in.m13r > CAGGAAACAGCT AT GACCCATTTAGGAT GT GGAGAT GAGC (SEQ ID NO: 50)

10

< 5pEGFR.ex20.in.m13f > TGTAAAACGACGGCCAGTGAAACTCAAGATCGCATTCATGC (SEQ ID NO: 51)

< 5pEGFR.ex20.in.m13r > CAGGAAACAGCTATGACCGCAAACTCTTGCTATCCCAGGAG (SEQ ID NO: 52)

< 5pEGFR.ex21.in.m13f > TGTAAAACGACGGCCAGTCAGCCATAAGTCCTCGACGTGG (SEQ ID NO: 53)

15 < 3pEGFR.ex21.in.m13r > CAGGAAACAGCT AT GACCCATCCTCCCCT GCAT GT GTT AAAC (SEQ ID NO: 54)

Oligonucleotidos de KRAS para PCR:

[00058]

20

< 5pKRAS-out > TACTGGTGGAGTATTTGATAGTG (SEQ ID NO: 55)

< 3pKRAS-out > CTGTATCAAAGAATGGTCCTG (SEQ ID NO: 56)

< 5pKRAS-in.m13f > T GT AAAACGACGGCCAGTT AGT GT ATT AACCTT AT GT G (SEQ ID NO: 57)

25 < 3pKRAS-in.m13r > CAGGAAACAGCT AT GACCACCT CT ATT GTT GGAT CAT ATTCG (SEQ ID NO: 58)

[00059] Se llevo a cabo una amplificacion anidada del producto primario de PCR con pares de cebadores especlficos de los intrones localizados dentro del producto primario de PCR. Los pares de cebadores anidados se etiquetaron con las secuencias M13f y M13rev.

30

Primera tanda de PCR:

Reaccion de PCR:

35 [00060]

40

ADN 0,5 a 30 ng

Cebadores 250 nM de cada cebador exterior (out)

dNTP 0,2 mM de cada uno (Roche, n° de catalogo 1581295)

MgCl2 1,5 mM (tampon 10 x, 15 mM)

Enzima 1,5 U/reaccion de Taq de alta fidelidad Expand (Roche, n° de catalogo 1759078)

50 pl de volumen de reaccion

Condiciones del termociclador:

45

[00061]

95 °C - 3 minutos

94 °C - 30 segundos repetido 35 veces 50 58 °C - 30 segundos 72 °C - 1 minuto 72 °C - 8 minutos 4 °C - permanente

55 Segunda tanda de PCR:

Reaccion de PCR:

1 |jl de la reaccion de PCR de la primera tanda 250 nM de cada cebador interior (in)

0,2 mM de cada uno (Roche, n° de catalogo 1581295)

1.5 mM (tampon 10 x, 15 mM)

1.5 U/reaccion de Taq de alta fidelidad Expand (Roche

ADN

Cebadores dNTP MgCl2 Enzima 50 jl de volumen de reaccion

n° de catalogo 1759078)

Condiciones del termociclador:

10

[00063]

95 °C - 3 minutos

94 °C - 30 segundos repetido 30 veces 15 58 °C - 30 segundos 72 °C - 1 minuto 72 °C - 8 minutos 4 °C - permanente

20 Aislamiento de los productos de PCR:

[00064] Los productos de las reacciones de PCR se separaron en geles de agarosa E-Gel al 2 % (Invitrogen, n° de catalogo G6018-02) para el control de calidad. Los productos de PCR se purificaron directamente mediante el kit de purificacion Qiaquick 96 PCR (Qiagen, n° de catalogo 28181) o se purificaron en gel en caso necesario. Para 25 la purificacion en gel, el producto de PCR se escindio del E-Gel y el ADN se purifico mediante el kit de purificacion Qiaquick 96 PCR con un protocolo de extraccion de gel (Qiagen, n° de catalogo 28181).

