JPS58192829A - 固定化生理活性物質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、固定化生理活性物質及びその製造法に関し、
更に詳しくは、高いリガンド濃度を有し、かつ、安定で
ある固定化生理活性物質及びその製造法に関する。

蛋白質、ペプチド、アオノ酸及び生体アンン等のアミノ
基を有する生理活性物質Ｏ不溶化又は固定化には糧々の
方法があ）、これらは固定化物の利用目的により適宜選
択される。

生理化学工業的に利用価値の高い、特異的吸着剤、固定
化酵素及び特異的−過膜等を目的とする場合には、包理
法がよく用いられている。

しかしながら、との包理法には、 （１）固定化生理活性物１ｉＫ作用される移動相中の物
質の分子量が低くなければならない、（２）固定化され
る物質が高分子の場合は％に１ケージとなる不溶性高分
子が機械的に刹い構造とな夛易い、 （３）、大量生産が困離である、 等の欠点がある。

これらの欠点を鱗消した方法としては、リガンドを共有
結合によシネ溶性担体に固定化する方法があり、特に１
高分子基質に作用する酵素、高分子物質と結合する免疫
性蛋白質及び高分子ホルモンとその受容体等の生理活性
物質の場合には、より優れた固定化方法といわれている
。

この方法に用いる不溶性担体としては、非特異的吸着が
な（、結合性の基へと活性化される官能基を有する物理
的・化学的に安定な高分子が好ましい。このうち、バッ
チ法又はクロマトグラフィーに用いるアフィニティー吸
着剤の場合には、流速が大きく、目づまねがなく、かつ
、吸着容量を大きくできるものがよく、固定化酵素とし
て用いる場合には、基質との接触面積を大きくして、触
媒効率を高めるために、多孔質のゲル状物質の粒子が好
オしい。このようなものとしては、球状に成型されたア
ガロースゲル、セルロースゲル、ポリアクリルアミドゲ
ル、ポリとニルゲル等が実用化されている。

共有結合による固定化方法としては、臭化シアンを用い
る方法（以下、ｒｃＮＢｒ？１Ｊという。）、すなわち
、担体上の水酸基をシアン酸エステル又はイミドカルボ
ネートに変換（活性化）シ、これにアＺド基を有するリ
ガンドやスペーサー（リガンドを担体から離してリガン
ドによる吸着を容易にするための腕）をインワレア架橋
により結合させて固定化する方法がある。この方法は、
比較的容易に固定化を行なうことができるのでよく用い
られるが、非特異的吸着が起こる場合が多く、また、一
度固定化されたリガンド０結合が不安定なために、リガ
ンドが漏出することが多いという欠点がある。すなわち
、この方法の架橋部に形成されるイミド基は、そのｐＫ
ａが１０．４で中性附近では陽性に荷電しておシ、一方
、通常の蛋白質は中性附近では陰性に荷電しているため
静電気的相互作用により非特異的吸着が起こる。−！た
、架橋部を形成しているイソウレア結合は分解さね７易
く、特に、アルカリ性では著しい。

これらの欠点を鱗消するために考案された方法のうち、
特に有効な方法の一つとして、エポキシ活性化担体から
出発する方法（以下、「エポキシ活性化法」という。）
〔有慢合成化学、第３８巻。

１２８〜１３８負（１９８０年）〕がある。このエポキ
シ活性化法は次のような利点を有する。

（１＞　　ＣＮＢｒ法にみられるような静電気的非％異
的吸着がない。

（２）　　自動的にスペーサーが入る。

（３）　　アミノ基又は水酸基を有するすがンドとの結
合であるアルキルア２ノ結合又はエーテル結谷が安定で
あり、ＣＮＢｒ法にみられるような漏出が少ない。

（４）　　担体高分子間に石千の架橋が起こり、担体が
強化される。

（５，活性化の椙度をチオ硫酸ナトリウム法により測定
することができる。

しかしながら、このエポキシ活性化法には、リガンドを
結合させる際に、嵩温のアルカリ性条件下において長時
間反応させなくてはならないという欠点がある。

アミノ基を有する物質の固定化方法として、多塘類の構
成塘残基のジオール構造を過ヨウ素酸により酸化し、生
ずるアルデヒド基に１水素化ホク素す）　ＩＪウムの存
在下において、アミン基を有する物質を固定化する方法
（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第２０巻。

