JPH10506994A - シグナル−活性表面上に共有結合で固定化された生物材料を有するバイオセンサー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 バイオセンサーのシグナル- 活性表面に生物活性材料、特に酵素の有効な結合を、シグナル活性表面に対して反応性の基Ａ、たとえば−ＯＨ、−ＳＨ又は−ＮH_xと反応する基及び光活性の、生物材料- 反応性基Ｂを有するヘテロ二官能性架橋剤によって達成することができる。公知の基Ｂは、特にアジドフエニル及びアジドサリチル基である。一方ではこの様な基Ｂを、他方ではサクシンイミドエステル基を含有する架橋剤は市場で入手でき、それ故に特に興味深いものである。シグナル- 活性表面は、特に反応性ＮＨ_x- 基を有するＳ₁₃Ｎ₄- 表面であってよく、これは気相から、特に新鮮なＳ_iＯ₂表面のＳ_iＨ₄／ＮＨ₃反応によって得られ、特に希フッ化水素酸で処理して酸化物から遊離する。

Description

【発明の詳細な説明】 シグナル- 活性表面上に共有結合で固定化された生物材料を有する バイオセンサー 本発明は、感知性生物材料と架橋剤によって結合する、場合によりシラン化さ れたシグナル活性表面を有するバイオセンサー、特に電界効果を基本とするバイ オセンサーに関する。 特定分析の選択的検出に酵素反応を利用するバイオセンサーは、すでにかなり 長い間広範囲にわたって開発されている。 原則的にこの様なセンサーは生物材料、たとえば酵素を含有する表面層を有し 生ずる情報を変換器一部材によって変換し、場合により集積電気シグナル処理に よって最後に記録可能な形で得られる。変換器として特に電位差計測の及び電流 滴定の電極、たとえば電界効果構造物等々が挙げられる。 この様な生物材料含有センサーの特別の課題は、高い表面特異性活性を有する センサー表面に固定化法によって、活性の減少をできる限り回避して、生物材料 を十分に、すなわち特に持続的に固定化することである。 感知性生物材料として、種々の形態、たとえば酵素、微生物、細胞、抗体、抗 原、小器官又は組織切片が挙げられる。しかし特に参考文献中に酵素含有バイオ センサーに関する論文があるので、以下に簡単に酵素含有バイオセンサーについ て論ずる。 固定化法として、純粋に吸着付加、ポリマー層中に結合、酵素分子相互の網状 化及び酵素のセンサーへの共有結合が知られている。酵素の主な酸化物のセンサ ー表面への共有結合に関して、これを常法でシラン化（ほとんどアミノアルキル アルコキシシランを用いて）して、次いでグルタルアルデヒドによって酵素のシ ラン化された表面への結合が行われる（Anal．Chim．Acta 235（1991）第89−99 頁参照）。しかし異なる架橋剤による引き続き共有結合と共にＳ_i3Ｎ₄-表面をシ ラン化することはすでに記載されている（R．A．Williams等、Biosensors & Bioelectronics 9（1994）159-67参照）。 これと共にチオール末端化されたシランを、ヘテロ二官能性架橋剤、たとえば Ｎ- ヒドロキシ- スクシンイミドエステル、たとえばＮ- スクシイイミジル -３ -(２−ピリジルジチオ)-ブロピオナート（ＳＰＤＳ）、Ｎ- スクシンイミジル - ｐ- ヨードアセチルアミド- ベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ- スクシンイミジル -４-(ｐ- マール- イミド- フエニル)-ブチラート（ＳＭＰＢ）又はＮ- スクシ ンイミジル -ｍ- マレイミド- ベンゾエート- 誘導体（ＭＢＳ- 誘導体）による 後続のたん白質- 固定化と共に使用するのも有利である。