JPH10506788A - 基質上に生物材料を固定化する方法 - Google Patents
基質上に生物材料を固定化する方法Info
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Abstract
(57)【要約】
生物材料、たとえば酵素、微生物、細胞、小器官等々を、結合- 活性なNHx基を有するSi3N4表面を備えた基質上に固定化するために、一方では生物材料結合官能基を、そして他方ではNHx- 反応性基を有するヘテロ官能性架橋剤を使用する。固定化基質は厚さ10〜1000nmのSi3N4-層によって形成され、この層はSiH4/NH3からCVDによって分離され、特に希酸での加水分解による表面洗浄によって結合- 活性なNHx基で被覆されるのが好ましい。有利には、先ずNH2-反応性アルデヒド、エステル、ハライド、エポキシド、イミン又はイソシアナート基を有するヘテロ二官能性架橋剤をSi3N4-表面と反応させ、ついて結合しなかった過剰の架橋剤を除去した後、生物反応基によって生物材料に結合させる。
Description
【発明の詳細な説明】
基質上に生物材料を固定化する方法
本発明は、Si3N4表面を有する基質上に生物材料を固定化する方法に関し、
その方法に於ては上記基質と生物材料が結合媒体を介して共有結合する。
生物材料の固定化は、生物活性の利用にとって、特に液体との接触の場合に極
めて重要である。これは処理工学で及び分離操作に於ける分析で又は生物機能の
循環利用に対して大きな役割を果たす。他の重要な分野は、薬学- 及び医学領域
並びに環境工業に見られる。
E.Tamlya等によってJ.Mol.Catal.43(1988)293-301中に、薄い銀層で被覆
された石英結晶にウレアーゼを固定化することが記載されている。この結晶の表
面上に硝酸ケイ素をスパッタリングする。処理された結晶を24時間空中にさら
し、洗滌し、空気浴中で乾燥する。その後蒸発がγ−アミノ- プロピル- トリエ
トキシシランを用いて、次いでグルタミンアルデヒドを用いて行われる。この様
にして得られた厚さ約I00Aの薄い有機表面薄片は細孔が少ないと一般に呼ば
れている。シランとアルデヒドの結合を、全く観察することかできなかった。
水溶液から薄片に堆積された酵素は、遊離ウレアーゼに対してほんの2.25
%の活性しか有しない。この固定化法は完全に満足のいくものではない。
本発明の対象は、生物材料- 固定化の新しいタイプであり、この方法は僅かな
数の処理層で十分であり、再生産可能な方法で比較的安定な生成物を生じる。
上記タイプの基質上に生物材料を固定化する本発明の方法は、実質上次のこと
を特徴とする:固定化基質上でSi3N4-表面を結合活性NHx- 基で被覆し、こ
の基と一方でNH2-反応性アルデヒド- 、エステル- 、ハロゲニド- 、エポキシ
ド- 、イミン- 又はイシアナート基を有し、他方で生物材料- 反応性基を有する
ヘテロ二官能性架橋剤が反応し、次いで生物材料がこの反応性基と結合する。
本発明のその他の特徴は、請求の範囲から明らかである。
本発明は酵素、微生物、細胞、抗体、抗原、小器官又は組織切片等々を半導体
基体、薄片、被膜面又は顆粒、構造体(Bauteil)、特に無機性タイプのものに固
定化するのに適し、使用領域で上述した様に有用である。
硝酸ケイ素- 表面を、特にCVD- 技術によってSiH4/NH3-混合物から分
離する(A.Garde等、ESSDERC 1994−1994年9月11日〜15
日 Ed.C.Hill & P.Ashburn参照)。この表面は空気から酸素を取り込み、水
分の影響でSi- OH、Si- NH及びSi- NH2基の形成下に加水分解する傾向
がある。これらの基は、反応性官能基として架橋剤を介して窒化物表面に生物材
料を結合するのに使用することができる。
本発明の方法に於て、希釈されたフッ化水素酸での処理によって酸化物から遊
離されるSi3N4-表面を使用し、二つの層で共有酵素結合が行われるのが特に好
ましい。その場合1つの官能基が先ず窒化物表面のNH2-基又はNH- 基と反応
し,もう1つの官能基が引き続いてたん白質と反応するという架橋剤が選ばれる
。あるいは架橋剤を先ずたん白質と反応させ、次いで生成物をSi3N4-表面と反
応させることもできる。
架橋剤のNH2-反応性基として、特にアルデヒド- 、ハロゲニド- 、エポキシ
