JPH0372273B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

この発明は、固定化ガラス及びその製造法に関
する。さらに詳しくは、酵素、抗原、抗体等のペ
プチド含有化合物を固定化してなる固定化ガラス
及びその製造法に関する。 最近、酵素等のペプチド含有化合物をガラス担
体に固定化した固定化ガラスが診断用や合成用の
バイオリアクターとして用いられるようになつて
きた。これらの固定化ガラスの製造法としては、
溶融法によつて予め得られたSiO₂系ガラスの表
面をアルカリ処理して水酸基を生成させ、これに
例えばアミノアルキル基を導入してこれに酵素を
付加して固定させる方法が知られており実用化さ
れている。 しかし上記従来の方法においてはガラス表面に
水酸基を生成させる工程が必要であり、それによ
つて生成しうる水酸基の単位面積当りの量は限度
があつて酵素等の固定量を増大し活性の高い固定
化ガラスを得ることが困難であつた。 この発明は上記問題点を解消すべくなされたも
のである。この発明の発明者らは金属アルコキシ
ドを原料とし、これを緩和な条件下で加水分解し
て生成するゲル状物を酵素等固定用担体として用
いることにより、水酸基を導入する工程を行なう
ことなく従来に比して担体当りの酵素等の固定量
が増大された固定化ガラスが得られる事実を見出
し、この発明に到達した。 かくしてこの発明によれば、担体として、金属
アルコキシドの加水分解で生成する水酸化金属化
合物及び／又はその縮合物からなるガラス様ゲル
体を用いてなるペプチド含有化合物の固定化ガラ
スが提供される。 この発明における金属アルコキシドとしては、
ガラス製造分野やセラミツク製造分野で知られた
金属のアルコキシドが種々適用でき、具体的には
Si（OCH₃）₄、Si（OC₂H₅）₄、Ti（OC₃H₇）₄、Ｖ
（OC₂H₅）₃、Al（OC₃H₇）₃、NaOCH₃等の低級ア
ルコキシ金属が挙げられ、これらのうち低級アル
コキシシランを用いるのが通常好適である。な
お、これら二種以上の混合物を用いてもさしつか
えはない。 この発明の固定化ガラスを作製するに当つて、
まず上記金属アルコキシドは加水分解によつてゲ
ル状物とされる。 例えば低級アルコキシシランを用いた場合、こ
の加水分解は水性溶媒中、酸性下にて緩和な条件
下で行なうのが通常適当である。この際、室温下
で溶媒を蒸散させつつ加水分解を進め、加温を避
けできるだけ加水分解物の水酸化金属化合物の高
縮合化が防止されたゲル状物を生成させることが
好ましい。この際の水性溶媒としては水を含む揮
発性の親水性溶剤を用いるのが適当であり、例え
ば含水メタノールや含水エタノールが好適に用い
られる。場合によつては水分は空気中から供給さ
れるため水を含ませなくてもよい。水のみで加水
分解を行なうことも可能であるが、この場合は加
水分解が急激に進み過ぎて不均一になる惧れがあ
りさらに、ゲル状物の乾燥上不利であり好ましく
ない。また溶媒のPHは通常酸性（PH１〜３程度）
とするのが適当であり、通常、塩酸等の無機酸を
少量添加することによつて調整される。かような
水性溶媒中に金属アルコキシドを加え室温で充分
に撹拌混合した後、空気中に放置して水及び親水
性溶剤を自然乾燥させることにより、この発明の
ゲル状物が単離される。 ただし、加水分解条件は金属アルコキシドによ
つても異なり、有機溶媒も使用可能でありまた、
アルカリ性下でも可能であり、上記例に限定され
ることなく適宜選択すればよい。 例えば、金属アルコキシドとしてSi（OC₂H₅）₄
を用いた場合にはガラス様のゲル体が得られるが
その組成はSi（OC₂H₅）₄の加水分解物であるSi
（OH）₄又はその低縮合物からなるため、従来の
SiO₂系ガラスにアルカリ処理により生成された
水酸基に比して非常に多数の水酸基をそれ自身有
している。従つて従来の固定化ガラスに比して多
量の酵素等を固定化できるものと考えられる。他
の金属アルコキシドについても同様に、得られた
ガラス様ゲル体は水酸化金属化合物やその低縮合
物からなるため、多量の酵素等を固定化できるも