（S．K．Bathia 等、A nal．Biochem．178（1989）408-13参照）。 酵素及び微生物をプラズマ重合によって産生するＳ_i3Ｎ₄-表面へ直接結合する ことは、特開昭６１−０８７６９９号公報（１９８６年）中に記載されている。 これによればグルタルアルデヒド又はジイソシアナートを使用しなければならな い。一又は二官能性架橋剤の及び関係する結合成分の官能基の反応性は、オリゴ マー形成及び結合の多様化を可能にするので、架橋剤- 分子を介してシグナル活 性な表面への生物分子の正確な共有結合は保証されない。 したがって高い選択性及び寿命を有する明確な生成物を生じるセンサー表面へ の生物材料の新規固定化方法を開発することである。 上記方法の本発明のバイオセンサーは、架橋剤が一方でシグナル活性表面に特 異的に反応する基（Ａ）及び他方で光活性な生物材料- 反応性基（Ｂ）を有する ヘテロ二官能性架橋剤によって形成されることを実質上特徴とする。 きる。というのは予め光活性化の回避下に架橋剤と表面との反応を対応する反応 性基を介して行うからである。次いで過剰の（結合されない）架橋剤- 残部の除 去後、生物材料との反応が、対応する露光下に行われる。 表面として特に半導体材料、たとえばゲルマニウム又はケイ素並びに酸化物状 材料、たとえば酸化ケイ素、酸化アルミニウム、酸化チタン等々が反応性の形で 又はシラン化された形で挙げられる。この際特にメルカプト- 又はアミノ基を有 するシラン化層、たとえば二酸化ケイ素上に施される。反応性基、特にＮＨ_x- 基を有するＳ_i3Ｎ₄-表面層も好ましい。これは特にアルデヒド基、エステル基又 はイミドリステル基との結合に対して使用される。 光活性化しうる、生物材料と反応する基として、特に脂環式又は芳香族結合す るニトロ- 又はアジド基が適し、これはたん白質性材料と露光下に反応する。こ れに関して基Ｂとしてアジドフエニル基又はアジドサリチル基を基ＡとしてＮ- ヒドロキシ- スクシンイミドエステル基を有する架橋剤が公知である。（たとえ ば“immunoTechnology Catalog & Handbook”，Pierce社、1992／3；Ｅ34-46参 照）。 波長２６５〜２７５ｎｍの光照射下でアジドフエニル化合物とたん白質の光活 性化反応は、たとえば下記式に従って行われる： Ｒとしてその利用性の点で末端基ＡとしてのＮ- ヒドロキシスクシンイミドエス テル基を有する残基が適し、これはＮＨ_x- 基と次の様に反応することができる 。 ＳＨ- 基と反応する、架橋剤の官能基Ａとしてジスルフィド基が知られている 。 硝酸ケイ素- 表面の形成を、特にＣＶＤ- 技術によってＳ_iＨ₄／ＮＨ₄-混合物 から沈澱析出させて得ることができる（A．Garde等、ESSDERC 1994−1994年 9 月11日〜15日Ed．C．Hill & P．Ashburn参照）。この表面は空気から酸素を取り 込み、水分の影響でＳ_i- ＯＨ、Ｓ_i- ＮＨ及びＳ_i− ＮＨ₂基の形成下に加水分 解する傾向がある。架橋剤の基Ａと反応するこの基は窒化物表面への生物材料の 結合に利用することができる。 本発明のセンサーの実施にあたり希釈されたフッ化水素酸での処理によって酸 化物から遊離されるＳ_i3Ｎ₄-表面を使用し、そのＮＨ₂-基又はＮＨ- 基と架橋剤 が反応し、次いでその光活性官能基Ｂとたん白質とを反応させるのが特に好まし い。 