ド- 、イミド- 又はイソシアナート官能基が挙げられる。更にアミノ基との反応
可能性の多数は、たとえば米国特許第5,234,820号明細書中から明らか
である。実施にあたり、“Immuno Technology Catalog & Handbook”1992/
3中に Dierce 社の種々の化合物がすでに提示されている。
生物材料との反応に対して、次の架橋剤一官能基を使用する。すなわちこれは
酵素の官能基を介して特に末端カルボキシ- 基又は側鎖基、たとえば−SH、−
COOH又は−OH基又は芳香族環と共有結合することができる。したがって本
発明によれば、生物材料の窒化物表面への結合がヘテロ二官能性架橋剤の使用下
に行われる。この際ヘテロ二官能性架橋剤として、2個の基本となる化学的に同
一種類の官能基が、異なる反応成分に対して異なる反応性を示す架橋剤も考慮に
入れねばならない。
ヘテロ二官能性架橋剤を、段階的にSi3N4-表面と、次いでたん白質と反応さ
せる。引き続き個々に生じるアミノ特異的反応が室温で中性ないし弱アルカリ性
pH- 値で進行する。温度及びpH- 値の増加は、反応速度を上昇させ、しかも
架橋剤の加水分解速度も増加する。使用される緩衝液はアミンも、架橋剤の官能
性基と反応することができるその他化合物も含有してはならない。
N- ヒドロキシスクシンイミドエステルは第一アミンと特異的に反応する。N
- ヒドロキシスクシンイミドの離脱下に、第一アミンと使用されたエステルの残
基との間にアミド結合を生じる。水溶性同族物を使用しない限り、この官能基を
有する架橋剤を先ず少量の有機溶剤(たとえばDMSO)中に溶解し、その時初
めて水性緩衝液中で最終濃度に希釈しなければならない。緩衝液のイオン強度は
、塩析作用を避けるためにあまり高くなってはならない。弱アルカリ性pH- 値
(7〜9)は、第一アミンが非プロトン化された状態にあることを保証する。
アルデヒドは強く還元するカルボニル基を有する。これが第一アミンと水の離
脱下に反応する。
第一アミンとイミドエステルとの反応は、8〜9のpH- 範囲内で進行する。
その際エステルを離脱し、第一アミンはイミド基と共にグアニジン化合物を形成
する。
たん白質との結合は、架橋剤の第二の更に遊離する官能性基の協力によって行
われる。これは特異的に又は非特異的にたん白質のチオール、カルボキシル- 又
はカルボヒドラート基と反応することかできる。
架橋剤が第二官能性末端としてチオール特異性基、たとえばマレイミド、活性
化されたハロゲニド又はピリジルスルフィドを有する場合、結合すべきたん白質
は遊離のスルフヒドリル基(一般にシスティン残基のもの)を有していなければ
ならない。これを使用してはならない場合、これをたん白質ジスルフィドの還元
によって生じることができる。あるいはたん白質の第一アミンを、スルフヒドリ
ル基を使用して変性することができる(トラウツ(Trauts)試験)。この基の酸化
を回避するために、使用される緩衝液を脱ガスしなければならない。錯化剤ED
TAの添加は、万一溶液中に存在する金属による酸化を阻止する。
マレイミドは弱酸性ないし中性媒体(pH6.5〜7.5)中で反応する。一
方ハロゲニド及びピリジルジスルフィドに対しては、7より大きいか又は7に等
しいpH- 値が好ましい。
解糖されたたん白質を、ヒドロキシ基を介して糖側鎖と架橋することかできる
(たとえばNaIO4を用いて)アルデヒドとしなければならない。次いで生じ
るカルボニル基はヒドラジドと反応して、セミカルバゾンを生じる。
カルボキシ- とアミノ基との間の直接結合の可能性は、カルボジイミドとの反
応によって生じる。酸性pH- 範囲(4〜5)で、カルボジイミドはカルボキシ
基を活性化されたエステル結合へ移行させる。これは第一アミンとアミド結合の
形成及び尿素の離脱下に反応する。
架橋剤の使用に於て、その非- アミノ特異性官能性末端は、光活性化しうる基
(たとえばアジドフエニル)を有するので、固定化全体を暗室中で赤色灯下に実
施しなければならない。アジドフエニルのアジド基を、波長265〜275nm
の光照射によって活性化する。
本発明の方法は、種々の生物材料を、通常の種類の基質又は担体に結合するた
めに使用することができる。これらを下記に示す様に特にペニシリンセンサーの
例でテストする。その際これは添付された図面と関連する。これらは図解されて
いる。