Ejemplo 4 Secuenciacion

30 [00065] Para la secuenciacion de los productos de PCR purificados, se usaron cebadores de secuenciacion anidados o los cebadores de secuenciacion estandar M13f y M13rev para los productos de PCR etiquetados. Las secuencias fueron las siguientes:

< m13f > TGTAAAACGACGGCCAGT (SEQ ID NO: 59)

35 < m13r > CAGGAAACAGCTATGACC (SEQ ID NO: 60)

[00066] Los productos de PCR purificados se diluyeron y se secuenciaron en ciclos con el kit BygDye Terminator (ABI, Foster City, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

40 Mezcla de reaccion:

[00067]

5 jl de ADN (25 - 100 ng de producto de PCR)

45 6 jl de agua

1 jl de cebador diluido con agua a 0,25 DO/100jl (m13f o m13r o un cebador especlfico de la secuencia)

2 jl de BigDye v3.1

6 jl de tampon de dilucion (equivalente del tampon de dilucion ABI 5x)

50 Secuenciacion en ciclos:

Condiciones:

[00068]

55

96 °C - 2,5 minutos - desnaturalizacion inicial 96 °C - 10 segundos 50 °C - 5 segundos 60 °C - 4 minutos

Claims (9)

1. REIVINDICACIONES

   1. Procedimiento para la identificacion de un paciente que se espera que tenga una supervivencia mas corta si se trata con un inhibidor de EGFR en combinacion con quimioterapia, que si se trata solamente con quimioterapia, que

   5 comprende la determinacion in vitro de la presencia o ausencia de una mutacion en la protelna KRAS y de EGFR natural o mutado en un tumor de dicho paciente, segun lo cual, la presencia simultanea de una mutacion en la protelna KRAS y de EGFR en dicho tumor indica que se espera que el paciente tenga una supervivencia mas corta si se trata con un inhibidor de EGFR en combinacion con quimioterapia, que si se trata solamente con quimioterapia, en el que el tumor es un tumor de pulmon, en el que el inhibidor de EGFR es una molecula pequena que compite 10 con ATP y en el que la presencia de EGFR se determina mediante inmunohistoqulmica.
2. 2. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que dicha mutacion en KRAS es una mutacion activadora.
3. 3. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que dicha mutacion en KRAS es al menos una de entre G12C; 15 G12A; G12D; G12R; G12S; G12V; G13C y G13D.
4. 4. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho inhibidor de EGFR es uno o mas de entre erlotinib o gefitinib.

   20 5. Procedimiento, segun la reivindicacion 4, en el que dicho inhibidor de EGFR es erlotinib.
5. 6. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho agente quimioterapeutico es uno o mas de entre citarabina, fludarabina, 5-fluoro-2'-desoxiuridina, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, bleomicina, clorambucilo, cisplatino, ciclofosfamida, doxorrubicina, mitoxantrona, camptotecina, topotecan,

   25 teniposido, colcemida, colchicina, paclitaxel, vinblastina, vincristina o tamoxifeno.
6. 7. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho agente quimioterapeutico es carboplatino y/o paclitaxel.

   30 8. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el EGFR es EGFR natural.
7. 9. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el EGFR es EGFR mutado.
8. 10. Procedimiento, segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la presencia de una mutacion en la 35 protelna KRAS se determina mediante la amplificacion de un acido nucleico de KRAS de dicho tumor o de un

   fragmento del mismo, del que se sospecha que contiene una mutacion, y la secuenciacion de dicho acido nucleico amplificado.
9. 11. Procedimiento, segun cualquiera de la reivindicaciones 1 a 9, en el que la presencia de una mutacion en la 40 protelna KRAS se determina mediante la amplificacion de un acido nucleico de KRAS de dicho tumor o de un

   fragmento del mismo, del que se sospecha que contiene una mutacion, y la comparacion de la movilidad electroforetica del acido nucleico amplificado con la movilidad electroforetica del correspondiente acido nucleico o fragmento de KRAS natural.

   45