架橋剤のＮＨ₂-反応性基として、特にアルデヒド-、ハロゲニド-、エポキシド -、イミド- 又はイソシアナート官能基が挙げられる。更にアミノ基との反応官 能性の多数は、たとえば米国特許第５，２３４，８２０号明細書中から明らかで ある。 次に個々の生じるアミノ特異的反応が室温で中性ないし弱アルカリ性ｐＨ- 値 で進行する。温度及びｐＨ- 値の増加は、反応速度を上昇させ、しかも架橋剤の 加水分解速度も増加する。使用される緩衝液はアミンも架橋剤の官能性基と反応 することができるその他化合物も含有してはならない。 Ｎ- ヒドロキシスクシンイミドエステルは第一アミンと特異的に反応する。Ｎ - ヒドロキシスクシンイミドの離脱下に、第一アミンと使用されたエステルの残 基との間にアミド結合を生じる。水溶性同族物を使用しない限り、この官能基を 有する架橋剤を先ず少量の有機溶剤（たとえばＤＭＳＯ）中に溶解し、その時初 めて水性緩衝液中で最終濃度に希釈しなければならない。緩衝液のイオン強度は 、塩析作用を避けるためにあまり高くなってはならない。弱アルカリ性ｐＨ- 値 （７〜９）は、第一アミンが非プロトン化された状態にあることを保証する。 アルデヒドは強く還元するカルボニル基を有する。これが第一アミンと水の離 脱下に反応する。 第一アミンとイミドエステルとの反応は、８〜９のｐＨ- 範囲内で進行する。 その際エステルを離脱し、第一アミンはイミド基と共にグアニジン化合物を形成 する。 架橋剤が官能性末端Ａとしてチオール特異性基、たとえばマレイミド、活性化 されたハロゲニド又はピリジルスルフィドを有する場合、結合すべき表面は遊離 のスルフヒドリル基（一般にアルコキシシランのメルカプトアルキル基）を有し ていなければならない。この基の酸化を回避するために、使用される緩衝液を脱 ガスしなければならない。 マレイミドは弱酸性ないし中性媒体（ｐＨ６．５〜７．５）中で反応する。一 方ハロゲニド及びピリジルジスルフィドに対しては、７より大きいか又は７に等 しいｐＨ- 値が好ましい。 本発明は生物材料、特にたん白質性生物材料、特に種々の酵素、たとえば加水 分解酵素、酸化還元酵素、転移酵素、脱離酵素、異性化酵素及びリカーゼ又はシ ンテターゼ、特にペニシリナーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシターゼ、ウロ キナーゼ、アセチルクロリンエステラーゼ、ブチリルクロリンエロテラーゼ又は ラクタートオキシダーゼの結合をバイオセンサーに使用することができる。これ らを下記に示す様に特にペニシリンセンサーの例でテストする。その際これは添 付された図面と関連する。これらは図解されている。 図１ センサー原則（測定装置） 図２ ペニシリン１０^-4ないし１０^-1モル／ｌ濃度に対する特有の測定曲線 図３ 本発明のセンサーの検定曲線 例： ｐ- 又はｐ⁺- 組み込まれたケイ素ウエハー(１mOhmcm−３０オームOhmcm)上に 先ず厚さ５〜１００ｎｍの電気非伝導性二酸化ケイ素層を拡散炉中で７００〜１ ２００℃（この場合１０００℃で）の熱乾燥酸化によって生じさせる。更に同様 に厚さ１０〜１００ｎｍの非伝導性硝酸ケイ素を、気相（ＤＥＣＶＤ）中で化学 沈澱析出によって施す。反応ガス中の割合Ｓ_iＨ₄／ＮＨ₃は２／４、基質温度は ２００〜５００℃（この場合３００℃）、沈澱析出の間の圧力は１〜３トル（こ の場合１．５トル）である。焼き戻し工程をＮ₂-雰囲気下に（５〜６０分間、７ ００〜１０００℃で）行う。最後に非極性基質部位をオーム接触（たとえば１０ 〜１０００ｎｍＡｌ，Ａｕ）で処理する。