１０６１〜１０６５頁（１９７１年）〕が知られている
。

しかしながら、この方法には、 （１）スペーサーが入らない、 （２）担体の構造が弱くな′ふ、 （３）　　リガンド濃度が低い、 等の欠点がある。

すなわち、本発明は前述した従来の固定化方法の欠点を
解消した本ので、穏和な条件で行なうことのできる生理
活性物質の固定化方法及び高いリガンド濃度を有する新
規な固定化生理活性物質を提供することを目的とする。

本発明者は、先に１工ポキシ活性化担体をアンモニアで
アミン誘導体とした後、無水コハク酸で処理し、スクシ
ニルアミノ誘導体とし、これに、カルボジイミドとアミ
ン基を有するリガンドとを作用させてリガンドの固定化
を行なう方法〔有機合成化学、第３８巻、１２８〜１３
８頁（１９８０年）；Ｊ　、　Ｂｉ　ｏｃｈｅｍ　、、
第８７巻、　５３５〜５４０真（１９８０年）〕を発明
し、一応の成果を得たが、水溶性カルボジイミドによる
カップリング反応ではチャツプマン転位等の副反応の起
こる可能性があり、また、最適酸度であるｐｉ（４，５
においても、さらに高い水素イオン濃度の条件下ではな
おさら、リガンドが重合する副反応が起こり易く、固定
化物の収率は満足なものとはいえない。また、反応させ
ている間、田を調整する必要があり、しか屯、反応時間
がかｔり唾く、通常１２時間を要する。

本発明者らは、前述の問題点を解消するため鋭意研究を
重ねた結果、アミノ基若しくはイミノ基を有する不溶性
高分子又はアに）化不溶性高分子とジアルデヒド化合物
とを反応させて得たアルデヒド活性化不溶性高分子を、
水素化シアノホワ素ナトリクムの存在下において、アき
ノ基又はイミノ基を有する生理活性物質と反応させるこ
とＫより、穏和な条件による固定化によって、高いリガ
ンド濃度を有し、かつ、安定である固定化生理活性物質
が得られることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明の固定化生還活性物質は、次式（１）
　：　Ｘ−ＮＨ−（ＣＨ，）ｎ　−ＮＨ−Ｍ　　　　　
（Ｉ）（式中、Ｘ−ＮＨはその７２）基若しくはイミノ
基を介して結合している生理活性物質残基を：ＮＨ−Ｍ
はそのアミノ基若しくはイミノ基を介して結合している
不溶性高分子残基又はアンノ化されたエポキシ活性化不
溶性高分子残基を；ｎは２〜１０の整数をそれぞれ表わ
す。）で示されるものである。

また、本発明のもう一つのものである固定化生理活性物
質の製造法は、アミノ基及び／若しくはイミノ基を有す
る不溶性高分子；又は水酸基を有する不溶性高分子をエ
ピノーロヒドリン又はビスオキ／ラン化合物で活性化し
た後、アンモニアで処理して得たアミノ化不溶性高分子
：を水素化シアノホワ素ナトリワムの存在下において、
次式（厘）　：　　ＯＨＣ（ＣＨ，）ｎ　−２ＣＨＯ（
ｆ）（式中、ｎは２〜１０の整数を表わす。）で示され
る直鎖状ジアルデヒド化合物と反応させて、 次式　（ｊ）　　：　　　ＯＨＣ（ＣＨｚ）ｎ−ｓ　　
　ＮＨＭｉ　　　　　　　（厘）（式中、ＮＨ−Ｍ、は
そのアミノ基若しくはイミノ基を介して結合している不
溶性高分子残基又はアミン化不溶性高分子残基ｔ−ａｎ
は２〜１０の整数をそれぞれ表わす。） で示されるアルデヒド活性化不溶性高分子を得、次いで
これを水素化シアノホワ素ナトリワムの存在下において
、アミノ基及び／又はイミノ基を有する生理活性物質と
反応させることを特徴とするものである。