のと考えられる。 かようなゲル状物は単離後任意に緩和な温度
（通常50〜200℃程度）で乾燥して用いてもよく、
そのまま用いてもよい。そして、その形状も得ら
れた形状そのままで用いてもよく、板状にカツト
して用いてもよく、粉砕して微粒子又は粉状とし
て用いてもよい。通常、固定量をより増加させる
ためには、微粒子又は粉状として用いてもよく板
状体としても表面を粗面化することが適当であ
る。 このゲル状物（ガラス様ゲル体）を担体とし、
これにシランカツプリング剤を反応させ、その反
応物にペプチド含有化合物を固定化することによ
りこの発明の固定化ガラスが得られる。 上記ゲル状物に反応させるシランカツプリング
剤としては、アミノ基、チオール基、エポキシ基
などの官能性基を有する当該分野で公知のシラン
誘導体が適用でき、具体的にはγ−アミノプロピ
ルトリエトキシシラン、γ−クロロプロピルトリ
メトキシシラン、ビニルトリエトキシシラン、γ
−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、Ｎ
−β−（アミノエチル）−γ−アミノプロピルトリ
メトキシシラン等が使用される。かようなシラン
カツプリング剤との反応は、当該分野で公知の条
件下で行なわれる。例えばγ−アミノプロピルト
リエトキシシランを用いた場合、このカツプリン
グ剤を水に溶解して約10％水溶液としかつPHを３
〜５に調整した後、この溶液に充分に乾燥された
前記ゲル状物又はその粉砕物を加え加温下混合し
て数時間処理した後水洗して未反応のカツプリン
グ剤を除去することにより得られる。 上記、シランカツプリング剤を導入したゲル状
物は、それ自身従来のガラスに導入したものに比
して担体として多くのカツプリング基を有してお
り、酸素等との反応活性が高く固定化酸素用担体
やカラム充填剤として有用なものである。 このようにして処理されたゲル状物に公知の方
法で酵素、抗原、抗体等のペプチド含有化合物が
固定化される。例えば、カツプリング剤としてγ
−アミノプロピルトリエトキシシランを用いてア
ミノアルキル基を水酸基にエステル結合で多数導
入したゲル状物を用いる場合、上記アミノアリキ
ル基にグルタルアルデヒドを用いてアルデヒド基
を有するシツフベースを導入し、これに酵素等を
接触させてアルデヒド基と酵素等のアミノ基間で
さらにシツフベースを形成させて結合することに
より固定化を行なうことができ、これ以外にもア
ミノアルキル基をジアゾ化して芳香族アミノ基を
導入しこれに酵素等を固定化してもよく、またカ
ルボジイミドを用いてアミノアルキル基と酵素等
との間に直接ペプチド結合を行ない固定化を行な
つてもよく酵素等の種類に応じて適宜選択すれば
よい。他のカツプリング剤使用時にも同様に直接
又は適宜変換したカツプリング基によつて酵素等
を固定化することができる。 固定化用の酵素としては具体的にはグルコース
オキシダーゼ、ウレカーゼ、ウレアーゼ、クレア
チニナーゼ、CoA−シンテターゼ、CoA−オキ
シダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、コレス
テロールヒドロラーゼ等が挙げられるが限定され
ることはなく、抗原や抗体を固定化することもで
きる。 このようにして得られた固定化ゲル体（固定化
ガラス）は従来の固定化ガラスと同様に、種々の
形態で診断用や合成用のバイオリアクターとして
有用であり、さらに従来の固定化ガラスに比して
担体当りの酵素等の固定量は多くバイオリアクタ
ーとしての能力が増大されたものである。 以上述べたごとく、この発明の固定化ガラス
は、高温加熱処理工程を要しないゲル状物を担体
としかつ固定化に当つて水酸基を導入する工程を
必要としないため、従来に比して大幅にコストを
低減でき、また水系媒体中で処理でき有機溶剤を
用いないため有利であり、さらに固定化ガラスも
従来のものに比して活性の高いものが得られ、工
業上極めて有用である。この発明によるガラスは
ガラスビーズの他に板状、管状の形状でもよく、
ガラスや金属管の表面を被覆したアルコキシドガ
ラスに酵素などを固定化した形態であつてもよ