使用される材料を、基本圧＜１０^-5で 減圧熱蒸発によって適用する。沈澱析出は、０．１〜１０ｍｍ／ｓである。次い でウエハーをＲＴＡ- 炉中で１５０〜５００℃（この場合４００℃）で、Ｎ_2- 雰囲気中で可鍛化する。 酵素固定化処理の開始直前に、ウエハーをアセトン、２−プロパノール及び蒸 留水中に超音波浴中で精製し、１０〜６０秒（この場合３０秒）希フッ化水素酸 （１〜１０％ＨＦ）中で腐食する。 ヘテロ二官能性架橋剤ＡＮＢ- ＮＯＳ（Ｎ−５−アジド -２- ニトロベンゾイ ルオクシスクシンイミド）を使用する場合、これを先ず少量のＤＭＳＯ中に溶解 し、次いで０．２Ｍトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ５〜９）を用いて最終濃 度０．５〜１０ｍＭに希釈する。この溶液をＳ_i3Ｎ₄-表面に適用し、５〜５０分 間室温でインキュベートする。より低い温度の場合、より長くインキュベートし なければならない。硝酸ケイ素表面に結合しない分子をトリエタノールアミン緩 衝液（ＴＥＡ）で洗浄して除去する。その後酵素（Bacillus Cereus から得られ たペニシリナーゼタイプ１、シグマＰ０３８９）をアミノ基不含緩衝液（たとえ ばＴＥＡ、特にＴＲＩＳ- 又はグリシン緩衝液ではない）中に溶解し（１０００ 〜５０００単位／ｍｌ）、架橋剤で予め処理された硝酸ケイ素表面上に付与する 。４〜６０℃の温度、特に室温で１〜２４０分（この場合１５分）のインキュベ ーション時間の後に、酵素分子と架橋剤のまだ遊離する官能基との結合を波長範 囲３２０〜３５０ｎｍの光線によって誘発するか固定化処理の終了後、表面硬化 性ペニシリンセンサーを０．１Ｍ ＴＲＩＳ- 緩衝液（ｐＨ７〜８）及び蒸留水 で洗浄し、少なくとも１０分間空気中で又はＮ₂-又は不活性ガス雰囲気下で乾燥 する。 この方法で製造された電界効果センサーを用いて、水溶液中でペニシリン濃度 測定を行う。 図１中に、測定装置を図解する。ケイ素基質１、単離層２（二酸化ケイ素と硝 酸ケイ素）、架橋剤層３及び酵素層（ペニシリン層）４から成る、本発明の製造 された電界効果センサーを測定セル中で統合する。測定セルを１０^-5〜１モル／ ｌ濃度のペニシリンＧを含有する測定水溶液で満たす。測定溶液６中に基準電極 （たとえばＡｇ／ＡｇＣｌ）７を浸す。電位を基準電極７とケイ素基質への接触 電極８を介して読み取る。 図２中に、１０^-4〜１０^-1モル／ｌペニシリン濃度でＣＯＮＣＡＰ（ＣＯＮ stant ＣＡＰacitance)-Modus に於て採用される特有の測定曲線を示す。ペニシ リンＧナトリウム塩（シグマＰ３０３２）を１０ｍＭトリス- ＨＣｌ緩衝液、ｐ Ｈ７中で溶解する。上昇するペニシリン濃度と共に、生成されるペニシロイン酸 の濃度及びそれと同時に水素イオンの濃度がｐＨ- 変換器として作用する硝酸ケ イ素表面のすぐ近くで増加する。これは界面の硝酸ケイ素／電解質での電位のプ ラス又はマイナス電位置への変化を生じる。時間に対するプロットにより酵素反 応の濃度に依存する電位推移を観察することができる。しるしが付けられた時間 に測定溶液の変換が行われる。 図３は図２から求められた化学推移グラフを示す。これは本発明に従って製造 された電界効果センサーの検定曲線である。電位差分析キモ- 又はバイオセンサ ーの鋭敏度に関する記載を、基準となるネルンストの関係に関してこの曲線の線 状域で、すなわちペニシリン濃度と適合する電位の間の対数による関係が生じる 範囲で行う。この範囲は、本発明に従って製造されたｐペニシリン２．３〜３． ３（０．