以下、本発明を詳細に税関する。

本発明に用いるアミノ基及び／又はイミノ基を有する生
理活性物質としては、コンカナノくリンＡ（以下、［Ｃ
ａｎ　Ａ　Ｊという、）、クシ血清アルプ２ン（以下、
「Ｂ８ＡＪという。）、ｒ−グロブリン（抗体）、酵素
、植物性血球凝集素（ＰＨ人）、フィブロネクチン、プ
ロティン人等の蛋白質；キニン、副腎皮質刺激ホルモン
放出因子（ＣＲＦ）、カルシトニン、ダルカゴン等のペ
プチド：種々の７ンノ酸；ヒスタンン、ドパｉン、グル
コサイン、トリプタミン勢の生体アミン；等が挙げられ
るが、この中には、種々のホルモンとその受容体も含ま
れる。

アミノ基及び／又はイミノ基を有する不溶性高分子とし
ては、アきノエチルアガロース、アミノへキシルアガロ
ース等のアミノアルキルアガロース：並びにアミノエチ
ルセルロース、アミノエチルポリアクリルアンド等が挙
げられる。

水酸基を有する不溶性高分子としては、アガロース、セ
ルロース、キチン、ｉブタン、ポリアクリルアミド系樹
脂、ポリビニルアルコール系樹脂等が挙げられる。

これらの不溶性高分子は、目的に応じて種々の剤又は固
定化酵素に用いる場合には、吸着容量を高めた沙、接触
面積を大きくするため、多孔質の粒状のものが好ましく
、希薄な生理活性物質溶液の処理に用いる場合には、多
孔質の膜状のものが好ましい。

本発＃４ｔｌ：係る固定化生理活性物ノｆは、次のよう
にして製造することができ石。

担体として、アミノ基及び／又はイミノ基を有する不溶
性高分子を用いる場合には、先ず、これを水素化シアノ
ホヮ素ナトリクムの存在下において、直鎖状ジアルデヒ
ド化合物と反応させてアルデヒド活性化不溶性高分子と
する。この蒔、溶媒としては水が用いられ、その量は不
溶性高分子１２当たり１０〜１００−■範囲内であるこ
とが好ましい。用いる水素化シアノホヮ素す）　ＩＪヮ
ムの量は、不溶性高分子１ｆ轟たり１００４以上であわ
ばｊＬｎｄｆ、４１に２００〜１０００ｖの範囲内であ
ることが好ましい。直鎖状ジアルデヒド化合物としては
、一般には、炭素数２〜１０のもの、例えば、グリオ中
す−ル、プロパンジアール、ブタンジアール、グルタル
アルデヒド（ペンタンジアール）、デカンジアール等が
単独で又は二種以上の混合物として用いられる。以上の
条件で、４〜１００℃、好ましくは３７〜８０℃におい
て１〜１００時間、好ましくは１２〜４８時間反応させ
るととＫよシ、アルデヒド活性化不溶性高分子を得るこ
とができる。

次に１このアルデヒド活性化不溶性高分子を、水素化シ
アノホウ素ナトリワムの存在下において、前記生理活性
物質と反応させることによシ、目的とする固定化生理活
性物質を得ることができる。

この時、用いる溶媒としては、リン酸緩衝液、酢酸緩衝
液、ホワ酸緩衝液、炭酸緩衝液等が挙げられ、その−は
６〜９の範囲内であることが好ましく、その量はアルデ
ヒド活性化不溶性高分子１を当たり５〜５０ｍｇの範囲
内であることが好ましいう用いる水素化シアノホウ素ナ
トリワムの量は、アルデ曳ヒト活性化不溶性高分子１１
当なｆｉ１００１１９以上士あればよいが、！に２００
〜５００岬の範囲内であることが好ましい。生理活性物
質の量は、その種類によって異なるが、一般には、アル
デヒド活性化不溶性高分子１を当たり２００〜２０００
１１９の範囲内である。以上の条件で、０〜１００℃、
好ましくは４〜４０℃において１〜７２時間、好ましく
は１２〜４８時間反応させることにより、目的とする固
定化生理活性物質を得ることができる。

担体として、水酸基を有する不溶性高分子を用いる場合
には、既知の方法【有機合成化学、第３８巻、１２８〜
１３８頁（１９８０年）〕　に従い、エピクロルヒドリ
ン、エピブロムヒドリン等のエビハロヒドリン；又は、
エチレングリコールジグリシジルエーテル、１，３−プ
ロパンジオールジグリシジルエーテル、１．４−ブタン
ジオールジグリシジルエーテル、ｌｌ５−ベンタンジオ
ールジグリシジルエーテル、１．６−ヘキサンシオール
ジグリ７ジルエーテル等のビスオキシラン化合物；を用
いて、前記不溶性高分子をエポキシ活性化させた後、ア
ンモニアで処理して得たアミン化不溶性高分子を前述と
同様に処理することにより、目的とする固定化生理活性
物質を得ることができる。