図1 センサー原則(測定装置)
図2 ペニシリン10-4ないし10-1モル/l濃度に対する特有の測定曲線
図3 本発明のセンサーの検定曲線
例:
p- 又はp+- 組み込まれたケイ素ウエハー(1mOhmcm−30オームOhmcm)上
に先ず厚さ5〜100nmの電気非伝導性二酸化ケイ素層を拡散炉中で700〜
1200℃(この場合1000℃で)の熱乾燥酸化によって生じさせる。更に同
様に厚さ10〜100mmの非伝導性硝酸ケイ素を、気相(DECVD)中で化
学沈澱析出によって施す。反応ガス中の割合SiH4/NH3は2/4、基質温度
は200〜500℃(この場合300℃)、沈澱析出の間の圧力は1〜3トル(
この場合1.5トル)である。焼き戻し工程をN2-雰囲気下に(5〜60分間
、700〜1000℃で)行う。最後に非極性基質部位をオーム接触(たとえば
10〜1000nmAl、Au)で処理する。使用される材料を、基本圧<10-5
で減圧熱蒸発によって適用する。沈澱析出は、0.1〜10mm/sである。
次いでウエハーをRTA- 炉中で150〜500℃(この場合400℃)で、N2
-雰囲気中で可鍛化する。
酵素固定化処理の開始直前に、ウエハーをアセトン、2- プロパノール及び蒸
留水中に超音波浴中で精製し、10〜60秒(この場合30秒)希フッ化水素酸
(1〜10%HF)中で腐食する。
ヘテロ二官能性架橋剤ANB- NOS(N- 5- アジド -2- ニトロベンゾイ
ルオクシスクシンイミド)を使用する場合、これを先ず少量のDMSO中に溶解
し、次いで0.2Mトリエタノールアミン緩衝液(pH5〜9)を用いて最終濃
度0.5〜10mMに希釈する。この溶液をSi3N4-表面に適用し、5〜50分
間室温でインキュベートする。より低い温度の場合、より長くインキュベートし
なければならない。硝酸ケイ素表面に結合しない分子をトリエタノールアミン緩
衝液(TEA)で洗浄して除去する。その後酵素(Bacillus Cereus から得られ
たペニシリナーゼタイプ1、シグマP0389)をアミノ基不含緩衝液(たとえ
ばTEA、特にTRIS- 又はグリシン緩衝液ではない)中に溶解し(1000
〜5000単位/ml)、架橋剤で予め処理された硝酸ケイ素表面上に付与する
。4〜60℃の温度、特に室温で1〜240分(この場合15分)のインキュベ
ーション時間の後に、酵素分子と架橋剤のまだ遊離する官能基との結合を波長範
囲320〜350nmの光線によって誘発する。固定化処理の終了後、表面硬化
性ペニシリンセンサーを0.1M TRIS- 緩衝液(pH7〜8)及び蒸留水
で洗浄し、少なくとも10分間空気中で又はN2-又は不活性ガス雰囲気下で乾燥
する。
この方法で製造された電界効果センサーを用いて、水溶液中でペニシリン濃度
測定を行う。
図1中に、測定装置を図解する。ケイ素基質1、単離層2(二酸化ケイ素と硝
酸ケイ素)、架橋剤層3及び酵素層(ペニシリン層)4から成る、本発明の製造
された電界効果センサーを測定セル中で統合する。測定セルを10-5〜1モル/
l濃度のペニシリンGを含有する測定水溶液で満たす。測定溶液6中に基準電極
(たとえばAg/AgCl)7を浸す。電位を基準電極7とケイ素基質への接触
電極8を介して読み取る。
図2中に、10-4〜10-1モル/lペニシリン濃度でCONCAP(CON st
ant CAPacitance)-Modus に於て採用される特有の測定曲線を示す。ペニシリ
ンGナトリウム塩(シグマP3032)を10mMトリス- HCl緩衝液、pH
7中で溶解する。上昇するペニシリン濃度と共に、生成されるペニシロイン酸の
濃度及びそれと同時に水素イオンの濃度がpH- 変換器として作用する硝酸ケイ
素表面のすぐ近くで増加する。これは界面の硝酸ケイ素/電解質での電位のプラ
ス又はマイナス電位値への変化を生じる。時間に対するプロットにより酵素反応
の濃度に依存する電位推移を観察することができる。しるしが付けられた時間に
測定溶液の変換が行われる。
図3は図2から求められた化学推移グラフを示す。これは本発明に従って製造
された電界効果センサーの検定曲線である。電位差分析キモ- 又はバイオセンサ
ーの鋭敏度に関する記載を、基準となるネルンストの関係に関してこの曲線の線
状域で、すなわちペニシリン濃度と適合する電位の間の対数による関係が生じる
範囲で行う。この範囲は、本発明に従って製造されたpペニシリン2.3〜3.