５〜５ｍＭに相当）のセンサーにある。鋭敏度はデケードあたり５０ｍ Ｖである。 線状測定範囲の正確な位置及び絶対鋭敏度は緩衝液組成の選択、その濃度、す なわち緩衝液容量及びｐＨ- 値に著しく左右される。このパラメーターの適当な 選択によって、測定に必要な測定範囲を目的に従って調整することができる。た とえば線状測定範囲は、ＩＭＩＤＡＺＯＬ- 緩衝液（ｐＨ７）の使用で３〜２０ ｍＭペニシリンであり、ＨＥＰＥＳ- 緩衝液の場合ほぼ１〜１０ｍＭである。ｐ Ｈ- 値の増加は、検定曲線の線状範囲の位置をより高いペニシリン濃度へ移動さ せ、対応してｐＨ- 値の低下はより低いペニシリン濃度へ移動させる。 本発明により製造されたセンサーは、１４０日より長い高い貯蔵安定性を有す る。エイビン度はペニシリンデケードあたり５０ｍＶである。 結合範囲で同種の構造、たとえば本発明で記載した電気容量層構造を示す電界 効果トランジスターの製造は可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シェーニング・ミヒャエル・ヨーゼフ ドイツ連邦共和国、デー−52428 ユーリ ッヒ、デュッセルドルファー・ストラー セ、34 (72)発明者 フェッター・ヨアヒム ドイツ連邦共和国、デー−50678 ケルン、 ヨーゼフストラーセ、34−36 (72)発明者 カウプ・ウルリヒ・ベンジャミン ドイツ連邦共和国、デー−52062 アーヒ ェン、ザールストラーセ、86 (72)発明者 コルドス・ペーター ドイツ連邦共和国、デー−52428 ユーリ ッヒ、トリーレル・ストラーセ、４ (72)発明者 リュート・ハンス ドイツ連邦共和国、デー−52076 アーヒ ェン、オイペナー・ストラーセ、299 ベ ー

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 とするバイオセンサーであって、架橋剤を一方ではシグナル活性表面に特異的に 反応する基（Ａ）を有し、そして他方では光活性な生物材料- 反応性基（Ｂ）を 有するヘテロ二官能性架橋剤によって構成されていることを特徴とする、上記バ イオセンサー。 ２．架橋剤が架橋剤の基（Ａ）とシグナル活性表面の−ＯＨ、−ＳＨ又は−ＮＨ_x 基とのカップリング反応を介してシグナル活性表面に結合している、請求の範 囲１記載のバイオセンサー。 ３．架橋剤がシラン化された表面に又は反応性ＮＨ_x- 基を有するＳ_i3Ｎ₄-表面 に架橋剤の基（Ａ）のカップリング反応を介して結合している、請求の範囲２記 載のバイオセンサー。 ４．架橋剤が架橋剤のアジド- 又はニトロ- 基（Ｂ）の光活性化カップリング反 応を介して生物材料のたん白質に結合している、請求の範囲１ないし３のいずれ かに記載のバイオセンサー。 ５．芳香族的に結合するニトロ- 又はアジド- 基（Ｂ）との光活性化カップリン グ反応が行われる、請求の範囲４記載のバイオセンサー。 ６．カップリングがアシドフエニル基を有する架橋剤によって行われる、請求の 範囲５記載のバイオセンサー。 ７．架橋剤がアルデヒド-、エステル- 又はイミドエステル- 基（Ａ）のカップ リング反応によって表面に結合している、請求の範囲２記載のバイオセンサー。 ８．架橋剤がＮ- ヒドロキシ- スクシンイミドエステル- 基（Ａ）のカップリン グ反応によって表面に結合している、請求の範囲７記載のバイオセンサー。 ９．厚さ１０〜１０００ｎＭの、Ｓ_iＨ₄／ＮＨ₃-混合物からのＣＶＤによって表 面層を有する、シグナル活性表面を特徴とする、請求の範囲１ないし８のいずれ かに記載のバイオセンサー。