い。 以下、この発明を実施例によつてより詳しく説
明する。 実施例 １ （ゲル状物の作製−工程１） テトラエトキシシランSi（OC₂H₅）₄10ｇ、エタ
ノール10ml、水3.8ml及び塩酸（1N）1.4mlの混合
物（PH１）を室温で均一になるまで約１時間撹拌
混合した。この混合物を空気中に約４日間放置し
て加水分解と水及びエタノールの蒸発を進め、約
120℃で乾燥させてSi（OH）₄系のゲル状物を得た。 （アミノアルキル化−工程２） 工程１で得られたゲル状物を乳鉢で粉砕し、ふ
るいを通して平均粒径60/80、80/120、120/200の
ビーズを得た。 5wt％のγ−アミノプロピルトリエトキシシラ
ン水溶液を5N塩酸でPH3.5に調整し、この溶液45
mlに対し上記ビーズ状ゲル状物を各々５ｇ投入
し、さらにPH3.5になるように調整した。この混
合物を、撹拌機、温度計、ジムロードを付設した
四ツ口フラスコに入れウオーターバスで温度を75
℃に保ち、激しく撹拌させながら３時間反応を行
なつた。反応終了後、ビーズを吸引メンブランフ
イルターに移し、１の蒸留水で未反応のγ−ア
ミノプロピルトリエトキシシランを除去した後、
デシゲーターで乾燥させて粒径の異なる三種のア
ミノアルキル化ゲル状物を得た。このアミノアル
キル化ゲル状物はデシケーター内で保存する。 （酸素の固定化−工程３） 上記アミノアルキル化ゲル状物（ビーズ状）を
各々二官能性のグルタルアルデヒド（2.5wt％）
のリン酸塩緩衝溶液（PH7.0）に浸漬し、アスビ
レーターで減圧させつつ約30分撹拌下反応させ
た。続いてさらに約30分常圧で撹拌下反応させ
た。反応温度は25℃であつた。これをPH7.0のリ
ン酸塩緩衝液で充分に洗浄し、乾燥させた。この
処理によりゲル状物のアルデヒド基を有するシツ
フベースが導入される。 得られたゲル状物を１mg／ml（グルコースオキ
シダーゼ／PH7.0リン酸塩緩衝液）中に浸漬し、
25℃下まず30分減圧下で緩やかに撹拌し反応を行
ない、続いて60分常圧下で緩かに撹拌して固定化
反応を行なつた。この処理によりグルコースオキ
シダーゼのアミノ基が反応に関与し、担体（ゲル
状物）のアルデヒド基とさらにシツフベースを形
成し固定化される。このようにしてこの発明のグ
ルコースオキシダーゼ固定化ゲル状物（ガラス）
が各々得られた。 （活性試験） 上記固定化ガラスビーズのうち200メツシユの
ものの固定化度合を従来と比較するためボルタン
メトリー法により活性試験を行なつた。まず、
1wt％のβ−Ｄグルコース溶液（PH7.0リン酸塩緩
衝液）10mlを、上記この発明の固定化ガラスビー
ズ１ｇを入れたビーカーに注入し15分間緩やかに
撹拌して反応させ、反応液から９mlを採取して５
％ヨウ化カリウム溶液１mlを添加した。この操作
により、酵素反応により発生した過酸化水素でＩ
がI₂（aq）に酸化される。このI₂をボルタンメト
リー法により還元し、還元波を測定することによ
りI₂量が定量でき、ひいては固定化ガラスビーズ
における酵素の固定化の程度すなわち活性の程度
がわかる。 従来のガラスを担体として前記と同様にして得
た固定化ガラスビーズとこの発明の固定化ガラス
ビーズとのボルタンメトリー法による結果を表１
に示す。

【表】 このようにこの発明の固定化ガラスは、従来の
ガラスを担体とするものに比して明らかに酵素活
性が高いことが判る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 担体として、金属アルコキシドの加水分解で
   生成する水酸化金属化合物及び／又はその縮合物
   からなるカラス様ゲル体を用い、このガラス様ゲ
   ル体にシランカツプリング剤残基を介してペプチ
   ド含有化合物を固定化してなるペプチド含有化合
   物の固定化ガラス。 ２ 金属アルコキシドの一種又は二種以上を加水
   分解して生成するゲル状物を単離し、これにアミ
   ノ基、チオール基又はエポキシ基から選ばれる官
   能性基を有するシランカツプリング剤を反応さ
   せ、その反応物にペプチド含有化合物を固定化す
   ることを特徴とする固定化ガラスの製造法。