3(0.5〜5mMに相当)のセンサーにある。鋭敏度はデケードあたり50m
Vである。
線状測定範囲の正確な位置及び絶対鋭敏度は緩衝液組成の選択、その濃度、す
なわち緩衝液容量及びpH- 値に著しく左右される。このパラメーターの適当な
選択によって、測定に必要な測定範囲を目的に従って調整することができる。た
とえば線状測定範囲は、IMIDAZOL- 緩衝液(pH7)の使用で2〜20
mMペニシリンであり、HEPES- 緩衝液の場合ほぼ1〜10mMである。p
H- 値の増加は、検定曲線の線状範囲の位置をより高いペニシリン濃度へ移動さ
せ、対応してpH- 値の低下はより低いペニシリン濃度へ移動させる。
本発明により製造されたセンサーは、140日より長い高い貯蔵安定性を有す
る。鋭敏度はペニシリンデケードあたり50mVである。
結合範囲で同種の構造、たとえば本発明で記載した電気容量層構造を示す電界
効果トランジスターの製造は可能である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 シェーニング・ミヒャエル・ヨーゼフ
ドイツ連邦共和国、デー−52428 ユーリ
ッヒ、デュッセルドルファー・ストラー
セ、34
(72)発明者 フェッター・ヨアヒム
ドイツ連邦共和国、デー−50678 ケルン、
ヨーゼフストラーセ、34−36
(72)発明者 カウプ・ウルリヒ・ベンジャミン
ドイツ連邦共和国、デー−52062 アーヒ
ェン、ザールストラーセ、86
(72)発明者 コルドス・ペーター
ドイツ連邦共和国、デー−52428 ユーリ
ッヒ、トリーレル・ストラーセ、4
(72)発明者 リュート・ハンス
ドイツ連邦共和国、デー−52076 アーヒ
ェン、オイペナー・ストラーセ、299ベー
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.結合媒体を介して生物材料を共有結合させるための、Si3N4-表面を有する 基質上に生物材料を固定化する方法に於て、固定化基質上のSi3N4-表面を結合 活性NHx- 基で被覆し、この基と、一方ではNH2-反応性のアルデヒド- 、エ ステル- 、ハロゲニド- 、エポキシド- 、イミン- 又はイソシアナート基を有し 、他方で生物材料- 反応性基を有するヘテロ二官能性架橋剤を反応させ、次いで 生物材料をこの反応性基と結合させることを特徴とする、上記固定化方法。 2.生物材料と結合する架橋剤の反応性基又は官能基が、たん白質の末端官能基 又は側鎖官能基と反応する基である、請求の範囲1記載の方法。 3.カルボキシル- 、スルフヒドリル- 又はヒドロキシ基と反応するか又は芳香 族環と結合する生物材料- 活性基を有する架橋剤が選ばれる、請求の範囲1又は 2記載の方法。 4.固定化基質上で厚さ10〜1000nmのSi3N4-層をCVDによってSi H4/NH3混合物から分離させ、加水分解による表面洗浄によって結合活性なN Hx- 基で被覆する、請求の範囲1ないし3のいずれかに記載の方法。 5.生物材料として酵素、微生物、細胞、抗体、抗原、小器官又は組織切片を半 導体基体、薄片、被膜面又は顆粒、特に無機質のタイプのものに固定化する、請 求の範囲1ないし4のいずれかに記載の方法。 6.架橋剤による結合のために、先ずこの架橋剤を生物材料と反応させ、その後 Si3N4-表面との結合を行う、請求の範囲1記載の方法。
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