本発明の製造法によれば、穏和な条件下で、かつ、反応
中のｐＨ調整を行なうむとなく、シか屯、従来法に比し
短い反応時間で目的とする固定化生理活性物質を得るこ
とができる。さらに１得られた固定化生理活性物質は、
従来のものに比し、３〜２００倍のリガンド濃度を有し
ている。

以下、実施例によシ本発明を更に詳細に説明する。

実施例１ （１）　　アミノ化アガロースの調製 アガロースとしてファルマシア社製のセファロース６Ｂ
及びセファロース４Ｂを用いた。グラスフィルター上で
水でよく洗浄後、吸引−過したアガロース２０９をフラ
スコに入れ、水３０−１２ＭＮａＯＨ水溶液１３−及び
エピクロルヒドリン３−を順次加えた。懸濁液を４０℃
のインキュベーター中で２＠間損盪後、グラスフィルタ
ー上で水で充分に洗浄してエポキシ活性化アガロ−ｘｔ
得ｔ。

このエポキシ活性化アガロースに導入されたエポキシ基
の量ｔ−Ｎａ、８．Ｏｓを用いる中和滴定法により測定
したところ、セファロース６Ｂでは、乾燥重量１ｆ当た
り約７００．ａｍｏｌｅ、　＊７アｔｔ−ス４Ｂでは、
間約５００μｍｏｌｅのエポキシ基が導入されていた。

このエポキシ活性化アガロース１容に一アンモニア水１
．５容を加え、４０℃のインキュベーター中で１＃間半
搦盪した。反応後、グラスフィルター上で水で充分に洗
浄してアミン化アガロースを得た。このアミノ化アガロ
ースを２．４．６−　）りニトロベンゼンスルホン酸で
処理したｆ、５０４６酸で可溶化し、３４０ｎｍにおけ
るトリニトロフェニルアミンの吸収を測定することによ
り、導入されたアミノ基の責を算出したところ、セファ
ロース６Ｂでは、乾燥重量１を当たり約６００　ｐ　ｍ
ｏｌｅ。

セファロース４Ｂでは、間約４００μｍｏｌｅのアミノ
基が導入されていた。

（２）固定化ＣｏｎＡの調製 （１１で得たアぢ）化アガロース（セファロース４Ｂ）
１ｆＫ２５優グルタルアルデヒド水溶液１−及び水素化
シアノホウ素ナトリウム８２１ｍ９を加えて、４０℃の
インキュベーター中で２時間振盪後、グラスフィルター
上で水で充分に洗浄してアルデヒド活性化アガロースを
得た。

このアルデヒド活性化アガロース１　ｔ　Ｋ　ｓ　ＣＯ
口λ１００ｖ及びメチｐ、、　−ａ　−Ｄ　−？ンノシ
ド１１０ＭＩＰを溶解した０、２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７，０）２ｍを加え友後、水素化シアノホウ素す）　Ｉ
Ｊワム２４１９を加えて、４℃のインキュベーター中で
２日間撮盪した。反応終了後、上清を除き、０．２ＭＩ
Ｊｙ酸緩衝液で充分に洗浄して、Ｃｏｏ人結合アガロー
スを得た。

（３）　　リガンド濃度の測定 上清及び洗浄液中の非結合残存ＣｏｎＡＯ１を、その２
８０１ｍにおける吸収の測定値より算出することによっ
て、アガロースに結合したＣｏｎＡＯ量を算出した。尚
、対照として、ＣＮＢｒ法によシアガロースに結合させ
た酵素〔千畑一部外著；１アフィニティークロマトグラ
フィー２，４０頁。

東京、講談社（１９７８年）〕（対照１）、過ヨワ素酸
酸化法により各種多糖に結合寧せたＢ　８Ａ［Ｉｍｍｕ
ｎｏ−１ＯｇＹ＋第２０巻、　１０６１〜１０６５頁（
１９７１年）〕（対照２）及びヒドラジド誘導体に結合
させたＢ８Ａ［Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　、第８巻
、　４０７４〜４０８２頁（１９６９年）〕（対＠３）
を用いた。結果を第１表に示す。

第１表 表から、本発明の固定化生理活性物質は従来の本のに比
し高いリガンド濃度を有することがわかる。

実施例２ （１）固定化Ｂ８ＡＣ）；、ｌｉ製 実施例１（１）と同様に処理することにより得たアミン
化アガロース（セファロース４Ｂ）Ｉｆ（ｊ！１重量）
に２５嘔グルタルアルデヒド水溶液１−及び水素化シア
ノホウ素ナトリウム８２岬を加えて、４０℃のインキュ
ベーター中で２時間損盪後、グラスフィルター上で水で
充分に洗浄してアルデヒド活性化アガロースを得た。

仁のアルデヒド活性化アガロース０．５ｔに、８８人５
０〜を溶解した０、２　Ｍリン酸緩衝液（田７．０）１
ｍを加えた後、水素化シアノホワ素ナトリウム１２■を
加えて、３７℃のイン今一ベーター中で一夜振盪した。

反応終了後、上清を除き、０．２　Ｍ　ＩＪン酸緩衝液
で充分に洗浄してＢ８Ａ結合アガロースを得た。

（２）　　リガンド濃度の測定 上清及び洗浄液中の非結合残存ＢＳ人の量を、その２８
０　ｎｍにおける吸収の測定値よ）算出することによっ
て、アガロースに結合したＢ８Ａの量を算出した。尚、
対照としては、実施例１（３）と同様の対照１〜３を用
いた。績果を第２表に示す。

第２表 表から、本発明の固定化生理活性物質は従来のものに比
し高いリガンド濃度を有すること力ｆわ妙λる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　次式：　　Ｘ　−Ｎｌ（−（ＣＨ，）ａ−ＮＨ−Ｍ
   （式中、Ｘ−ＮＨはそのア建）基若しくはイずノ基を介
   して結合している生理活性物質残基を：ＮＨ−Ｍはその
   アよノ基若しくはイ゛イノ基を介して結合している不溶
   性高分子残基又はア建ノ化されたエポキシ活性化不溶性
   高分子残基を；ｎは２〜１００整数をそれぞれ表わす、
   ）で示される固定化生理活性物質。 意　アきノ基及び／又は４２ノ基を有する不溶性高分子
   を、水素化シアノホク素ナトリワムの存在下において、 次式：　　ＯＨＣ−（ＣＨＩ）ｎ−＊　−ＣＨｏ（式中
   、ｎは２〜１０の整数を表わす、）で示される直鎖状ジ
   アルデヒド化合物と反応させて、 次式：　　Ｏｎｅ　−（ＯＨ，）。−、−ＮＨ−Ｍ。 （式中、ＮＨ−Ｍ、はそのアミノ基又はイ々）基を介し
   て結合している不溶性高分子残基なｉｎは２〜１００！
   １数をそれぞれ表わす。）で示されるアルデヒド活性化
   不溶性高分子を得、次いでこれを水票化シアノホワ素ナ
   トリワムの存在下において、アミノ基及び／又はイミノ
   基を有する生理活性物質と反応さ５せることを特徴とす
   る固定化生理活性物質の製造法。 ３　水酸基を有する不溶性高分子をエピノ・ロヒドリン
   又はビスオキシラン化合物で活性化した後、アンモニア
   で処理して得たアミン化不溶性高分子１〜１、 を、水素化シアノホク素ナトリワムの存在下において、 次式：　　ＯＨＣ−（ＣＨＩ）ｎ−ｔ　　ＣＨＯ（式中
   、ｎは２〜１０の整数を表わす。）で示される直鎖状ジ
   アルデヒド化合物と反応させて、 次式：　　０ＨＣ−（ＣＨＩ）、、、１−ＮＨ−Ｍ！（
   式中、ＮＨ−Ｍ、はアミノ化不溶性高分子残基を：ｎは
   ２〜１０１２）！１数をそれぞれ表わす。）で示される
   アルデヒド活性化不溶性高分子を得、次いでこれを水素
   化シアノホワ素す）　リウムの存在下において、アミノ
   基及び／又はイオノ基を有する生理活性物質と反応させ
   る仁とを特徴とする固定化生理活性物質の製造法。